Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM e BR são apoiados pelo Center for Cellular Construction, um Centro Nacional de Ciência e Tecnologia (NSF), sob contrato de concessão DBI-1548297. A BR também é apoiada por meio de um prêmio NSF CAREER, 1553695.

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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" 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(2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo descrito aqui é altamente versátil e facilmente adaptável para o estudo de eventos biológicos em uma variedade de estágios no desenvolvimento embrionário de Drosophila. Este protocolo é adequado para estudar processos biológicos que ocorrem por longos períodos de tempo. Por exemplo, estudos de celularização29,30 ou a formação de domínios heterocromatinas em Drosophila31,32 poderiam se beneficiar da utilização dos métodos descritos neste protocolo, uma vez que esses processos ocorrem por um longo período de tempo. Além disso, o tamanho da amostra pode ser aumentado diminuindo a ampliação para estudar questões que requerem menos resolução óptica, como o tempo entre as divisões sincicial33 ou a duração da gastrulação34.  Da mesma forma, um objetivo de 20x permite que dois embriões sejam imagens dentro de um plano de imagem. Os métodos deste protocolo fornecem uma plataforma dinâmica para fazer perguntas biológicas usando o desenvolvimento embrionário como um sistema modelo para análise quantitativa.
Há 3 passos críticos neste protocolo. Pós-descorção em 50% de alvejante é imperativo que os embriões sejam enxaguados e secos vigorosamente 5 vezes (2,3,4). Esta etapa remove quaisquer restos de pequenos pedaços de chorão. O acorde restante obstruirá o campo de visão ao fotografar o embrião. Ao montar os embriões na tampa de vidro (3.5), é importante pressionar os embriões sobre a cola com pressão uniforme. Isso colocará os embriões no mesmo plano z. Ao cortar a agulha de microinjeção, é importante retrair o êmbolo imediatamente para ajustar a taxa de fluxo da agulha ou você perderá todo o seu injetor.
Nosso estudo foi limitado por dois fatores. O primeiro fator foi não ter um processo automatizado de segmentação. No entanto, projetamos um script de segmentação manual usando o MATLAB; com um marcador de fuso geneticamente codificado este processo poderia ser automatizado. No futuro, gostaríamos de produzir CNN-RFP21, Rtln1-GFP e CNN-RFP; Linhas transgênicas ReepB-GFP para permitir a segmentação automatizada do eixo. Para obter mais informações sobre nosso pipeline de script e análise MATLAB, consulte materiais suplementares de Diaz et al.15. Em segundo lugar, também fomos limitados pelo nosso intervalo de aquisição de 35 s, o que só nos permitiu imaginar 6 embriões simultaneamente. Um intervalo de aquisição mais longo nos permitiria imaginar mais embriões simultaneamente. Embora a produção de medicamentos possa ser aumentada substituindo a microinjeção por uma etapa de permeação, achamos que isso é desnecessário, uma vez que nosso tamanho amostral já estava limitado pelo intervalo de aquisição.
Embora este protocolo tenha sido usado para a imagem do desenvolvimento embrionário de Drosophila, a abordagem global é adaptável para estudar o desenvolvimento embrionário em outros sistemas de modelos multicelulares, como C. elegans,Ouriços do Mar e Xenopus. Os embriões são extremamente úteis para a análise quantitativa, uma vez que são facilmente sincronizados através da coleta ou fertilização. Além disso, os embriões não se movem ou nadam para longe de um campo de visão, permitindo o uso de um simples software capaz de aquisição de vários pontos para produzir múltiplos vídeos de lapso de tempo para análise quantitativa. Embora tenhamos usado um analisador de alto teor em nosso estudo, qualquer sistema de microscópio invertido capaz de aquisição de vários pontos pode ser emparelhado com os métodos aqui referidos.
