Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM и BR поддерживаются Центром клеточного строительства, Национальным научным фондом (NSF) Научно-технический центр, в соответствии с грантовое соглашение DBI-1548297. BR также поддерживается через NSF CAREER награду, 1553695.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Описанный здесь протокол является весьма универсальным и легко адаптируемым для изучения биологических событий на различных стадиях эмбрионального развития Дрозофилы. Этот протокол хорошо подходит для изучения биологических процессов, которые происходят в течение длительных периодов времени. Например, исследования клетчатой29,30 или формирование гетерохроматина доменов в Drosophila31,32может извлечь выгоду из использованияметодов,описанных в этом протоколе, поскольку эти процессы происходят в течение длительного периода времени. Кроме того, размер выборки может быть увеличен за счет уменьшения увеличения для изучения вопросов, которые требуют меньше оптического разрешения, таких как время между синцитиальнымиподразделениями 33 или продолжительностьгастрипуляции 34.  Аналогичным образом, цель 20x позволяет двум эмбрионам быть изображены в одной плоскости изображения. Методы, используемые в этом протоколе, обеспечивают динамичную платформу для задавать биологические вопросы, используя эмбриональное развитие в качестве образцовой системы количественного анализа.
В этом протоколе есть три важных шага. После декорионации в 50% отбеливатель крайне важно, чтобы эмбрионы промыть и высушить энергично 5 раз (2.3.4). Этот шаг удаляет оставшиеся мелкие кусочки хориона. Оставшийся хорион будет препятствовать поле зрения при визуализации эмбриона. При монтаже эмбрионов на стеклянную крышку (3,5) важно прижимать эмбрионы к клею с равномерного давления. Это поместит эмбрионы на той же плоскости z. При резке открыть микроинъекции иглы, важно, чтобы втягивать поршень немедленно регулировать скорость потока иглы или вы потеряете все ваши инъекционные.
Наше исследование было ограничено двумя факторами. Первым фактором было не наличие автоматизированного процесса сегментации. Однако мы разработали сценарий ручной сегментации с помощью MATLAB; с генетически закодированным маркером шпинделя этот процесс может быть автоматизирован. В будущем мы хотели бы производить CNN-RFP21, Rtln1-GFP и CNN-RFP; Трансгенные линии ReepB-GFP для автоматической сегментации шпинделя. Для получения дополнительной информации о нашем скрипте и анализе трубопровода MATLAB, обратитесь к дополнительным материалам Diaz et al.15. Во-вторых, мы также были ограничены нашим интервалом приобретения 35 с, что позволило нам только изображение 6 эмбрионов одновременно. Более длительный интервал приобретения позволит нам изображение больше эмбрионов одновременно. Хотя пропускная способность доставки лекарств может быть увеличена за счет замены микроинъекции шагом пронизывания, мы обнаружили, что это было ненужным, так как наш размер выборки уже был ограничен интервалом приобретения.
В то время как этот протокол был использован для изображения эмбрионального развития Drosophila, общий подход адаптируется для изучения эмбрионального развития в других многоклеточных модельных системах, таких как C. elegans,Sea Urchins и Xenopus. Эмбрионы чрезвычайно полезны для количественного анализа, так как они легко синхронизируются путем сбора или оплодотворения. Кроме того, эмбрионы не двигаются и не уплывает из поля зрения, что позволяет использовать простое многоапунктное программное обеспечение, способное создавать видео замедленного действия для количественного анализа. Хотя мы использовали анализатор высокого содержания в нашем исследовании, любая перевернутая микроскоповая система, способная к многотойной приобретению, может быть в паре с методами, упомянутыми в настоящем.
Аналогичные результаты можно получить с помощью многоточенного приобретения, способного перевернутого конфокального микроскопа; однако преимущества анализатора высокого содержания возникают по мере увеличения размера выборки для изучения вопросов, требующих меньшего разрешения во времени. Очевидным преимуществом использования анализатора высокого содержания является возможность изображения 4 отдельных слайдов одновременно по сравнению с 1 слайдом на традиционных системах. С полным набором из 4 слайдов и 40 эмбрионов на каждом слайде, 160 эмбрионов могут быть изображены в течение нескольких часов, до тех пор, как интервал приобретения, по крайней мере 15 мин между кадрами. Другим важным преимуществом использования анализатора высокого содержания является то, что образцы полностью закрыты от любых внешних источников света, что необходимо для измерений на основе интенсивности флуоресценции. Наконец, анализатор высокого содержания, используемый в нашем исследовании, имеет 5,5-мегапиксельную камеру CMOS, которая обеспечивает щедрое поле зрения 221,87 мкм при увеличении в 60 раз. Это большее поле зрения позволило нам изображение половины эмбриона на приобретение точки.

