Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM och BR stöds av Center for Cellular Construction, en National Science Foundation (NSF) Science and Technology Center, enligt bidragsavtalet DBI-1548297. BR stöds också genom en NSF CAREER award, 1553695.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Det protokoll som beskrivs här är mycket mångsidig och lätt att anpassa för att studera biologiska händelser i en mängd olika stadier i Drosophila embryonala utveckling. Detta protokoll är väl lämt för att studera biologiska processer som sker under långa tidsperioder. Till exempel, studier av cellularization29,30 eller bildandet av heterokromatin domäner i Drosophila31,32 kunde dra nytta av att utnyttja de metoder som beskrivs i detta protokoll eftersom dessa processer sker under en längre tid. Dessutom kan provstorlek ökas genom att minska förstoringen för att studera frågor som kräver mindre optisk upplösning, såsom tidpunkten mellan syncytial divisioner33 eller gastrulationens varaktighet34.  På samma sätt tillåter ett 20x-mål två embryon att avbildas inom ett bildplan. Metoderna i detta protokoll ger en dynamisk plattform för att ställa biologiska frågor med hjälp av embryonal utveckling som ett modellsystem för kvantitativ analys.
Det finns 3 kritiska steg i det här protokollet. Post avchorionation i 50% blekmedel är det absolut nödvändigt att embryon sköljs och torkas kraftigt 5 gånger (2.3.4). Detta steg tar bort alla överblivna små bitar av chorion. Överbliven chorion kommer att hindra synfältet när avbildning embryot. När man monterar embryona på glasöverdrag (3.5) är det viktigt att man trycker fast embryona på limmet med ett enhetligt tryck. Detta kommer att placera embryona på samma z plan. När du skär öppna mikroinjektionsnålen är det viktigt att dra tillbaka kolven omedelbart för att justera nålens flödeshastighet eller så förlorar du allt ditt injektionsmedel.
Vår studie begränsades av två faktorer. Den första faktorn var att inte ha en automatiserad segmenteringsprocess. Vi utformade en manuell segmentering skript med hjälp av MATLAB, dock; med en genetiskt kodad spindelmarkör skulle denna process kunna automatiseras. I framtiden vill vi producera CNN-RFP21, Rtln1-GFP och CNN-RFP; ReepB-GFP transgena linjer för att möjliggöra automatiserad spindel segmentering. För mer information angående vår MATLAB script och analyspipeline, se kompletterande material av Diaz et al.15. För det andra var vi också begränsas av vår förvärvsintervall på 35 s, vilket endast tillät oss att bild 6 embryon samtidigt. Ett längre förvärvsintervall skulle göra det möjligt för oss att avbilda fler embryon samtidigt. Även om drug delivery genomströmning kan öka genom att ersätta microinjection med ett permeation steg, fann vi detta vara onödigt eftersom vår provstorlek var redan begränsad av förvärv intervall.
Medan detta protokoll användes för att avbilda Drosophila embryonala utveckling, är den övergripande metoden anpassningsbar för att studera embryonal utveckling i andra flercelliga modellsystem, såsom C. elegans, Sjöborrar, och Xenopus. Embryon är extremt användbara för kvantitativ analys eftersom de enkelt synkroniseras via insamling eller befruktning. Dessutom flyttar embryon inte eller simmar bort från ett synfält, vilket gör det möjligt att använda en enkel multipunkt förvärv kapabel programvara för att producera flera videor tid förfaller för kvantitativ analys. Även om vi använde en analysator med hög halt i vår studie, kan alla inverterade mikroskop system som kan multipoint förvärv paras ihop med de metoder som avses häri.
Liknande resultat kan erhållas med hjälp av en multipoint förvärv kan inverterad confocal mikroskop; dock, fördelarna med en hög halt analysator fram som en ökar provstorlek för att studera frågor som kräver mindre upplösning i tid. En uppenbar fördel med att använda en analysator med högt innehåll är möjligheten att bild 4 separata diabilder samtidigt jämfört med 1 slide på traditionella system. Med en fullständig uppsättning av 4 diabilder och 40 embryon på varje objektglas kan 160 embryon avbildas under flera timmar, så länge förvärvsintervallet är minst 15 min mellan ramarna. En annan viktig fördel med att använda en analysator med hög halt är att proverna är helt avspärrade från eventuella externa ljuskällor, vilket är nödvändigt för fluorescensintensitetsbaserade mätningar. Slutligen, den höga innehållet analysator som används i vår studie har en 5,5-megapixel CMOS kamera som ger en generös 221,87 μm synfält vid 60x förstoring. Detta större synfält gjorde det möjligt för oss att avbilda ett halvt embryo per förvärvspunkt.

