Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM ve BR, DBI-1548297 hibe anlaşması kapsamında Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Bilim ve Teknoloji Merkezi Olan Hücresel İnşaat Merkezi tarafından desteklenir. BR ayrıca 1553695 sayılı NSF CAREER ödülü ile desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan protokol drosophila embriyonik gelişiminde çeşitli aşamalarda biyolojik olayları incelemek için son derece çok yönlü ve kolayca uyarlanabilir. Bu protokol, uzun süreler boyunca meydana gelen biyolojik süreçleri incelemek için uygundur. Örneğin, hücreselleşme çalışmaları29,30 veya Drosophilaheterokromatin etki alanlarının oluşumu31,32 bu süreçler uzun bir süre içinde meydana beri bu protokolde açıklanan yöntemlerin kullanımı yararlanabilir. Buna ek olarak, daha az optik çözünürlük gerektiren soruları incelemek için büyütme azaltılarak örnekboyutu artırılabilir, örneğin seniyel bölümler arasındaki zamanlama33 veya gastrulation süresi34.  Aynı şekilde, 20x hedefi iki embriyonun bir görüntüleme düzleminde görüntülenmesine olanak tanır. Bu protokoldeki yöntemler, embriyonik gelişimi kantitatif analiz için bir model sistem olarak kullanarak biyolojik sorular sormak için dinamik bir platform sağlamaktadır.
Bu protokolde 3 kritik adım vardır. %50 çamaşır suyunda dechorionation sonrası embriyoların durulanıp 5 kez (2.3.4) şiddetle kurutulan olması zorunludur. Bu adım chorion kalan küçük parçalar kaldırır. Artık chorion embriyo görüntüleme görüş alanını engelleyecektir. Embriyoları cam kapak kaymasına (3.5) monte ederken, embriyoların tek tip basınçla tutkal üzerine basılması önemlidir. Bu embriyoları aynı z düzlemine yerleştirecektir. Mikroenjeksiyon iğnesini keserken, iğnenin akış hızını ayarlamak için hemen pistonu geri çekmek önemlidir, yoksa tüm enjektörükaybedersiniz.
Çalışmamız iki faktörle sınırlıydı. İlk faktör otomatik bir segmentasyon işlemi olmamasıydı. Ancak MATLAB kullanarak manuel segmentasyon komut dosyası tasarladık; genetik olarak kodlanmış bir mil işareti ile bu işlem otomatik olabilir. Gelecekte biz CNN-RFP21,Rtln1-GFP ve CNN-RFP üretmek istiyorum; Otomatik mil segmentasyonunu etkinleştirmek için ReepB-GFP transgenik hatları. Bizim MATLAB komut dosyası ve analiz boru hattı ile ilgili daha fazla bilgi için, Diaz ve ark15ek malzemelerbakın. İkinci olarak, 35 s'lik alım aralığımızla da sınırlıydık, bu da sadece 6 embriyonun aynı anda görüntülenebildi. Daha uzun bir edinme aralığı aynı anda daha fazla embriyo görüntü sağlayacaktır. Mikroenjeksiyonun permeasyon adımı ile değiştirilmesiyle ilaç teslim hacmi artabilir, ancak numune büyüklüğümüz zaten edinme aralığıyla sınırlı olduğu için bunun gereksiz olduğunu gördük.
Bu protokol Drosophila embriyonik gelişimi görüntü için kullanılırken, genel yaklaşım c. elegansgibi diğer çok hücreli model sistemlerinde embriyonik gelişimi incelemek için uyarlanabilir, Deniz Kestanesi, ve Xenopus. Embriyolar, toplama veya döllenme yoluyla kolayca senkronize edildiklerinden kantitatif analiz için son derece yararlıdırlar. Buna ek olarak, embriyolar hareket etmez veya görüş alanından yüzerek, sayısal analiz için birden fazla zaman atlamalı video üretmek için basit bir çok noktalı edinim yeteneğine sahip yazılım kullanımını sağlar. Çalışmamızda yüksek içerik analizörü kullanmamıza rağmen, çok noktalı edinim yapabilen ters mikroskop sistemi burada belirtilen yöntemlerle eşleşebilir.
