Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

نود أن نشكر أعضاء مختبر أورمان على مساهماتهم القيمة خلال هذه الدراسة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل المعاهد القومية للصحة / NIAID K22AI125468 جائزة الانتقال الوظيفي ومنحة بدء التشغيل في جامعة هيوستن.

1. إعداد متوسط النمو، محلول أوفساسين وأسهم خلايا الإشريكية القولونية
<ol><li>العادية لوريا-بيرتاني (LB) المتوسطة: إضافة 10 غرام / لتر من تريبتون، 10 غرام / لتر من كلوريد الصوديوم (NaCl) و 5 غرام / لتر من استخراج الخميرة في الماء deionized (DI). تعقيم الوسط عن طريق الالاستعباد التلقائي.</li>
	<li>LB أ?...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

تم تطوير المقايسة المستمرة عالية الإنتاجية الموصوفة هنا لتوضيح آثار المواد الكيميائية المختلفة على استمرار الإشريكية القولونية. بالإضافة إلى لوحات PM التجارية، يمكن إنشاء microarrays يدويا كما هو موضح في الخطوة 4.2. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول المعروض هنا مرن ويمكن استخدامه لفحص الميكر...

تحتوي الثقافات البكتيرية على عدد صغير من الخلايا الدائمة التي تتحمل مؤقتا مستويات عالية بشكل غير عادي من المضادات الحيوية. الخلايا Persister متطابقة وراثيا إلى جلودهم الحساسة للمضادات الحيوية، ويعزى بقائهم على قيد الحياة إلى تثبيط النمو العابر1. تم اكتشاف الخلايا Persister لأول مرة من قبل غلاديس هواية2 ولكن تم استخدام هذا المصطلح لأول مرة من قبل جوزيف أكبر عندما حدد لهم في الثقافات المكورات العنقودية المعالجة البنسلين3. اكتشفت دراسة أساسية نشرها بالابان وآخرون4 نوعين من الثبات: المتغيرات من النوع الأول التي تتشكل في المقام الأول عن طريق المرور عبر المرحلة الثابتة، والمتغيرات من النوع الثاني التي يتم إنشاؤها باستمرار خلال النمو الأسي. يتم الكشف عن Persisters من خلال مقايسات البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك، التي تؤخذ عينات الثقافة على فترات مختلفة أثناء العلاج بالمضادات الحيوية، وغسلها، ومطلي على وسيلة نمو نموذجية لحساب الخلايا الناجية التي يمكن أن تستعمر في غياب المضادات الحيوية. يتم تقييم وجود المستمرين في ثقافة الخلية من خلال منحنى قتل ثنائي الطور4،5 حيث يشير الاضمحلال الأسي الأولي إلى وفاة الخلايا الحساسة للمضادات الحيوية. ومع ذلك ، فإن اتجاه القتل ينخفض مع مرور الوقت ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى منطقة هضبة تمثل الخلايا الثامرة الباقية على قيد الحياة.
وقد ارتبطت الخلايا persister مع أمراض مختلفة مثل السل6, التليف الكيسي7, داء المبيضات8 والتهابات المسالك البولية9. تم العثور على جميع الكائنات الحية الدقيقة تقريبا التي تم اختبارها حتى الآن لتوليد الأنماط الظاهرية المستمرة ، بما في ذلك البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض للغاية السل6، المكورات العنقودية أوريوس10، Pseudomonas aeruginosa7 وكانديدا ألبيكانز8. كما تقدم الدراسات الحديثة أدلة على صعود المسوخ المقاومة للأدوية المتعددة من الخلايا الفرعية الدائمة11،12. وقد كشفت الجهود الكبيرة المبذولة في هذا المجال أن آليات الثبات معقدة ومتنوعة للغاية؛ وأن الآليات التي لا يمكن أن تكون أكثر تعقيدا من أي بلد آخر، لا سيما في مجال مكافحة الهجمات، لا سيما في مجال الآليات التي لا يمكن أن تكون لها أهمية في مجال الجهود كل من العوامل العشوائية والحتمية المرتبطة استجابة SOS13،14، أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)15، أنظمة السموم / مضادات السموم (TA)16، autophagy أو الهضم الذاتي17 والاستجابة الصارمة ذات الصلة ppGpp18 معروفة لتسهيل تشكيل أكثر استمرارا.
على الرغم من التقدم الكبير في فهم النمط الظاهري المثابرة ، لم يتم فهم آثار الأوسموليت على الثبات البكتيري بشكل كامل. وبما أن الحفاظ على الضغط التناضحي الأمثل هو ضرورة لنمو الخلايا وحسن سير عملها وبقائها على قيد الحياة، فإن إجراء دراسة متعمقة للنحلات يمكن أن يؤدي إلى أهداف محتملة للاستراتيجيات المضادة للاستمرار. على الرغم من شاقة, فحص عالية الإنتاجية هو نهج فعال جدا لتحديد الأيض والمواد الكيميائية الأخرى التي تلعب دورا حاسما في النمط الظاهري استمرار19,20. في هذا العمل، سنناقش طريقتنا المنشورة19،حيث استخدمنا microarrays، أي 96 لوحة بئر تحتوي على أوزموليتات مختلفة (على سبيل المثال، كلوريد الصوديوم، اليوريا، نيتريت الصوديوم، نترات الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم)، لتحديد الأوسموليت التي تؤثر بشكل كبير على استمرار الإشريكية القولونية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