Resultados semelhantes podem ser obtidos por meio de um microscópio confocífilo invertido de aquisição multiponto; no entanto, as vantagens de um analisador de alto teor emergem à medida que se aumenta o tamanho da amostra para estudar questões que requerem menos resolução no tempo. Uma vantagem óbvia para usar um analisador de alto conteúdo é a capacidade de imagem de 4 slides separados simultaneamente em comparação com 1 slide em sistemas tradicionais. Com um conjunto completo de 4 slides e 40 embriões em cada slide, 160 embriões podem ser imagens ao longo de várias horas, desde que o intervalo de aquisição seja de pelo menos 15 minutos entre os quadros. Outra vantagem importante para o uso de um analisador de alto teor é que as amostras são completamente seladas de quaisquer fontes de luz externas, o que é necessário para medições baseadas em intensidade de fluorescência. Por fim, o analisador de alto teor usado em nosso estudo tem uma câmera CMOS de 5,5 megapixels que fornece um generoso campo de visão de 221,87 μm na ampliação de 60x. Esse campo de visão maior nos permitiu imaginar metade de um embrião por ponto de aquisição.

Nos últimos 30 anos, os avanços em tecnologias de imagem e sondas moleculares para imagens de células vivas avançaram nossa compreensão da complexidade e do funcionamento interno da célula. Acompanhar esse avanço na tecnologia é uma maior dependência do uso de modelos de cultura celular ex vivo para a aquisição de dados de imagem de alto rendimento. Os modelos de cultura celular oferecem diversas vantagens, incluindo o controle do microambiente através de sistemas microfluidos, e a capacidade de imagem múltiplas células simultaneamente, permitindo o uso de abordagens quantitativas necessárias para a triagem de alto rendimento1,2. No entanto, há também desvantagens significativas associadas aos modelos de cultura celular no contexto de estudos morfológicos, como vidro bidimensional ou superfícies plásticas produzindo efeitos confusos sobre a morfologia celular e sua regulação3,4,5. Esses efeitos podem fornecer dados falsos ou enganosos no que diz respeito ao estudo de processos biológicos que regulam a morfologia celular.
Embora a alternativa tenha sido estudar a morfologia celular no contexto de um organismo intacto6,poucos organismos intactos adequados facilitam imagens de células vivas quantitativas de alto rendimento devido a dificuldades em manter organismos inteiros vivos através da imagem, e desafios associados à imagem dentro de um grande organismo multicelular. Como resultado, estudos biológicos de células em organismos intactos geralmente se concentraram em observar um único organismo ao longo do tempo, o que limita muito o tamanho da amostra. Além disso, essa limitação de um animal por vez torna a imagem ao vivo difícil e cara de empregar na forma de uma tela e restringe a capacidade de aplicar ferramentas analíticas quantitativas, uma vez que o número de amostras é geralmente muito pequeno. Assim, surge a necessidade de um organismo modelo multicelular que possa ser usado para abordagens quantitativas baseadas em alto conteúdo.
Este protocolo adapta o embrião Drosophila para imagens de alto conteúdo baseadas em placas para gerar tamanhos experimentais de amostra grande o suficiente para análise quantitativa. Drosophila melanogaster é comumente conhecido como o primeiro organismo modelo. Pesquisas utilizando Drosophila levaram a avanços na biologia celular e molecular, incluindo a transmissão de informações genéticas, identificação de vias de sinalização celular e requisitos genéticos de desenvolvimento embrionário7,8,9. Além disso, o embrião Drosophila tem sido usado para explorar a dinâmica in vivo de microtúbulos durante a divisão celular10,11,12. O uso de microinjeção para fornecer pequenas moléculas e sondas moleculares fornece controle temporal que torna o desenvolvimento embrionário de Drosophila particularmente poderoso para sondar processos celulares in vivo13,14. No entanto, gerar um número significativo de repetições experimentais com uma abordagem de imagem tradicional é extremamente trabalhoso e tem uso limitado em telas de imagem de alto rendimento e análise quantitativa. Nossa abordagem faz uso de um analisador de alto teor tipicamente reservado para análise de células únicas e adapta a análise de imagem in vivo no sincronia do início de Drosophila embryo.