Benzer sonuçlar ters konfokal mikroskop yeteneğine sahip çok noktalı bir edinim kullanılarak elde edilebilir; ancak, yüksek içerik çözümleyicisinin avantajları, zaman içinde daha az çözünürlük gerektiren soruları incelemek için örneklem boyutunu artırdıkça ortaya çıkar. Yüksek içerik çözümleyicisi kullanmanın bariz bir avantajı, geleneksel sistemlerde 1 slayta kıyasla aynı anda 4 ayrı slayt görüntülenebilme yeteneğidir. Her slaytta 4 slayt ve 40 embriyodan oluşan tam bir set le, kazanım aralığı kareler arasında en az 15 dakika olduğu sürece, 160 embriyo birkaç saat içinde görüntülenebilir. Yüksek içerik analizörü kullanmanın bir diğer önemli avantajı da numunelerin floresan yoğunluğuna dayalı ölçümler için gerekli olan harici ışık kaynaklarından tamamen kapalı olmasıdır. Son olarak, çalışmamızda kullanılan yüksek içerik analizörü 60x büyütme de görüş cömert bir 221,87 μm alan sağlayan bir 5.5 megapiksel CMOS kamera vardır. Bu daha büyük görüş alanı, satın alma noktası başına yarım embriyo görüntüsü elde etmemizi sağladı.

Geçtiğimiz 30 yıl içinde, canlı hücre görüntüleme için görüntüleme teknolojileri ve moleküler problar gelişmeler hücrekarmaşıklığı ve iç işleyişi ni anlamamızı ilerlettir. Teknolojideki bu kayda eşlik eden şey, yüksek iş hacmi görüntüleme verilerinin elde edilmesinde ex vivo hücre kültürü modellerinin kullanımına daha fazla güvenilmesidir. Hücre kültürü modelleri mikroakışkan sistemler aracılığıyla mikroortamın kontrolü ve aynı anda birden fazla hücre görüntü yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar, yüksek iş yapma tarama için gerekli nicel yaklaşımların kullanımını sağlayan1,2. Ancak, iki boyutlu cam veya plastik yüzeyler hücre morfolojisi ve düzenleme3,4,5üzerinde şaşırtıcı etkileri üreten gibi morfolojik çalışmalar bağlamında hücre kültürü modelleri ile ilgili önemli dezavantajları da vardır. Bu etkiler hücresel morfolojiyi düzenleyen biyolojik süreçlerin incelenmesi ile ilgili yanlış veya yanıltıcı veri sağlayabilir.
Alternatif bozulmamış bir organizmabağlamındahücresel morfoloji çalışma olmuştur 6, birkaç uygun bozulmamış organizmalar görüntüleme yoluyla tüm organizmaların canlı tutmak zorluklar nedeniyle yüksek iş gücü kantitatif canlı hücre görüntüleme kolaylaştırmak, ve büyük bir çok hücreli organizma içinde görüntüleme ile ilgili zorluklar. Sonuç olarak, bozulmamış organizmalarda hücre biyolojik çalışmalar genellikle büyük ölçüde örnek boyutunu sınırlar zaman içinde tek bir organizma gözlemleyerek odaklanmıştır. Buna ek olarak, bu tek hayvan-at-a-time sınırlama canlı görüntüleme zor ve bir ekran şeklinde istihdam pahalı hale getirir ve örnek sayısı genellikle çok küçük olduğundan nicel analitik araçları uygulamak için yeteneği kısıtlar. Böylece, yüksek içerik tabanlı nicel yaklaşımlar için kullanılabilecek bir çok hücreli model organizma ihtiyacı ortaya çıkar.