Under de senaste 30 åren har framsteg inom bildteknik och molekylära sonder för livecellsavbildning fört fram vår förståelse av cellens komplexitet och inre arbete. Medföljande denna framsteg inom teknik är en större tillit till användningen av ex vivo cell kultur modeller för förvärv av hög genomströmning bildframställning data. Cellodlingsmodeller ger flera fördelar, bland annat kontroll av mikroviromen genom mikrofluidiska system, och möjlighet att avbilda flera celler samtidigt, vilket möjliggör användning av kvantitativa metoder som är nödvändiga för screening med höggenomströmning 1,2. Det finns dock också betydande nackdelar som är förknippade med cellodlingsmodeller i samband med morfologiska studier, såsom tvådimensionella glas- eller plastytor som producerar förvirrande effekter på cellmorfologi och dessförordning 3,4,5. Dessa effekter kan ge falska eller vilseledande data när det gäller studier av biologiska processer som reglerar cellulär morfologi.
Även om alternativet har varit att studera cellulära morfologi i samband med en intakt organism6,få lämpliga intakt organismer underlätta hög genomströmning kvantitativa levande cell imaging på grund av svårigheter att hålla hela organismer vid liv genom ut imaging, och utmaningar i samband med avbildning inuti en stor flercelliga organism. Som ett resultat har cellbiologiska studier i intakta organismer i allmänhet fokuserat på att observera en enda organism över tiden, vilket kraftigt begränsar urvalsstorleken. Dessutom gör denna begränsning av en djur-vid-en-tid att det är svårt och kostsamt att använda live-bild av i form av en skärm och begränsar möjligheten att tillämpa kvantitativa analysverktyg eftersom antalet prover i allmänhet är för litet. Således uppstår behovet av en flercellig modellorganism som kan användas för högt innehåll baserade kvantitativa metoder.
Detta protokoll anpassar Drosophila embryot för plattan-baserade hög innehållsbildning för att generera experimentella provstorlekar stora nog för kvantitativ analys. Drosophila melanogaster är allmänt känd som den första modellen organism. Forskning med Drosophila har lett till genombrott inom cell- och molekylärbiologi, inklusive överföring av genetisk information, identifiering av cellsignaleringsvägar, och genetiska krav på embryonal utveckling7,8,9. Dessutom har Drosophila embryot använts för att utforska in vivo mikrotubuli dynamik under celluläradivision 10,11,12. Användningen av mikroinjektion för att leverera små molekyler och molekylära sonder ger tidsstyre som gör Drosophila embryonal utveckling särskilt kraftfull för att sondera cellulära processer in vivo13,14. Men genererar ett betydande antal experimentella upprepningar med en traditionell bildbehandling strategi är extremt arbetsintensiva och har begränsad användning i hög genomströmning bildskärmar och kvantitativ analys. Vår metod använder sig av en hög halt analysator vanligtvis reserverad för encellig analys och anpassar in vivo bildframställning analys i syncytium av den tidiga Drosophila embryo.