За последние 30 лет достижения в области технологий визуализации и молекулярных зондов для визуализации живых клеток продвинули наше понимание сложности и внутренней работы клетки. Сопровождающим этот прогресс в технологии является большая зависимость от использования моделей культуры ex vivo для получения данных с высокой пропускной способностью изображений. Модели клеточной культуры обеспечивают ряд преимуществ, в том числе контроль микроокноронности через микрофлюидные системы, а также способность изображения нескольких клеток одновременно, что позволяет использовать количественные подходы, необходимые для высокой пропускнойспособности скрининга 1,2. Однако, Есть также значительные недостатки, связанные с моделями клеточной культуры в контексте морфологических исследований, таких как двумерные стеклянные или пластиковые поверхности, производящие смешанные эффекты наморфологию клеток и ее регулирование 3,4,5. Эти эффекты могут предоставить ложные или вводящие в заблуждение данные в отношении изучения биологических процессов, регулирующих клеточную морфологию.
Хотя альтернативой было изучение клеточной морфологии в контексте нетронутогоорганизма 6, несколько подходящих нетронутых организмовспособствуют высокой пропускной способности количественной визуализации живых клеток из-за трудностей в поддержании жизни целых организмов через вне изображения, и проблемы, связанные с изображением внутри большого многоклеточного организма. В результате, биологические исследования клеток в нетронутых организмах, как правило, сосредоточены на наблюдении одного организма с течением времени, что значительно ограничивает размер выборки. Кроме того, это ограничение на использование изображений в реальном времени затрудняет и обходится дорого в виде экрана и ограничивает возможность применения количественных аналитических инструментов, поскольку количество образцов, как правило, слишком мало. Таким образом, возникает необходимость в многоклеточной модели организма, который может быть использован для высококонтентных количественных подходов.
Этот протокол адаптирует эмбрион Drosophila для изображений с высоким содержанием пластин для создания экспериментальных размеров образцов, достаточно больших для количественного анализа. Drosophila меланогастер широко известен как первая модель организма. Исследования с использованием дрозофилы привели к прорывам в клеточной и молекулярной биологии, включая передачу генетической информации, идентификацию путей сигнализации клеток, а такжегенетические требования эмбрионального развития 7,8,9. Кроме того, эмбрион дрозофилы был использован для изучения динамики микротрубочек in vivo вовремя клеточного деления 10,11,12. Использование микроинъекции для доставки малых молекул и молекулярных зондов обеспечивает временный контроль, что делает эмбриональное развитие Дрозофилы особенно мощным для зондирования клеточных процессов in vivo13,14. Тем не менее, создание значительного числа экспериментальных повторов с традиционным подходом к визуализации является чрезвычайно трудоемким и имеет ограниченное использование в высокой пропускной способности экранов изображений и количественного анализа. Наш подход использует анализатор высокого содержания, обычно зарезервированный для анализа одной клетки, и адаптирует анализ изображений in vivo в синцитиуме раннего Drosophila embryo.
Этот протокол был использован для сбора, стадии, и микроинъект drosophila эмбрионов для изучения механизмов, которые управляют морфологических изменений в эндоплазмической reticulum (ER) во времямитоза 15. Хотя многие исследования изложили динамический характер ER во время клеточногоцикла 16,17,18,19, было трудно сравнить последствия многочисленных возмущений во времени на ER морфологии. Для определения компонентов, которые управляют изменениями в морфологии ER через деление клеток, методы, перечисленные в этом протоколе, были использованы для зондирования роли микротрубочек и других цитоскелетных факторов на митотической реорганизации ER с использованием коркового синцитиального деления в раннем эмбрионе дрозофилы. В совокупности наличие генетических возмущений в сообществе дрозофилы, способность к микроинъекции наркотиков и молекулярных зондов в точное время во время разработки, а также недорогая стоимость работы с Drosophila делает этот подход весьма приемлемым для высокой пропускной способности изображения на основе скрининга. Описанные здесь методы применимы для изучения широкого спектра клеточных и процессов развития in vivo с использованием эмбриона Дрозофилы 20. В частности, этот протокол хорошо приспособлен для изучения биологических событий, которые происходят в течение длительного периода и в пределах 100 микрон коры эмбриона Дрозофилы.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Современные подходы в количественной визуализации живых клеток стали важным инструментом для изучения клеточной биологии, позволяя использовать статистику и вычислительное моделирование для классификации и сравнения биологических процессов. Хотя системы модели клеточной культуры отлично подходят для визуализации высокого содержания, высокопрочные исследования клеточной морфологии показывают, что культуры ex vivo ограничены в повторном воспроизведении морфологической сложности, найденной в клетках в живых организмах. Таким образом, существует необходимость в масштабируемой высокой пропускной способности модели системы для изображения живых клеток в нетронутом организме. Описано здесь протокол для использования анализа изображений с высоким содержанием одновременно приобрести несколько замедленного видео эмбрионального развития Drosophila melanogaster во время синцитиальной стадии бластодерма. Синцитиальный бластодерм традиционно служил отличной моделью in vivo для визуализации биологических событий; однако получение значительного числа экспериментальных репликаций для количественных и высокоопутных подходов было трудоемким и ограничивалось визуализацией одного эмбриона на экспериментальное повторение. Здесь представлен метод адаптации подходов к визуализации и микроинъекции в соответствии с системой визуализации высокого содержания или любым перевернутым микроскопом, способным к автоматическому приобретению многоточек. Такой подход позволяет одновременно приобретение 6-12 эмбрионов, в зависимости от желаемых факторов приобретения, в течение одного сеанса визуализации.