Bu protokol, drosophila embriyoyu, kantitatif analiz için yeterince büyük deneysel numune boyutları oluşturmak için plaka bazlı yüksek içerikli görüntülemeye uyarlar. Drosophila melanogaster yaygın ilk model organizma olarak bilinir. Drosophila kullanarak araştırma hücre ve moleküler biyoloji atılımlar yol açmıştır, genetik bilgi iletimi de dahil olmak üzere, hücre sinyal yollarının belirlenmesi, ve embriyonik gelişim genetik gereksinimleri7,8,9. Buna ek olarak, Drosophila embriyo hücresel bölünme sırasında in vivo mikrotübül dinamikleri keşfetmek için kullanılmıştır10,11,12. Küçük moleküller ve moleküler problar sunmak için mikroenjeksiyon kullanımı Drosophila embriyonik gelişimi özellikle vivo hücresel süreçleri sondalama için güçlü kılan zamansal kontrol sağlar13,14. Ancak, geleneksel görüntüleme yaklaşımı ile önemli sayıda deneysel tekrar oluşturmak son derece emek yoğundur ve yüksek iş gücü görüntüleme ekranları ve kantitatif analizlerde sınırlı kullanıma sahiptir. Yaklaşımımız genellikle tek hücre analizi için ayrılmış yüksek içerik libir analizör kullanır ve erken Drosophila embryo senkronizasyonunda in vivo görüntüleme analizi uyarlar.
Bu protokol, mitoz15sırasında Endoplazmik Retikulum (ER) morfolojik değişiklikleri sürücü mekanizmaları keşfetmek için drosophila embriyoları toplamak, evre ve mikroenjekte etmek için kullanılmıştır. Birçok çalışma hücre döngüsü sırasında ER dinamik doğası özetlenen olmasına rağmen16,17,18,19, ER morfolojisi üzerinde zaman içinde birden fazla tedirginlik etkilerini karşılaştırmak zor olmuştur. Hücre bölünmesi boyunca ER morfolojisinde değişiklikleri yönlendiren bileşenleri tanımlamak için, bu protokolde listelenen yöntemler erken Drosophila embriyosunda kortikal sintiyel bölünme kullanılarak mitotik ER yeniden yapılandırışmikrotübüllerin ve diğer sitosiskeleter faktörlerin rolünü araştırmak için kullanılmıştır. Birlikte ele alındığında, Drosophila topluluk içinde genetik pertürbasyon durumu, geliştirme sırasında hassas zamanlarda ilaç ve moleküler problar mikroenjekte yeteneği, ve Drosophila ile çalışmanın ucuz maliyeti bu yaklaşımı son derece yüksek verimli görüntü tabanlı tarama için uygun hale getirir. Burada açıklanan yöntemler Drosophila embriyo20kullanarak vivo hücresel ve gelişimsel süreçlerin geniş bir yelpazede incelenmesi için geçerlidir. Özellikle, bu protokol de uzun bir süre içinde meydana gelen biyolojik olayları incelemek için uyarlanmıştır ve Drosophila embriyo korteks 100 mikron içinde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Kantitatif canlı hücre görüntülemesinde modern yaklaşımlar, biyolojik süreçleri sınıflandırmak ve karşılaştırmak için istatistik ve hesaplamalı modellemenin kullanımını sağlayarak hücre biyolojisini keşfetmek için önemli bir araç haline gelmiştir. Hücre kültürü model sistemleri yüksek içerikli görüntüleme için harika olmasına rağmen, hücre morfolojisi yüksek iş artışı çalışmaları ex vivo kültürlerin canlı organizmalar ın içindeki hücrelerde bulunan morfolojik karmaşıklığı özetlemede sınırlı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, sağlam bir organizma içinde yaşayan hücreleri görüntüölçeklenebilir yüksek iş elde etme modeli sistemi için bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan aynı anda senkronize blastoderm aşamasında embriyonik Drosophila melanogaster gelişimi birden fazla zaman atlamalı videoları elde etmek için yüksek içerikgörüntü analizörü kullanmak için bir protokoldür. Syncytial blastoderm geleneksel görüntüleme biyolojik olaylar için büyük bir in vivo modeli olarak hizmet vermiştir; ancak, nicel ve yüksek iş gücü yaklaşımları için önemli sayıda deneysel kopya elde etmek emek yoğun olmuştur ve deneysel tekrar başına tek bir embriyonun görüntülenmesi ile sınırlıdır. Burada sunulan yüksek içerikli görüntüleme sistemi, ya da otomatik multinokta edinimi yeteneğine sahip herhangi bir ters mikroskop uyacak şekilde görüntüleme ve mikroenjeksiyon yaklaşımları adapte etmek için bir yöntemdir. Bu yaklaşım, istenilen edinim faktörlerine bağlı olarak, tek bir görüntüleme seansı içinde 6-12 embriyonun eşzamanlı olarak edinilmesini sağlar.