Detta protokoll användes för att samla in, skede, och microinject Drosophila embryon att utforska de mekanismer som driver morfologiska förändringar i Endoplasmic Reticulum (ER) under mitos15. Även om många studier har beskrivit den dynamiska karaktären av ER under cellcykeln16,17,18,19, har det varit svårt att jämföra effekterna av flera perturbations över tiden på ER morfologi. För att identifiera de komponenter som driver förändringar i ER morfologi över cell division, de metoder som anges i detta protokoll användes för att avkamma rollen av mikrotubuli och andra cytoskelettal faktorer på mitotiska ER omorganisation med hjälp av den kortikala syncytial division i början Drosophila embryot. Sammantaget tillgången till genetiska perturbation inom Drosophila samhället, förmågan att microinject läkemedel och molekylära sonder vid exakta tidpunkter under utvecklingen, och den billiga kostnaden för att arbeta med Drosophila gör detta tillvägagångssätt mycket mottagliga för hög genomströmning bildbaserad screening. De metoder som beskrivs här är tillämpliga för att studera en mängd olika cellulära och utvecklingsmässiga processer in vivo med hjälp av Drosophila embryot 20. Specifikt är detta protokoll väl anpassat för att studera biologiska händelser som inträffar under en längre period och inom 100 mikrometer från Drosophila embryocortex.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Moderna metoder inom kvantitativ livecellsavbildning har blivit ett viktigt verktyg för att utforska cellbiologi, genom att möjliggöra användning av statistik och beräkningsmodellering för att klassificera och jämföra biologiska processer. Även om cellodling modellsystem är bra för hög halt bildbehandling, högt genomströmning studier av cell morfologi tyder på att ex vivo kulturer är begränsade i recapitulating den morfologiska komplexiteten som finns i celler inom levande organismer. Som sådan, Det finns ett behov av en skalbar hög genomströmning modellsystem för att bilden levande celler inom en intakt organism. Beskrivs här är ett protokoll för att använda en hög innehåll bild analysator att samtidigt förvärva flera time-lapse videor av embryonala Drosophila melanogaster utveckling under syncytial blastoderm scenen. Den syncytial blastoderm har traditionellt fungerat som en stor in vivo modell för bildbehandling biologiska händelser; dock, erhålla ett betydande antal experimentella replikat för kvantitativa och hög genomströmning metoder har varit arbetsintensiva och begränsas av avbildning av ett enda embryo per experimentell upprepa. Presenteras här är en metod för att anpassa bildbehandling och microinjection metoder för att passa en hög halt bildsystem, eller någon inverterad mikroskop kan automatiserad multipunkt förvärv. Detta tillvägagångssätt möjliggör samtidig förvärv av 6-12 embryon, beroende på önskad förvärvsfaktorer, inom en enda bildbehandling session.

Det tillvägagångssätt som presenteras i detta protokoll användes för att undersöka mikrotubulis roll i Omorganisationen av Endoplasmatiska Reticulum (ER) under mitos i Drosophila embryot 15. Under mitos visar strukturen på ER en dramatisk omorganisation, men de krafter som driver dessa förändringar är dåligt förstådda. Nyligen visades en familj av ER forma proteiner för att främja bildandet av ER tubule25,26,27,28, som är kända för sin närhet med mikrotubuli28. För att studera rulle av microtubules på ER morfologi, de metoder som tillhandahålls i protokollet användes för att generera data för att kvantitativt jämföra effekterna av flera microinjected läkemedelsbehandlingar på ER omorganisation under mitos. Kolkicin, som förhindrar ny mikrotubulipolymerisering, befanns drastiskt minska omorganiseringen av ER under mitos enligt figur 5 och figur 6. Vidare, det tillvägagångssätt som beskrivs här möjliggjorde produktion av tid varv imaging data för 32 embryon. Medel- och maxintensitetsmätningar producerades från 12 800 intresseregioner med hjälp av ett anpassat MATLAB-skript, vilket också genererade beskrivande och inferential statistik som är avgörande för att göra jämförelser mellan läkemedelsbehandlingar. På grund av tillgången på molekylära sonder och den lätthet av mikroinjektioner, de metoder som beskrivs här är lätt anpassningsbara för att studera en mängd olika biologiska processer via fluorescens intensitet kvantifiering.