Подход, представленный в этом протоколе, был использован для изучения роли микротрубочек в эндоплазмической ретикулуме (ER) реорганизации во время митоза в эмбрионе Дрозофилы 15. Во время митоза, структура ER показывает драматическую реорганизацию, однако, силы, которые управляют этими изменениями плохо понимаются. Недавно было показано, что семейство белков ER, формирующих белки, способствует образованию трубочек ER25,26,27,28,которые известны своей близостью с микротрубочками28. Для изучения рулона микротрубочек по морфологии ER, методы, представленные в протоколе, были использованы для генерации данных для количественного сравнения влияния нескольких микроинъекций медикаментозного лечения на реорганизацию ER во время митоза. Колхицин, который предотвращает новую полимеризацию микротрубочек, было установлено, резко уменьшить реорганизацию ER во время митоза, как показано на рисунке 5 и рисунок 6. Кроме того, описанный здесь подход позволил изготовить данные визуализации кругов времени для 32 эмбрионов. Измерения среднего и максимальной интенсивности были произведены из 12 800 регионов, представляющих интерес, с использованием пользовательского сценария MATLAB, который также генерировал описательную и выводную статистику, жизненно важную для сопоставления лекарственных препаратов. Благодаря наличию молекулярных зондов и простоте микроинъекций описанные здесь методы легко адаптируются для изучения различных биологических процессов с помощью количественной оценки интенсивности флуоресценции.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные изображения Rtnl1-GFP и обогащения ReepB-GFP на шпиндельных полюсах во время митоза. (A) 60x поле зрения ReepB-GFP во время митоза в клеточном цикле 10. Синий квадрат представляет поле зрения, используемое для панелей B-E. Панель А обрабатывается пороговым бинарным фильтром. Этот фильтр не был применен к панелям B-E, поскольку он исключает данные из пикселей ниже установленного порога. (B,D) ReepB-GFP под контролем, и в колхицине. (C,E) Rtnl1-GFP под контролем, и в колхицине. Эта цифра была изменена с Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Рисунок 6: Количественная оценка обогащения Rtnl1-GFP и ReepB-GFP на шпиндельных полюсах во время митоза. 20 шпинделей и 20 цитоплазмы ROIs через 10 кадров были проанализированы для 32 эмбрионов в следующих условиях. (A) 10% DMSO контрольные инъекции для Rtnl1-GFP. Контроль эмбрионов показали 0,1-кратное увеличение обогащения (p'lt;0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с неинжесированы образцов (p lt; 0.001 для всех образцов на T210). (B) ReepB-GFP эмбрионов вводили с 10% DMSO в качестве контроля. Контрольные эмбрионы показали 0,1-кратное увеличение обогащения (p'lt;0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с не введенными образцами(рисунок 1E; p lt; 0.001 для всех образцов на T210). (C)Эмбрионы Rtnl1-GFP, вводимые с 5 КМ Колхицином. Здесь мы измерили уменьшение обогащения Rtnl1-GFP до шпинделей (p lt; 0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с контрольами (A) (p lt; 0.001 для всех образцов на T210). (D)ReepB-GFP эмбрионов вводили с 5 МКМ Колхицин. Мы измерили снижение обогащения ReepB-GFP до шпинделей (p'lt;0.001 для всех образцов на T210) по сравнению с контрольами (B) (p'lt;0.001 для всех образцов на T210). Эта цифра была изменена с Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Дрожжевая паста21</td>
			<td>2. Виноградные тарелки21</td>
			<td>3. Гептановыйклей 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Добавить 7 граммов активных сухих дрожжей в 50 мл конического. Добавьте 9 миллилитров воды DI и смешайте даже постоянства с металлическим шпателем.</td>
			<td>2.1 Сделать решение: Добавить 6 граммов агара до 140 мл воды DI в 250 мл колбы и автоклав его.</td>
			<td>3.1 Заполните стеклянный сцинтилляционный флакон с 50 дюймами двухсторонней ленты.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Добавить 7 граммов активных сухих дрожжей в 50 мл конического. Добавьте 9 миллилитров воды DI и смешайте даже постоянства с металлическим шпателем.</td>
			<td>2.2 Сделать раствор b: Смешайте 0,1 грамма метилового парабена в 2 мл этанола, затем добавьте этот раствор в 60 мл концентрата грейпфрутового сока.</td>
			<td>3.2 Добавьте 20 мл гептана и уплотнительного стеклянного сцинтилляционного флакона с парафильмом. Поверните на ночь при комнатной температуре.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Сразу после автоклавного раствора a, смешайте в растворе b и вылейте смесь в 10 x 35mm perti блюда. (делает 35 виноградных тарелок)</td>
			<td>3.3 Удалите пластиковый ленточный мусор, переведя клей в 2 15 мл конических трубок и центрифугирование при 3000 об/мин в течение 15 минут.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Разрешить виноградные тарелки установить при комнатной температуре на ночь с крышками пластины. Обложка пластины с крышками и хранить в 4C "после того, как они устанавливают.</td>
			<td>3.4 Передача клея супернатанта в 1,5 мл микроцентрифуг трубки для хранения.</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Рецепты средств массовой информации и решений.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Здесь представлен протокол микроинъекционного и одновременного изображения нескольких эмбрионов дрозофилы во время эмбрионального развития с использованием изображения на основе пластин с высоким содержанием.