Bu protokolde sunulan yaklaşım Drosophila embriyo15mitoz sırasında Endoplazmik Retikulum (ER) reorganizasyon mikrotübüllerin rolünü incelemek için kullanılmıştır. Mitoz sırasında, ER yapısı dramatik bir yeniden yapılanma görüntüler, ancak, bu değişiklikleri sürücü güçler kötü anlaşılmaktadır. Son zamanlarda, ER şekillendirme proteinleri bir aile ER tübül oluşumunu teşvik gösterilmiştir25,26,27,28, mikrotübüller ile yakın yakınlığı için bilinen28. ER morfolojisi üzerinde mikrotübüllerin rulo çalışma için, protokolde sağlanan yöntemler nicel mitoz sırasında ER yeniden yapılanma birkaç mikroenjekte ilaç tedavilerin etkilerini karşılaştırmak için veri üretmek için kullanılmıştır. Yeni mikrotübül polimerizasyonunu engelleyen kolşisin, Şekil 5 ve Şekil 6'dagösterildiği gibi mitoz sırasında ER'nin yeniden yapılanmasını önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur. Ayrıca, burada açıklanan yaklaşım 32 embriyo için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin üretimini sağladı. Ortalama ve maksimum yoğunluk ölçümleri, ilaç tedavileri arasında karşılaştırmalar yapmak için hayati önem taşıyan açıklayıcı ve çıkarsal istatistikler de üreten özel bir MATLAB komut dosyası kullanılarak 12.800 bölgeden üretilmiştir. Moleküler probların kullanılabilirliği ve mikroenjeksiyonların kolaylığı nedeniyle, burada açıklanan yöntemler floresan yoğunluğu nicelemesi yoluyla çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Şekil 5: Mitoz sırasında mil direklerinde Rtnl1-GFP ve ReepB-GFP zenginleştirme temsili görüntüler. (A) Hücre döngüsünde mitoz sırasında ReepB-GFP 60x görüş alanı 10. Mavi kare, B-E panelleri için kullanılan görüş alanını temsil eder. Panel A eşik ikili filtre ile işlenir. Bu filtre, ayarlanan eşiğin altındaki piksellerden veri hariç olduğu için B-E panellerine uygulanmadı. (B,D) ReepB-GFP kontrolünde ve kolşisinde. (C,E) Rtnl1-GFP kontrolünde ve kolşisin. Bu rakam Diaz ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Şekil 6: Mitoz sırasında mil kutuplarında Rtnl1-GFP ve ReepB-GFP zenginleştirmelerinin ölçülmesi. Aşağıdaki koşullarda 32 embriyo için 10 karede 20 iğ ve 20 sitoplazma ROI analiz edildi. Rtnl1-GFP için %10 DMSO kontrol enjeksiyonları Kontrol embriyoları, enjekte edilmeyen numunelere kıyasla zenginleştirmede 0,1 kat artış (P<0,001) enjekte edilmeyen numunelere (P < 0,001) göstermiştir. (B) ReepB-GFP embriyoları kontrol olarak hizmet etmek için % 10 DMSO enjekte. Kontrol embriyoları, enjekte edilmeyen numunelere kıyasla zenginleştirmede 0,1 kat artış gösterdi (P<0.001 T210'daki tüm numuneler için)(Şekil 1E; p < T210'daki tüm numuneler için 0,001). (C) Rtnl1-GFP embriyoları 5 μM Kolşisin enjekte edilir. Burada rtnl1-GFP zenginleştirmesinde iğlere (p < T210'daki tüm numuneler için 0,001) bir azalma ölçtük kontroller (A) (p < T210'daki tüm numuneler için 0,001). (D) ReepB-GFP embriyoları 5 μM Kolşisin enjekte edilir. ReepB-GFP zenginleştirmesinde iğlere kadar bir azalma ölçtük (P<0.001 T210'daki tüm numuneler için) kontrollere göre (B) (p<0.001 T210'daki tüm numuneler için). Bu rakam Diaz ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Maya Yapıştır21</td>
			<td>2. Üzüm Tabakları21</td>