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figur 5: Representativa Bilder av Rtnl1-GFP och ReepB-GFP-anrikning vid spindelpolerna under mitos. (A) 60x synfält av ReepB-GFP under mitos i cellcykel 10. Den blå fyrkanten representerar synfältet som används för panelerna B-E. Panel A bearbetas med ett tröskelbindfilter. Det här filtret tillämpades inte på panelerna B-E eftersom det utesluter data från pixlar under det inställda tröskelvärdet. (B,D) ReepB-GFP i kontroll, och i kolkicin. (C,E) Rtnl1-GFP i kontroll, och i kolchicin. Denna siffra har modifierats från Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figur 6: Kvantisering av Rtnl1-GFP och ReepB-GFP-anrikning vid spindelpolerna under mitos. 20 spindlar och 20 cytoplasman ROIs över 10 ramar analyserades för 32 embryon i följande villkor. (A) 10% DMSO kontroll injektioner för Rtnl1-GFP. Kontroll embryon visade en 0,1-faldig ökning av anrikning (p<0,001 för alla prover vid T210) jämfört med icke-injicerade prover (p < 0,001 för alla prover på T210). (B) ReepB-GFP embryon som injiceras med 10% DMSO att tjäna som kontroll. Kontrollembryon visade en 0,1-faldig ökning av anrikningen (p<0.001 för alla prover vid T210) jämfört med icke-injicerade prover (Figur 1E; p < 0.001 för alla prover vid T210). (C) Rtnl1-GFP embryon som injiceras med 5 μM Kolchicin. Här mätte vi en reduktion av Rtnl1-GFP-anrikning till spindlar (p < 0,001 för alla prover på T210) jämfört med kontroller (A) (p < 0,001 för alla prover på T210). (D) ReepB-GFP embryon som injiceras med 5 μM Kolchicin. Vi mätte en minskning av ReepB-GFP anrikning till spindlar (p<0,001 för alla prover på T210) jämfört med kontroller (B) (p<0.001 för alla prover på T210). Denna siffra har modifierats från Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Jäst Pasta21</td>
			<td>2. Druvplattor21</td>
			<td>3. Heptane Lim24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,1 Tillsätt 7 gram aktiv torrjäst till en 50 ml konisk. Tillsätt 9 milliliter DI vatten och blanda till jämn beständighet med en metallspatel.</td>
			<td>2.1 Gör lösning a: Tillsätt 6 gram agar till 140 ml DI-vatten i en 250 ml kolv och autoklavera den.</td>
			<td>3.1 Fyll en glasscintillationsflaska med 50 tum dubbelsidig tejp.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,1 Tillsätt 7 gram aktiv torrjäst till en 50 ml konisk. Tillsätt 9 milliliter DI vatten och blanda till jämn beständighet med en metallspatel.</td>
			<td>2.2 Gör lösning b: Blanda 0,1 gram metylparaben i 2 ml etanol och tillsätt sedan denna lösning till 60 ml grapefruktjuicekoncentrat.</td>
			<td>3.2 Tillsätt 20 ml heptan och tätningsglasscintillationsflaska med parafilm. Rotera över natten i rumstemperatur.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Omedelbart efter autoklavering lösning a, blanda i lösning b och häll blandningen i 10 x 35mm perti rätter. (gör 35 druvplattor)</td>
			<td>3.3 Avlägsna plastbandsskräp genom att överföra lim till 2 15 ml koniska rör och centrifugera vid 3000 RPM i 15 minuter.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Låt druvplattor ställas in i rumstemperatur över natten med tallrikslock av. Täckplattor med lock och förvara i 4C° efter att de satts.</td>
			<td>3.4 Överför limsuptant till 1,5 ml mikrocentrifugrör för förvaring.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Recept på media och lösningar.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Presenteras här är ett protokoll till microinject och samtidigt bild flera Drosophila embryon under embryonala utvecklingen med hjälp av en tallrik-baserade, hög innehåll imager.