Дрозофила Эмбрион Подготовка и микроинъекция для live Cell Микроскопия Выполняется с помощью автоматизированного анализа высокого содержания

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Этот протокол позволяет одновременно приобретение нескольких эмбрионов в течение одного сеанса визуализации. В то время как подготовка образца адаптирована для многоточных приобретений с помощью анализатора высокого содержания, образцы, подготовленные с помощью этого протокола, могут быть изображены на любом перевернутом микроскопе, способном к многотой сделке. Для начала организуйте два ряда от 15 до 20 эмбрионов на чистом участке большой тарелки с помощью инструмента сборщика яйцеклеток.Выравнивание эмбрионов на их брюшной стороне в той же ориентации по отношению к передним и задним концам. Придерживайтесь спейсера на крышку и полоса 10 микролитров гептана клей вниз подвергаются крышки стекла вставки. Пока клей высыхает, используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать прямоугольник вокруг двух рядов эмбрионов.Вырежьте второй прямоугольник рядом с первым и удалите второй прямоугольник с прямой стороны края шпателя из нержавеющей стали. Аккуратно сдвиньте прямой край шпателя под первый прямоугольник и удалите его. Затем поместите вырез с эмбрионами на внешней стороне 3,5 сантиметра блюдо.Под стерео микроскопом опустите подготовленный чехлы над эмбрионами и аккуратно прижимите два ряда эмбрионов к клею. Если не выполняет микроинъекции, заполнить силиконовый спейсер на полпути к вершине с один-к-одному галоуглеродного масла 700 до галоуглеродного масла 27. Линия нижних краев четырехскользячой пластины адаптер с двусторонним лентой.Это предотвратит перемещение слайда во время визуализации. Убедитесь, что не по месту ленты на пути объективного объектива. Намонтировать крышку на адаптере из четырех слайдов.Если микроинъекции эмбрионов, поместите крышку с эмбрионами на слайд, чтобы предотвратить дно крышки от пачкаться во время высыхания и микроинъекции. Высасывайте эмбрионы в течение пяти-десяти минут, затем немедленно накройте их одним к одному галоуглеродного масла 700 до галоуглеродного масла 27, заполняя силиконовый спейсер на полпути к вершине. Загрузите две или три микроинъекции иглы с примерно двумя микролитров инъекционных с помощью расширенной нагрузки наконечник.Наведать иглу на микроинжектор и угнетать поршень на полпути к кончику, увеличивая давление воздуха внутри стеклянной капиллярной. Опустите стеклянную иглу на стеклянную горку и вырежьте кончик иглы новой бритвой номер девять, разрезая под углом 45 градусов для получения резкого открытого наконечника. Инжектор должен стекать вниз к нижней части кончика, не вытекая из иглы.Аккуратно добавьте 20 микролитров галоуглеродного масла над кончиком иглы и перережьте его, открыв его под углом 45 градусов. Инъекционные должны начать течь быстро, так что не забудьте настроить давление, убирая поршень. Используйте микроманипулятор, чтобы распоставить иглу в центре поля зрения.