			<td>3. Heptane Tutkal24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 50 ml konik aktif kuru maya 7 gram ekleyin. 9 mililitre DI su ekleyin ve metal bir spatula ile eşit olarak karıştırın.</td>
			<td>2.1 Çözelti bir olun: 250ml şişe de DI su 140ml 6 gram agar ekleyin ve otoklav.</td>
			<td>3.1 Bir cam ışıltı şişesini 50 inç çift taraflı bantla doldurun.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 50 ml konik aktif kuru maya 7 gram ekleyin. 9 mililitre DI su ekleyin ve metal bir spatula ile eşit olarak karıştırın.</td>
			<td>2.2 Çözelti b olun: Etanol 2ml metil paraben 0,1 gram karıştırın, sonra greyfurt suyu konsantresi 60ml bu çözelti ekleyin.</td>
			<td>3.2 Parafilm ile 20 ml heptane ve mühür cam ışıltılı flakon ekleyin. Oda sıcaklığında bir gecede döndürün.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Otoklavlama çözeltisi a'dan hemen sonra b çözeltisine karıştırın ve karışımı 10 x 35mm perti tabaklara dökün. (35 üzüm tabağı yapar)</td>
			<td>3.3 2 15 ml konik tüplere tutkal aktararak plastik bant enkazlarını çıkarın ve 3000 RPM'de 15 dakika santrifüj edin.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Üzüm tabaklarının bir gecede oda sıcaklığında plaka kapakları kapalı olarak ayarlanın. Plakaları kapaklarla kapatın ve setten sonra 4C°'de saklayın.</td>
			<td>3.4 Depolama için 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleriçine yapıştırıcı supernatant aktarın.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Medya ve çözümlerin tarifleri.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Bu protokol, tek bir görüntüleme oturumu içinde birden fazla embriyonun aynı anda edinilmesini sağlar. Numune hazırlama, yüksek içerik çözümleyicisi kullanılarak çok noktalı edinim için uyarlanırken, bu protokol kullanılarak hazırlanan numuneler, çok noktalı edinim yapabilen ters mikroskopta görüntülenebilir. Başlamak için, bir yumurta toplayıcı aracı kullanarak büyük plaka temiz bir bölümünde 15-20 embriyolar iki satır düzenlemek.Ön ve arka uçlara göre aynı yönde ventral tarafında embriyolar hizalamak. Bir spacer'ı bir kapak kaymasına yapıştırın ve 10 mikrolitre heptane tutkalı açığa çıkan coverslip cam insetinaşağı doğru çizgileyin. Tutkal kururken, embriyoların iki satır etrafında bir dikdörtgen kesmek için bir jilet kullanın.Birincinin yanındaki ikinci bir dikdörtgeni kesin ve paslanmaz çelik spatulanın düz kenar tarafıyla ikinci dikdörtgeni çıkarın. Spatulanın düz kenarını ilk dikdörtgenin altına dikkatlice kaydırın ve çıkarın. Sonra, 3,5 santimetrelik bir yemeğin dış tarafında embriyolar ile cutout yerleştirin.Stereo mikroskop altında, embriyoların üzerine hazırlanmış bir kapak kapağını düşürün ve iki embriyo sırasını tutkalüzerine nazikçe bastırın. Mikroenjeksiyon gerçekleştirmiyorsanız, silikon boşluk formunu bire bir halokarbon yağı 700 ile halokarbon yağı 27 ile yarıya kadar doldurun. Dört slaytlı plaka adaptörünün alt kenarlarını çift taraflı bantla hizalayın.Bu, slaytın görüntüleme sırasında hareket etmesini önler. Teypi objektif lensin yoluna yerleştirmeyin. Coverslip'i dört slaytlı plaka adaptörüne monte edin.Embriyolara mikroenjekte ediyorsanız, desiccation ve mikroenjeksiyon sırasında