Este protocolo foi utilizado para coletar, encenar e microinjetar embriões de Drosophila para explorar os mecanismos que impulsionam alterações morfológicas no Istúlumo Endoplasmático (ER) durante a mitose15. Embora muitos estudos tenham delineado a natureza dinâmica do ER durante o ciclo celular16,17,18,19, tem sido difícil comparar os efeitos de múltiplas perturbações ao longo do tempo na morfologia er. Para identificar os componentes que impulsionam mudanças na morfologia do ER entre a divisão celular, os métodos listados neste protocolo foram usados para sondar o papel de microtúbulos e outros fatores citoesqueléticos na reorganização do ER mitótico usando a divisão síntial cortical no embrião Drosophila primitivo. Em conjunto, a disponibilidade de perturbação genética dentro da comunidade de Drosophila, a capacidade de microinjetar drogas e sondas moleculares em momentos precisos durante o desenvolvimento, e o custo barato de trabalhar com Drosophila torna essa abordagem altamente favorável à triagem baseada em imagens de alto rendimento. Os métodos descritos aqui são aplicáveis para estudar uma ampla variedade de processos celulares e de desenvolvimento in vivo utilizando o embrião Drosophila 20. Especificamente, este protocolo é bem adaptado para estudar eventos biológicos que ocorrem por um longo período e dentro de 100 mícrons do córtex de embrião Drosophila.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Abordagens modernas em imagens quantitativas de células vivas tornaram-se uma ferramenta essencial para explorar a biologia celular, permitindo o uso de estatísticas e modelagem computacional para classificar e comparar processos biológicos. Embora os sistemas de modelos de cultura celular sejam ótimos para imagens de alto conteúdo, estudos de alto rendimento da morfologia celular sugerem que culturas ex vivo são limitadas na recapitulação da complexidade morfológica encontrada nas células dentro de organismos vivos. Como tal, há a necessidade de um sistema de modelo de alto rendimento escalável para imagem de células vivas dentro de um organismo intacto. Descrito aqui é um protocolo para usar um analisador de imagem de alto conteúdo para adquirir simultaneamente vários vídeos de lapso de tempo do desenvolvimento embrionário de melanogaster Drosophila durante o estágio de blastoderm sinintital. O blastoderm sinintário tem servido tradicionalmente como um grande modelo in vivo para eventos biológicos de imagem; no entanto, a obtenção de um número significativo de réplicas experimentais para abordagens quantitativas e de alto rendimento tem sido trabalhosa intensiva e limitada pela imagem de um único embrião por repetição experimental. Apresentado aqui é um método para adaptar abordagens de imagem e microinjeção para se adequar a um sistema de imagem de alto conteúdo, ou qualquer microscópio invertido capaz de aquisição automatizada de vários pontos. Essa abordagem permite a aquisição simultânea de embriões de 6 a 12, dependendo dos fatores de aquisição desejados, dentro de uma única sessão de imagem.

A abordagem apresentada neste protocolo foi utilizada para examinar o papel dos microtúbulos na reorganização do Ritúlume Endoplasmico (ER) durante a mitose no embrião Drosophila 15. Durante a mitose, a estrutura do ER exibe uma reorganização dramática, no entanto, as forças que conduzem essas mudanças são mal compreendidas. Recentemente, uma família de proteínas de formação de ER mostrou-se para promover a formação do túbuloER 25,26,27,28, que são conhecidos por sua proximidade com microtúbulos28. Para estudar o rolo de microtúbulos sobre a morfologia do ER, os métodos fornecidos no protocolo foram utilizados para gerar dados para comparar quantitativamente os efeitos de vários tratamentos medicamentosos microinjetados na reorganização do ER durante a mitose. A colchicina, que previne a nova polimerização de microtúbulos, foi encontrada para reduzir drasticamente a reorganização do ER durante a mitose, como mostrado nas Figuras 5 e Figura 6. Além disso, a abordagem aqui descrita possibilitou a produção de dados de imagem de voltas de tempo para 32 embriões. Medições médias e de intensidade máxima foram produzidas a partir de 12.800 regiões de interesse usando um script MATLAB personalizado, o que também gerou estatísticas descritivas e inferenciais vitais para fazer comparações entre tratamentos medicamentosos. Devido à disponibilidade de sondas moleculares e à facilidade das microinjeções, os métodos descritos aqui são facilmente adaptáveis para estudar uma variedade de processos biológicos através da quantificação da intensidade da fluorescência.