Затем поднимите иглу и удалите стеклянную горку из-под нее. Поместите эмбрионы на стадии стерео микроскопа, под микроинъекционные иглы и сосредоточиться на них в 50 раз больше. Опустите иглу, пока она не попадает в ту же плоскость фокусировки, что и эмбрионы.Перемещая слайд одной рукой и оперив микроинжектором с другой, вводите один ряд эмбрионов. Поднимите иглу и поверните слайд на 180 градусов, чтобы подвергнуть второй ряд эмбрионов микроинъекции иглы. Опустите иглу и ввись второй ряд эмбрионов.Этот протокол был использован для изучения роли микротрубочек в эндоплазмической реорганизации ретикулум во время митоза в эмбрионе Дрозофилы. Влияние нескольких микроинъектных лекарственных препаратов на реорганизацию ER было количественно сопоставлено. Колхицин, который предотвращает новую полимеризацию микротрубочек, был найден, чтобы резко уменьшить локализацию ER шпиндель полюсов во время митоза.Данные визуализации промежуток времени были получены для 32 эмбрионов. Измерения среднего и максимальной интенсивности были проанализированы из 12 800 областей интересов с помощью пользовательского сценария MATLAB. При попытке этого протокола в первый раз, не забудьте не занять слишком много времени на какой-либо один шаг, в противном случае вы рискуете пропустить этап развития, что вы хотите, чтобы изображение.Практика этого протокола шаг за шагом, прежде чем пытаться каких-либо экспериментов. Наш метод подготовки образцов облегчает одновременное приобретение нескольких эмбрионов в ходе одного эксперимента, создавая тем самым достаточно экспериментальных репликаций для количественного анализа. Этот протокол может помочь развитию эмбриологии перехода от качественных к количественным экспериментам визуализации.Возможность изображения нескольких эмбрионов в течение одного сеанса изображения также устраняет экспериментальный шум между репликациями.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Эмбрион Микроинъекция и электропорации в хордовых<em&gt; Ciona интестиналис</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Среднесрочная подготовка<em&gt; Drosophila</em&gt; Экстракты эмбрионов для протеомических экспериментов

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

В пробирке Выращивания яйцеклетку для Live клеточной Imaging зигота поляризации и кучность эмбриона в проростках Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Епископская микроскопия высокого разрешения (HREM) - Простые и надежные протоколы для обработки и визуализации органических материалов

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Живые клетки изображений сегрегации хромосом в процессе митоза

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Микроинъекции системы в Vivo имплантации эмбриона кардиомиоцитов птичьего эмбриона

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging и анализ мышечных сокращений в дрозофилы эмбриона

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Подготовка Drosophila Ларваль и Pupal Тесты для анализа клеточного отдела в прямом эфире, Intact Ткани

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...