kapak alt kirli olmasını önlemek için bir slayt üzerinde embriyolar ile coverslip yerleştirin. Embriyoları 5 ila 10 dakika desiccate, sonra hemen bire bir halokarbon yağı ile kaplayın 700 halokarbon yağı 27, silikon spacer yarısına kadar doldurarak üst. Uzun bir yükleme ucu kullanarak yaklaşık iki mikrolitre enjektör ile iki veya üç mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin.Mikroenjektöre bir iğne saplayın ve pistonu ucun yarısına kadar bastırın, cam kılcal damarın içindeki hava basıncını artırın. Cam iğneyi cam bir kaydırağın üzerine indirin ve iğnenin ucunu yeni bir dokuz numaralı jiletle kesin, keskin bir açık uç üretmek için 45 derecelik bir açıyla kesin. Enjektör iğneden dışarı akmadan ucun dibine doğru akmalıdır.Dikkatlice iğneucu üzerinde halokarbon yağı 20 mikrolitre ekleyin ve 45 derecelik bir açıyla açıldı yeniden kesti. Enjektör hızla akmaya başlamalıdır, bu yüzden pistonu geri çekerek basıncı ayarlamayı unutmayın. İğneyi görüş alanının ortasına konumlandırmak için mikromanipülörü kullanın.Sonra iğne kaldırın ve altından cam slayt çıkarın. Embriyoları stereo mikroskop aşamasına, mikroenjeksiyon iğnesinin altına yerleştirin ve 50 kat büyütülerek üzerlerine odaklanın. İğneyi embriyolarla aynı odak düzlemine gelene kadar indirin.Bir el ile slayt taşıma ve diğer mikroenjektör işletim, embriyoların bir satır enjekte. İğneyi kaldırın ve ikinci embriyo sırasını mikroenjeksiyon iğnesine maruz bırakmak için kaydırağı 180 derece döndürün. İğneyi indirve ikinci sıra embriyoları enjekte edin.Bu protokol Drosophila embriyosunda mitoz sırasında mikrotübüllerin endoplazmik retikulum reorganizasyondaki rolünü incelemek için kullanılmıştır. Birkaç mikroenjekte ilaç tedavisinin ER yeniden yapılanması üzerindeki etkileri kantitatif olarak karşılaştırıldı. Yeni mikrotübül polimerizasyonunu engelleyen kolşisinin, mitoz sırasında iri direklere ER'nin lokalizasyonunu önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur.32 embriyo için zaman atlamalı görüntüleme verileri elde edildi. Ortalama ve maksimum yoğunluk ölçümleri özel bir MATLAB komut dosyası kullanılarak 12, 800 ilgi bölgesinden analiz edildi. Bu protokolü ilk kez denerken, herhangi bir adımda çok uzun sürmeyin, aksi takdirde görüntülemek istediğiniz gelişimsel aşamayı kaçırma riskine girebilirsiniz.Herhangi bir deneme denemeden önce bu protokolü adım adım uygulayın. Örnek hazırlama yöntemimiz, bir deney sırasında birden fazla embriyonun aynı anda edinimi nin kolaylaştırılmasını ve böylece nicel analiz için yeterli deneysel kopyaoluşturmayı kolaylaştırır. Bu protokol, nitel görüntüleme deneylerinden gelişimsel embriyolojigeçişine yardımcı olabilir.Tek bir görüntüleme oturumu içinde birden fazla embriyo görüntü yeteneği de çoğaltmalar arasında deneysel gürültü ortadan kaldırır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Orta Ölçekli Hazırlanışı<em&gt; Drosophila</em&gt; Proteomik Denemeler için Embriyo Özleri

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Yüksek Çözünürlüklü Episkopik Mikroskopi (HREM) - Organik Malzemelerin İşlenmesi ve Görselleştirilmesi için Basit ve Sağlam Protokoller

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...