Name: near infrared photoimmunotherapy for mouse models of pleural dissemination
Uploaded: 2021-02-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination at JoVE.com

Ninguno

Todos los experimentos in vivo se realizaron de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de los recursos de animales de laboratorio del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nagoya (aprobación # 2017-29438, # 2018-30096, # 2019-31234, # 2020-20104). Ratones desnudos homocigotos homocigotos de seis semanas de edad fueron comprados y mantenidos en el Centro de Animales de la Universidad de Nagoya. Al realizar el procedimiento en ratones, fueron anestesiados con isoflurano (introducción:...

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En este estudio, demostramos un método para medir el efecto terapéutico de NIR-PIT en el modelo de diseminación pleural de MPM. La muerte celular altamente selectiva se realizó con NIR-PIT; así, el tejido normal apenas se dañó23,24,25. Con este tipo de muerte celular selectiva, se demostró que NIR-PIT es seguro en los modelos diseminados9,<sup class="xre...

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad a pesar de décadas de investigación. Una razón es que la radioterapia y la quimioterapia son técnicas altamente invasivas, lo que puede limitar sus beneficios terapéuticos. Las terapias dirigidas celulares o moleculares, que son técnicas menos invasivas, están recibiendo una mayor atención. La fotoinmunoterapia es un método de tratamiento que mejora sinérgicamente el efecto terapéutico mediante la combinación de inmunoterapia y fototerapia. La inmunoterapia mejora la inmunidad tumoral al aumentar la inmunogenicidad del microambiente tumoral y reducir la supresión inmunorreguladora, lo que resulta en la destrucción de tumores en el cuerpo. La fototerapia destruye los tumores primarios con una combinación de fotosensibilizadores y rayos de luz, y los antígenos específicos del tumor liberados de las células tumorales mejoran la inmunidad tumoral. Los tumores se pueden tratar selectivamente con fotosensibilizadores, ya que son específicos y selectivos para las células diana. La modalidad de fototerapia incluye terapia fotodinámica (PDT), terapia fototérmica (PTT) y terapias basadas en fotoquímica1.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un método recientemente desarrollado de fototerapia antitumoral que combina la terapia basada en fotoquímicos y la inmunoterapia1,2. NIR-PIT es una terapia dirigida molecularmente que se dirige a moléculas específicas de la superficie celular a través de la conjugación de un colorante de ftalocianina de silicio del infrarrojo cercano, IRdye 700DX (IR700), a un anticuerpo monoclonal (mAb). La membrana celular de la célula diana se destruye tras la irradiación con luz NIR (690 nm)3.
El concepto de usar terapia de luz dirigida mediante la combinación de fotosensibilizadores y anticuerpos convencionales o PDT dirigida tiene más de tres décadas de antigüedad4,5. Estudios previos han intentado dirigirse a los agentes PDT convencionales conjudicándolos con anticuerpos. Sin embargo, hubo un éxito limitado porque estos conjugados quedaron atrapados en el hígado, debido a la hidrofobicidad de los fotosensibilizadores6,7. Además, el mecanismo de NIR-PIT es completamente diferente del de la PDT convencional. Los fotosensibilizadores convencionales generan estrés oxidativo que resulta de una conversión de energía que absorbe la energía de la luz, se disloca a un estado excitado, hace la transición al estado fundamental y causa apoptosis. Sin embargo, NIR-PIT causa necrosis rápida al destruir directamente la membrana celular al agregar fotosensibilizadores en la membrana a través de una reacción fotoquímica8. NIR-PIT es superior a la PDT dirigida convencional en muchos sentidos. Los fotosensibilidades convencionales tienen bajos coeficientes de extinción, lo que requiere la unión de un gran número de fotosensibilizadores a una sola molécula de anticuerpo, lo que podría reducir la afinidad de unión. La mayoría de los fotosensibilidades convencionales son hidrófobos, lo que dificulta la unión de los fotosensibilizadores a los anticuerpos sin comprometer su inmunorreactividad o la acumulación de dianas in vivo. Los fotosensibilizadores convencionales suelen absorber la luz en el rango visible, reduciendo la penetración del tejido.
Se han reportado varios estudios sobre NIR-PIT dirigidos a tumores intratorácicos como el cáncer de pulmón y las células del mesotelioma pleural maligno (MPM)9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Sin embargo, solo unos pocos informes han descrito la eficacia de NIR-PIT en MPM diseminada pleural o cáncer de pulmón modelos9,10,11,12. Se cree que los modelos de xenoinjerto tumoral subcutáneo son modelos tumorales estándar y actualmente se utilizan ampliamente para evaluar los efectos antitumorales de las nuevas terapias18. Sin embargo, el microambiente tumoral subcutáneo no es permisivo para el desarrollo de una estructura tisular adecuada o una condición que recapitula adecuadamente un verdadero fenotipo maligno19,20,21,22. Idealmente, se deben establecer modelos de enfermedades ortotópicas para una evaluación más precisa de los efectos antitumorales.
Aquí, demostramos un método de evaluación de la eficacia en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT. Un modelo de ratón de diseminación pleural se genera inyectando células tumorales en la cavidad torácica y se confirma utilizando luminiscencia de luciferasa. El ratón fue tratado con una inyección intravenosa de mAb conjugada con IR700 e irradiación NIR al tórax. El efecto terapéutico se evaluó mediante luminiscencia de luciferasa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na Solution with Phenol Red</td>
			<td>Wako</td>
			<td>209-016941</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td>for mice experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G needle</td>
			<td>Nipro</td>
			<td>1907613</td>
			<td>for mice experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cSlc-nu/nu</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collidal Blue Staining Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6025</td>
			<td>use for gel protein staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie (bradford) Plus protein assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>PI-23200</td>
			<td>for measuring the APC concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>043-07216</td>
			<td>use for conjugation of IR700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin (potassium salt)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>14681</td>
			<td>for bioluminescence imaging and DLIT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism7</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td>for statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for analyzing 700 nm fluorescent image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 700DX Ester Infrared Dye</td>
			<td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td>
			<td>929-70011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Wako</td>
			<td>095-06573</td>
			<td>for mice anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>for capturing bioluminescent image and DLIT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>for analyzing bioluminescent image and DLIT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>S9763</td>
			<td>use for conjugation of IR700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR Laser</td>
			<td>Changchun New Industries Optoelectronics Technology</td>
			<td>MRL-III-690R</td>
			<td>for NIR irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex WedgeWell 4 to 20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04202BOX</td>
			<td>use for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>use for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td>
			<td>PM100</td>
			<td>for measuring the output of the NIR laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(-)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-23555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pearl Trilogy imaging system</td>
			<td>Li-Cor Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>for capturing 700 nm fluorecent image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin Solution (x100)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-23191</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin Dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113803</td>
			<td>for luciferase transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prticles</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS960002</td>
			<td>for luciferase transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with L-glutamine and Phenol Red</td>
			<td>Wako</td>
			<td>189-02025</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G25 column (PD-10)&#160;</td>
			<td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td>use for conjugation of IR700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-1900i</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
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near infrared photoimmunotherapy for mouse models of pleural dissemination