Drosophila Embryo Förberedelse och Microinjection för Live Cell Mikroskopi utförs med hjälp av en automatiserad Hög innehåll Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Detta protokoll möjliggör en samtidig anskaffning av flera embryon inom en bildbehandlingssession. Medan provberedningen är anpassad för flerpunktsförvärv med hjälp av en analysator med högt innehåll, kan prover som bereds med hjälp av detta protokoll avbildas på alla inverterade mikroskop som kan multi-point acquisition. Till att börja organisera två rader med 15 till 20 embryon på en ren del av stor tallrik med hjälp av ett äggplockare verktyg.Anpassa embryon på deras ventrala sida i samma orientering med avseende på främre och bakre ändar. Följ en spacer på en coverslip och strimma 10 mikroliter av heptan lim ner den exponerade täckkollelet glas infälld. Medan limmet torkar, använd ett rakblad för att skära en rektangel runt de två raderna av embryon.Klipp en andra rektangel bredvid den första och ta bort den andra rektangeln med en rak kantsida av en rostfritt stålspatel. Skjut försiktigt spatelns raka kant under den första rektangeln och ta bort den. Placera sedan utskärningen med embryon på den externa sidan av en 3,5 centimeters skål.Under ett stereomikroskop, sänk en beredd täckbild över embryona och tryck försiktigt de två raderna av embryon på limmet. Om inte utför microinjection, fyll silikon distans halvvägs till toppen med en-till-en halocarbon olja 700 till halocarbon olja 27. Linje botten kanterna på en fyra-slide plattan adapter med dubbelsidig tejp.Detta kommer att förhindra att bilden rör sig under bildtagning. Se till att inte placera bandet i banan för objektivet lins. Montera täckskydden på fyrdycksplatta-adaptern.Om microinjecting embryona, placera täckskydd med embryon över ett objektglas för att förhindra att botten av täcket blir smutsig under uttorkning och mikroinjection. Utskanning av embryon i fem till 10 minuter, sedan omedelbart täcka dem med en-till-en halocarbon olja 700 till halocarbon olja 27, fylla silikon spacer halvvägs till toppen. Ladda två eller tre mikroinjectionnålar med ungefär två mikroliter av insprutningsmedel med hjälp av en förlängd lastspets.Montera en nål på mikroinjektorn och tryck ned kolven halvvägs till spetsen, vilket ökar lufttrycket inuti glaskafillären. Sänk glasnålen på en glasrutschkana och skär nålspetsen med en ny rakhyvel med nummer nio, skärning i 45 graders vinkel för att få en skarp öppen spets. Injektionsmedlet ska rinna ner till botten av spetsen utan att rinna ut ur nålen.Tillsätt försiktigt 20 mikroliter halocarbon olja över nålspetsen och åter skär den öppnas i 45 graders vinkel. Insprutningsmedlet ska börja flöda snabbt, så kom ihåg att justera trycket genom att dra in kolven. Använd mikromanipulatorn för att placera nålen i mitten av synfältet.Lyft sedan nålen och ta bort glasrutschkanen underifrån. Placera embryon på stereo mikroskop scenen, under mikroinjektion nålen och fokusera på dem på 50 gånger förstoring. Sänk nålen tills den kommer in i samma fokus plan som embryon.Flytta bilden med en hand och driva mikroinjektor med den andra, injicera en rad av embryon. Höj nålen och rotera bilden 180 grader för att exponera den andra raden av embryon till mikroinjektionsnålen. Sänk nålen och injicera den andra raden av embryon.Detta protokoll användes för att undersöka rollen av microtubules i endoplasmic reticulum reorganization under mitos i Drosophila embryot. Effekterna av flera microinjected läkemedelsbehandlingar på ER omorganisation jämfördes kvantitativt. Colchicin, som förhindrar nya mikrotubuli polymerisering, konstaterades att drastiskt minska lokaliseringen av ER till spindel poler under mitos.Time förfaller bildframställning data förvärvades för 32 embryon. Medelvärde och max intensitet mätningar analyserades från 12, 800 regioner av intresse med hjälp av en anpassad MATLAB skript. När du försöker detta protokoll för första gången, kom ihåg att inte ta för lång tid på något steg, annars riskerar du att missa din utvecklingsstadium som du vill bilden.Öva det här protokollet steg för steg innan du försöker dig på några experiment. Vår metod för provberedning underlättar en samtidig förvärv av flera embryon under ett experiment, vilket genererar tillräckligt experimentella replikat för kvantitativ analys. Detta protokoll kan hjälpa utvecklingsmässiga embryologi övergång från kvalitativa till kvantitativa bildframställning experiment.Möjligheten att avbilda flera embryon inom en bildbehandling session eliminerar också experimentellt brus mellan replikat.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo mikroinjektion och elektroporering i chordate<em&gt; Tarmsjöpung</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Förberedelse av medelstora<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoxtrakt för proteintester

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Fröämnet odling för Live-cell Imaging av zygot polarisering och Embryo mallning i Arabidopsis thaliana.

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Högupplösande episkopisk mikroskopi (HREM) - Enkla och robusta protokoll för bearbetning och visualisering av organiska material

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroskop-baserat System för i Vivo Implantation av embryonala hjärtmuskelcellerna i aviär embryot

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levande avbildning och analys av muskelsammandragningar i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Beredning av Drosophila Larval och Pupal Testes för analys av celldelning i levande, intakt vävnad

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...