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figura 5: Imagens representativas do enriquecimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP nos polos de fuso durante a mitose. (A) campo de visão de 60x de ReepB-GFP durante a mitose no ciclo celular 10. O quadrado azul representa o campo de visão usado para painéis B-E. O painel A é processado com um filtro binário limiar. Este filtro não foi aplicado aos painéis B-E, pois exclui dados de pixels abaixo do limite definido. (B,D) ReepB-GFP no controle, e em colchicina. (C,E) RTNL1-GFP no controle, e em colchicina. Este número foi modificado a partir de Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figura 6: Quantitação do enriquecimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP nos polos de fuso durante a mitose. Foram analisados 20 fusos e 20 ROIs de citoplasma em 10 quadros para 32 embriões nas seguintes condições. (A) Injeções de controle de 10% DMSO para os embriões de controle Rtnl1-GFP. mostraram um aumento de 0,1 vezes no enriquecimento (p<0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com amostras não injetadas (p < 0,001 para todas as amostras em T210). (B) Embriões ReepB-GFP injetados com DMSO de 10% para servir de controle. Os embriões de controle apresentaram um aumento de 0,1 vezes no enriquecimento (p<0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com amostras não injetadas(Figura 1E; p < 0,001 para todas as amostras em T210). (C) Embriões rtnl1-GFP injetados com 5 μM colchicine. Aqui medimos uma redução no enriquecimento Rtnl1-GFP para fusos (p < 0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com controles (A) (p < 0,001 para todas as amostras em T210). (D) Embriões ReepB-GFP injetados com 5 μM colchicine. Medimos uma redução no enriquecimento ReepB-GFP para eixos (p<0,001 para todas as amostras em T210) em comparação com controles (B) (p<0,001 para todas as amostras em T210). Este número foi modificado a partir de Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Pasta de Levedura21</td>
			<td>2. Placas de Uva21</td>
			<td>3. Cola heptana24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Adicione 7 gramas de levedura seca ativa a um cônico de 50 ml. Adicione 9 mililitros de água DI e misture até mesmo a constância com uma espátula metálica.</td>
			<td>2.1 Faça solução a: Adicione 6 gramas de ágar a 140ml de água DI em um frasco de 250ml e autoclave-o.</td>
			<td>3.1 Encha um frasco de cintilação de vidro com 50 polegadas de fita dupla face.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Adicione 7 gramas de levedura seca ativa a um cônico de 50 ml. Adicione 9 mililitros de água DI e misture até mesmo a constância com uma espátula metálica.</td>
			<td>2.2 Faça a solução b: Misture 0,1 gramas de parabeno de metila em 2ml de etanol, em seguida, adicione esta solução a 60ml de concentrado de suco de toranja.</td>
			<td>3.2 Adicione 20 ml de heptano e frasco de cintilação de vidro de vedação com parafilm. Gire durante a noite em temperatura ambiente.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Imediatamente após a solução de autoclaving a, misture a solução b e despeje a mistura em pratos perti de 10 x 35mm. (faz 35 pratos de uva)</td>
			<td>3.3 Remova os detritos de fita plástica transferindo cola para tubos cônicos de 2 15 ml e centrifugando a 3000 RPM por 15 minutos.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Deixe as placas de uva fixar em temperatura ambiente durante a noite com tampas de placa desligadas. Cubra as placas com tampas e armazene em 4C° depois de definidas.</td>
			<td>3.4 Transfira a cola sobrenatante em tubos de microcentrifuuge de 1,5 ml para armazenamento.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Receitas de mídia e soluções.