وتعرف الثوابر البكتيرية بأنها مجموعة فرعية صغيرة من المتغيرات الظاهرية مع القدرة على تحمل تركيزات عالية من المضادات الحيوية. وهي مصدر قلق صحي مهم لأنها ارتبطت بالتهابات مزمنة متكررة. على الرغم من أن الديناميات العشوائية والحتمية للآليات المرتبطة بالإجهاد معروفة بلعب دور كبير في المثابرة ، إلا أن الآليات الكامنة وراء التحول الظاهري إلى / من حالة المثابرة ليست مفهومة تماما. وفي حين أن عوامل الثبات الناجمة عن الإشارات البيئية (مثل استنفاد الكربون والنيتروجين ومصادر الأكسجين) قد درست على نطاق واسع، فإن آثار الأوسموليت على الثبات لم تحدد بعد. باستخدام microarrays (أي 96 لوحات الآبار التي تحتوي على مواد كيميائية مختلفة)، قمنا بتصميم نهج لتوضيح آثار مختلف الأوسموليت على استمرار الإشريكية القولونية بطريقة عالية الإنتاجية. هذا النهج هو تحويلي حيث يمكن تكييفه بسهولة للصفائف الفحص الأخرى، مثل لوحات المخدرات ومكتبات خروج المغلوب الجينات.

الشكل 1 يصف بروتوكولنا التجريبي. وقد اقتبست تجارب دورة التخفيف/النمو (انظر البروتوكول 2) من دراسة أجراها كيرين وآخرون5 للقضاء على الثوام الناشئين عن الثقافات بين عشية وضحاها. الشكل 2A هو صورة تمثيلية من لوحات أجار المستخدمة لتحديد مستويات CFU من ث?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

في ورقة الطريقة هذه، نقدم استراتيجية فحص عالية الإنتاجية لتحديد المركبات الكيميائية، مثل الأوسموليت، التي لها تأثير كبير على الثبات البكتيري.