La eficacia de la fotoinmunoterapia se puede evaluar con mayor precisión con un modelo de ratón ortotópico que con uno subcutáneo. Se puede utilizar un modelo de diseminación pleural para la evaluación de métodos de tratamiento para enfermedades intratorácicas como el cáncer de pulmón o el mesotelioma pleural maligno.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia de tratamiento del cáncer desarrollada recientemente que combina la especificidad de los anticuerpos dirigidos al tumor con la toxicidad causada por un fotoabsorbente (IR700Dye) después de la exposición a la luz NIR. La eficacia de NIR-PIT se ha reportado usando varios anticuerpos; sin embargo, sólo unos pocos informes han demostrado el efecto terapéutico de esta estrategia en un modelo ortotópico. En el presente estudio, demostramos un ejemplo de evaluación de la eficacia del modelo de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT.

El anticuerpo anti-podoplanina NZ-1 se conjudicó con IR700 para generar NZ-1-IR700. Confirmamos la unión de NZ-1 e IR700 en un SDS-PAGE (Figura 8). La expresión de luciferasa H2373 (H2373-luc) se preparó transfectando células malignas de mesotelioma (H2373) con un gen luciferasa10.
Anestesiamos ratones desnudos homocigómicos hembra de 8-12 semanas de edad e inyectamos 1 × 105 células H2373-luc en la cavidad torácica. El ...

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Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia terapéutica emergente contra el cáncer que utiliza un conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (IR700Dye) y luz NIR para destruir las células cancerosas. Aquí, presentamos un método para evaluar el efecto antitumoral de NIR-PIT en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural y mesotelioma pleural maligno utilizando imágenes de bioluminiscencia.

Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

Este método se puede utilizar para evaluar los efectos terapéuticos de NIR-PIT en tumores torácicos en un modelo tumoral clínicamente relevante. Los procedimientos NIR-PIT que utilizan el modelo de cáncer diseminado pleural son fáciles de entender y realizar. Para configurar un modelo de diseminación de ratón, use espuma de poliestireno para hacer un tapón y desinfecte con etanol al 70%.Fije la aguja al tapón con la punta que se extiende cinco milímetros fuera del tapón. Doble la punta de una aguja calibre 30 con pórceps limpios o contra un objeto duro limpiado con etanol al 70%, y llene una jeringa con una vez 10 a las seis células tumorales objetivo en 100 microlitros de PBS. Confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedaleo en un ratón desnudo anestesiado, de 19 a 21 gramos, de ocho a 12 semanas de edad, hembra, homocigoto, desnudo atímico.Inserte la aguja en el pecho a través del espacio intercostal, moviendo la aguja hacia arriba y hacia abajo para evitar el contacto con las costillas. Cuando la punta haya pasado a través del espacio intercostal, coloque la jeringa de modo que se presione contra el ratón e inyecte todo el volumen de células objetivo. Después de la inyección, enrolle el ratón dos o tres veces para extender las células por toda la cavidad torácica, y devuelva el ratón a su jaula con monitoreo hasta la recuperación completa.24 horas después de la inyección celular y todos los días a partir de entonces, inyecte a los ratones anestesiados con células tumorales inyectadas con 200 microlitros de 15 miligramos por mililitro de D-luciferina. Después de 10 minutos, coloque los ratones en un imager de bioluminiscencia y abra el Panel de control de adquisición en el software del imager. Seleccione Luminiscente, Fotografía y Superposición.Establezca el tiempo de exposición en Automático, el Binning en Pequeño, el F/Stop en uno para Luminiscente y en ocho para Fotografía, y el Campo de Visión en C.Click Adquirir para obtener la imagen de la bioluminiscencia. Establezca el formato de visualización en Radianes y seleccione el círculo en las Herramientas de región de interés del panel Paleta de herramientas. Haga clic en Medir regiones de interés para medir la intensidad bioluminiscente de la superficie y utilice Configurar medición para seleccionar los valores relevantes para el experimento.Exporte esta tabla de datos como un archivo csv. A continuación, utilice los valores de flujo total para la cuantificación de la intensidad bioluminiscente en el archivo. Antes de realizar la fototerapia de infrarrojo cercano de los ratones inyectados por tumor, use un medidor de potencia para medir la dosis de luz de un láser de longitud de onda de 690 nanómetros y ajuste la salida a 100 milivatios por centímetro cuadrado.24 horas antes del tratamiento, se inyectaron por vía intravenosa 100 microgramos de fotosensibilizador de anticuerpos conjugados en 50 a 200 microlitros de PBS a través de la vena de la cola del animal inyectado por tumor. El día del tratamiento de fototerapia, coloque el ratón anestesiado conjugado-inyectado, cargado de tumores en posición supina, y proteja los sitios no objetivo con papel de aluminio. Cuando se hayan colocado todos los escudos, use un láser de 100 julios por centímetro cuadrado para irradiar la cavidad torácica con luz infrarroja cercana durante aproximadamente 30 segundos.Cuando la irradiación esté completa y el ratón se haya despertado, devuelva al animal a su jaula y mida la bioluminiscencia diariamente como se ha demostrado. En este análisis representativo, la conjugación del anticuerpo anti-podoplanina con IR700 fue confirmada por el análisis SDS-PAGE. Después de la inyección de células tumorales, se deben realizar imágenes de bioluminiscencia y tomografía por imágenes de luminiscencia difusa para determinar qué ratones expresan suficiente actividad de luciferasa en la cavidad torácica para su posterior estudio.En el quinto día después de la inyección, los ratones inyectados con anticuerpos anti-podoplanina IR700 demuestran una alta fluorescencia IR700 y actividad luciferasa en tumores torácicos, lo que indica que el anticuerpo conjugado IR700 inyectado por vía intravenosa llega a los sitios tumorales pleurales diseminados. En particular, los ratones diseminados pleurales tratados con fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano demuestran una disminución de la actividad de la luciferasa, mientras que las unidades de luz relativas en el grupo de control exhiben un aumento gradual de la intensidad. Dado que la energía de irradiación NIR requerida depende de la línea celular y los anticuerpos, asegúrese de verificar las condiciones con anticipación in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

En vivo en el infrarrojo cercano fluorescencia (NIRF) imagen intravascular molecular de placa inflamatoria, un enfoque multimodal de imágenes de la aterosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

Investigación

Medicina

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Cerca de la tomografía de proyección óptica por infrarrojos para las Evaluaciones de distribución de la masa de células β en Investigación de la Diabetes

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Modelos de ratón para Arteriosclerosis Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Phantoms Tissue-simulación para la evaluación de las posibles aplicaciones de imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano en la cirugía del cáncer de mama

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Ratón Trasplante de Riñón: Modelos de rechazo del aloinjerto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

Alta frecuencia de imágenes por ultrasonido del mouse ganglios linfáticos cervicales

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Imagen Fluorescente combinado del infrarrojo cercano y la tomografía computarizada-Micro para visualizar de manera directa tromboembolia cerebral

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

La bioluminiscencia e infrarrojo cercano de imagen de la neuritis óptica y la inflamación cerebral en el modelo de EAE de esclerosis múltiple en ratones

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Músculo esquelético Neurovascular acoplamiento, capacidad oxidativa y la función Microvascular con espectroscopia del infrarrojo cercano "Una parada tienda"

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...

A New Best Practice for Validating Tail Vein Injections in Rat with Near-infrared-Labeled Agents

Una mejor práctica para la validación de las inyecciones de vena de cola en rata con agentes cerca infrarrojo-marcado con

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part ...