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Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Este protocolo permite uma aquisição simultânea de múltiplos embriões dentro de uma sessão de imagem. Enquanto a preparação da amostra é adaptada para aquisição de vários pontos usando um analisador de alto teor, as amostras preparadas usando este protocolo podem ser imagens em qualquer microscópio invertido capaz de aquisição de vários pontos. Para começar, organize duas fileiras de 15 a 20 embriões em uma seção limpa de grande prato usando uma ferramenta de colhedor de ovos.Alinhe os embriões em seu lado ventral na mesma orientação em relação às extremidades anterior e posterior. Adere a um espaçador em uma mancha de cobertura e estria 10 microliters de cola heptane pelo inset de vidro de deslizamento de tampa exposto. Enquanto a cola seca, use uma lâmina de barbear para cortar um retângulo ao redor das duas fileiras de embriões.Corte um segundo retângulo ao lado do primeiro e remova o segundo retângulo com um lado de borda reta de uma espátula de aço inoxidável. Deslize cuidadosamente a borda reta da espátula sob o primeiro retângulo e remova-a cuidadosamente. Em seguida, coloque o recorte com embriões no lado externo de um prato de 3,5 centímetros.Sob um microscópio estéreo, abaixe uma mancha de cobertura preparada sobre os embriões e pressione suavemente as duas fileiras de embriões sobre a cola. Se não estiver realizando microinjeção, preencha o espaçador de silicone a meio caminho do topo com óleo de halocarboneto de um para um 700 a óleo de halocarboneto 27. Fore as bordas inferiores de um adaptador de placa de quatro slides com fita dupla face.Isso evitará que o slide se mova durante a imagem. Certifique-se de não colocar a fita no caminho da lente objetiva. Monte a tampa no adaptador de placa de quatro slides.Se microinjetar os embriões, coloque o deslizamento com embriões sobre um slide para evitar que o fundo da tampa fique sujo durante a dessecação e microinjeção. Dessobsculir os embriões por cinco a 10 minutos, depois cubra-os imediatamente com óleo de halocarbono de um para um 700 a óleo de halocarboneto 27, enchendo o espaçador de silicone a meio caminho do topo. Carregue duas ou três agulhas de microinjeção com aproximadamente dois microliters de injetor usando uma ponta de carregamento estendida.Coloque uma agulha no microinjetor e deprima o êmbolo no meio da ponta, aumentando a pressão de ar dentro do capilar de vidro. Abaixe a agulha de vidro em uma lâmina de vidro e corte a ponta da agulha com uma nova lâmina número nove, cortando em um ângulo de 45 graus para produzir uma ponta aberta afiada. O injetor deve fluir até o fundo da ponta sem fluir para fora da agulha.Adicione cuidadosamente 20 microliters de óleo de halocarboneto sobre a ponta da agulha e corte-o lentamente em um ângulo de 45 graus. O injetor deve começar a fluir rapidamente, então lembre-se de ajustar a pressão retraindo o êmbolo. Use o micromanipulador para posicionar a agulha no centro do campo de visão.Em seguida, levante a agulha e remova o deslizamento de vidro debaixo dela. Coloque os embriões no estágio do microscópio estéreo, sob a agulha de microinjeção e concentre-se neles em 50 vezes a ampliação. Abaixe a agulha até que ela entre no mesmo plano de foco que os embriões.Movendo o slide com uma mão e operando o microinjetor com a outra, injete uma linha de embriões. Levante a agulha e gire o slide 180 graus para expor a segunda fileira de embriões à agulha de microinjeção. Abaixe a agulha e injete a segunda fileira de embriões.Este protocolo foi utilizado para examinar o papel dos microtúbulos na reorganização do ritúlume endoplasmático durante a mitose no embrião de Drosophila. Os efeitos de vários tratamentos medicamentosos microinjetados na reorganização do ER foram quantitativamente comparados. A colchicina, que previne a nova polimerização de microtúbulos, foi encontrada para reduzir drasticamente a localização do ER para polos de fuso durante a mitose.Dados de imagem de lapso de tempo foram adquiridos para 32 embriões. Medições médias e de intensidade máxima foram analisadas a partir de 12.800 regiões de interesse usando um script MATLAB personalizado. Ao tentar este protocolo pela primeira vez, lembre-se de não demorar muito em nenhum passo, caso contrário, você corre o risco de perder o estágio de desenvolvimento que você quer imaginar.Pratique este protocolo passo a passo antes de tentar qualquer experimento. Nosso método de preparação amostral facilita a aquisição simultânea de múltiplos embriões durante um experimento, gerando assim réplicas experimentais suficientes para análise quantitativa. Este protocolo pode ajudar a transição de embriologia do desenvolvimento de experimentos qualitativos para quantitativos de imagem.A capacidade de imagem de múltiplos embriões dentro de uma sessão de imagem também elimina o ruído experimental entre as réplicas.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

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Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Biologia do Desenvolvimento

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

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Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...