فحص عالي الإنتاجية للمركبات الكيميائية لتوضيح آثارها على الثبات البكتيري

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

البروتوكول الموصوف هنا يجعل من الممكن تحديد الظروف التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على الثبات البكتيري بطريقة عالية الإنتاجية. هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة مع الشاشة لمختلف المجالات ، مثل لوحات المخدرات ومكتبات الجينات وأكثر من ذلك. وبما أن الطريقة تتضمن خطوات فرعية مختلفة، والتي سيتم إجراؤها في وقت واحد، يمكن أن تساعد العروض البصرية الباحثين على إدارة توقيتهم للحصول على نتائج دقيقة.ابدأ بإعداد ثقافات الخلايا المجهرية. نقل 250 ميكرولتر من خلايا المرحلة الأسية إلى 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة الطازجة في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. ثم خلط بلطف تعليق الخلية لجعلها متجانسة.نقل تعليق الخلية المخففة إلى خزان معقم 50 ملليلتر. باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 150 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة microarray تحتوي على مواد كيميائية مختلفة. يمكن أيضا إنشاء Microarrays يدويا باتباع الطريقة الموضحة في المخطوطة النصية.قم بتغطية لوحة microarray بغشاء سقف نفاذي للغاز واحتضانه في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و250 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. لجعل لوحات الفحص المستمر، وإعداد 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة التي تحتوي على خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من Ofloxacin في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر ونقل هذا المتوسط إلى خزان معقم. نقل 190 ميكرولتر من المتوسط LB المعدلة في كل بئر من لوحة عامة مسطحة أسفل 96 بئر.بعد الحضانة على مدار 24 ساعة ، قم بإزالة microarray من شاكر ونقل 10 ميكرولترات من ثقافات الخلايا من microarray إلى آبار لوحة الفحص المستمر التي تحتوي على متوسط LB معدل مع Ofloxacin. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلايا من لوحة المقال المستمر وتمييعها بشكل متسلسل ثلاث مرات في 290 ميكرولتر من محلول PBS باستخدام لوحة بئر مستديرة أسفل 96 وماصة متعددة القنوات. ثم بقعة 10 ميكرولتر من جميع تعليق الخلايا المخففة تسلسليا على لوحات أجار الطازجة خالية من المضادات الحيوية.قم بتغطية لوحة الفحص المستمرة بغشاء سقف نفاذي للغاز واحتضانه في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية و250 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات. بعد الحضانة لمدة ست ساعات ، كرر التخفيف التسلسلي واكتشاف على لوحات أجار. احتضان لوحات أجار لمدة 16 ساعة في 37 درجة مئوية.ثم عد مستعمرة تشكيل وحدات أو CFUs. استخدم مستويات CFU قبل وبعد ست ساعات من العلاج بالمضادات الحيوية لحساب الكسر المستمر في كل بئر. كما يساعد تعداد CFU قبل علاج OFX في تقييم آثار الأوسموليت على قابلية الإشريكية القولونية للاستمرار.نقل 250 ميكرولتر من خلايا المرحلة الأسية إلى 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة الطازجة التي تحتوي على التناضح التي تم تحديدها من الفحص microarray. احتضان القارورة في شاكر المدارية في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، قم بإزالة القارورة من شاكر ونقل 250 ميكرولتر من ثقافة الخلية إلى 25 ملليلتر من متوسط LB المعدل الطازج في قارورة محيرة 250 ملليلتر.إضافة 25 ميكرولتر من محلول الأسهم Ofloxacin لتعليق الخلية ويهز قارورة بلطف لجعل ثقافة المقايسة متجانسة. احتضان القارورة في شاكر في 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة. في كل ساعة أثناء العلاج، بما في ذلك نقطة زمنية قبل إضافة Ofloxacin، نقل ملليلتر واحد من ثقافة المقايسة من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر وطارد مركزي في 17،000 مرة G لمدة ثلاث دقائق.إزالة 950 ميكرولتر من supernatant وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل النهائي، إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من محلول PBS. خذ 10 ميكرولترات من تعليق الخلية وتمييعها بشكل متسلسل ست مرات مع 90 ميكرولتر من PBS داخل لوحة قاع مستديرة 96 جيدا.بقعة 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا المخففة على لوحة أجار خالية من المضادات الحيوية. لزيادة الحد الأقصى للكشف، لوحة المتبقية 90 ميكرولتر من تعليق الخلية على لوحة أجار الطازجة. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، ثم عد CFUs.تظهر هنا صورة تمثيلية لألواح أجار المستخدمة لتحديد مستويات CFU من ثقافات الخلايا قبل وبعد علاج OFX. العمود الأول هو مجموعة التحكم. ويحتوي العمود الثاني على خلايا تم استزراعها في 100 ملليمولار من نترات الصوديوم ويحتوي العمود الثالث على خلايا تم استزراعها في 60 نترات صوديوم ملليمولار.للبساطة ، يركز اثنان فقط من الأوسموليت هنا. يتم عرض تمثيل رسومي لبيانات CFU من اللوحات والكسور المستمرة من ثقافات الخلايا التي تم اختبارها في 96 لوحة بئر هنا. لحساب الكسور، تم تطبيع العد المستمر لأعداد الخلايا التي تم الحصول عليها قبل العلاج بالمضادات الحيوية.لتوليد منحنيات قتل الطوري، تم استزراع الخلايا في 25 ملليلتر من المتوسط LB المعدلة مع osmolites المشار إليها وقوارير حائرة لمدة 24 ساعة، ثم نقلها إلى قوارير المقايسة استمرت للتعداد المستمر. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن اكتشاف الخلايا على لوحة أجار هو عمل مكثف ويتطلب التركيز. يمكن أن يؤدي الخطأ أثناء الخطوة إلى تلوث متقاطع بين الحالات التي يتم اختبارها.لذلك من المهم ممارسة اكتشاف عينات متعددة في وقت واحد قبل التجربة. بعد هذا البروتوكول، يمكن فحص لوحات المخدرات ومكتبات الخلايا المتحولة لدراسة الآثار على المثابرة. مع هذا الفحص، حددنا عددا من حالات التناضح وال PS التي لها تأثير كبير على الثبات البكتيري.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في<em&gt; البروسيلا</em&gt; إصابة خلايا هيلا

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

بناء منصة فرز الفائق لتقييم عدم تجانس التضخيم الجين HER2 في سرطان الثدي

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن الالتزام البكتيري بالخلايا المضيفة

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...