Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

Vi vil gerne takke medlemmerne af Orman Lab for deres værdifulde input i løbet af denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev finansieret af NIH / NIAID K22AI125468 karriere overgang tildeling og en University of Houston start tilskud.

1. Fremstilling af vækstmedium, loxacinopløsning og E. coli-cellelagre
<ol><li>Almindeligt Luria-Bertani (LB) medium: Tilsæt 10 g/L tryptone, 10 g/l natriumchlorid (NaCl) og 5 g/l gærekstrakt i deioniseret (DI) vand. Steriliser mediet ved autoklavering.</li>
	<li>LB agar plader: Tilsæt 10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g/l gærekstrakt og 15 g/l agar i DI-vand og steriliser mediet ved autoklavering. Ved den ønskede temperatur (~55 °C) hældes ~30 mL agarmedium i firkantede plader (10 x 10...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

Den høje gennemstrømning persister assay beskrevet her blev udviklet for at belyse virkningerne af forskellige kemikalier på E. coli persistens. Ud over kommercielle PM-plader kan mikroarrays konstrueres manuelt som beskrevet i trin 4.2. Desuden er den protokol, der præsenteres her, fleksibel og kan bruges til at screene andre mikroarrays, såsom lægemiddelpaneler og cellebiblioteker, der er i 96 brøndpladeformater. De eksperimentelle forhold, herunder vækstfasen, vaccinationshastigheden og mediet, kan ju...

Bakteriekulturer indeholder en lille delpopulation af persister celler, der er midlertidigt tolerante over for usædvanligt høje niveauer af antibiotika. Persister celler er genetisk identiske med deres antibiotika-følsomme kins, og deres overlevelse er blevet tilskrevet forbigående vækst hæmning1. Persister celler blev først opdaget af Gladys Hobby2, men udtrykket blev først brugt af Joseph Bigger, da han identificerede dem i penicillin-behandlede Staphylococcus pyogenes kulturer3. En skelsættende undersøgelse offentliggjort af Balaban et al.4 opdagede to vedholdende typer: type I-varianter, der primært dannes ved passage gennem den stationære fase, og type II-varianter, der kontinuerligt genereres under eksponentiel vækst. Persisters opdages ved clonogenic overlevelsesanalyser, hvor kulturprøver tages med forskellige intervaller under antibiotikabehandlinger, vaskes og belægges på et typisk vækstmedium for at tælle de overlevende celler, der kan kolonisere i mangel af antibiotika. Eksistensen af persisters i en cellekultur vurderes af en bifasisk kill curve4,5 hvor det oprindelige eksponentielle henfald indikerer antibiotikafølsomme cellers død. Men drabstendensen falder over tid, hvilket i sidste ende fører til et plateauområde, der repræsenterer de overlevende vedholdende celler.
Persisterceller har været forbundet med forskellige sygdomme som tuberkulose6, cystisk fibrose7, candidiasis8 og urinvejsinfektioner9. Næsten alle mikroorganismer, der hidtil er blevet testet, viste sig at generere persister fænotyper, herunder højpatogen Mycobacterium tuberkulose6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 og Candida albicans8. Nylige undersøgelser viser også , at der er fremgangen af multiresistente mutanter fra vedvarende delpopulationer11,12. En betydelig indsats på dette område har vist, at vedholdenhedsmekanismerne er meget komplekse og forskelligartede; både stokastiske og deterministiske faktorer i forbindelse med SOS-respons13,14, reaktive iltarter (ROS)15, toksin-/antitoksinsystemer (TA)16, autofagi eller selvfordøjelse17 og ppGpp-relateret stringentrespons 18 er kendt for at lette persisterdannelsen.
På trods af betydelige fremskridt med at forstå persistens fænotypen er virkningerne af osmolytter på bakteriel persistens ikke blevet fuldt forstået. Da opretholdelsen af optimalt osmotisk tryk er en nødvendighed for cellernes vækst, funktion og overlevelse, kan en dybdegående undersøgelse af osmolytter føre til potentielle mål for anti-persister strategier. Selv om besværlige, høj-gennemstrømning screening er en meget effektiv tilgang til at identificere metabolitter og andre kemikalier, der spiller en afgørende rolle i vedholdenhed fænotype19,20. I dette arbejde vil vi diskutere vores offentliggjorte metode19, hvor vi har brugt mikroarrays, dvs. 96 brøndplader, der indeholder forskellige osmolytter (f.eks. natriumchlorid, urinstof, natriumnitrit, natriumnitrat, kaliumchlorid), for at identificere osmolytter, der har væsentlig indflydelse på E. coli persistens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Bakterie persisters er defineret som en lille delpopulation af fænotypiske varianter med evnen til at tolerere høje koncentrationer af antibiotika. De er et vigtigt sundhedsproblem, da de har været forbundet med tilbagevendende kroniske infektioner. Selv om man ved, at stokastiske og deterministiske dynamikker i stressrelaterede mekanismer spiller en væsentlig rolle i persistensen, forstås de mekanismer, der ligger til grund for det fænotypiske skift til/fra persistenstilstanden, ikke fuldstændigt. Mens vedvarende faktorer udløst af miljøsignaler (f.eks. udtømning af kulstof-, nitrogen- og iltkilder) er blevet grundigt undersøgt, er osmolytternes indvirkning på persistens endnu ikke fastlagt. Ved hjælp af mikroarrays (dvs. 96 brøndplader, der indeholder forskellige kemikalier), har vi designet en tilgang til at belyse virkningerne af forskellige osmolytter på Escherichia coli persistens på en høj gennemløbsmåde. Denne tilgang er transformativ, da den let kan tilpasses til andre screening arrays, såsom lægemiddelpaneler og gen knockout biblioteker.

Figur 1 beskriver vores eksperimentelle protokol. Fortyndings-/vækstcyklusforsøgene (se protokol 2) er blevet tilpasset på basis af en undersøgelse foretaget af Keren et al.5 for at eliminere de vedholdende, der stammer fra dag-til-dag kulturer. Figur 2A er et repræsentativt billede af agarplader, der anvendes til at bestemme CFU-niveauet af cellekulturer før og efter OFX-behandling. I disse forsøg blev cellerne dyrket i modificere...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

I denne metode papir, præsenterer vi en høj-gennemløb screening strategi for at identificere kemiske forbindelser, såsom osmolytter, der har en betydelig indvirkning på bakteriel persistens.

Screening af kemiske forbindelser med høj gennemstrømning for at belyse deres virkninger på bakteriel persistens

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt at identificere forhold, der kan påvirke bakterievedståenhed betydeligt på en højgennekstrømning. Denne metode kan let tilpasses til skærmen for forskellige områder, såsom lægemiddelpaneler, genbiblioteker og meget mere. Da metoden omfatter forskellige undertrin, som skal udføres samtidigt, kan visuel demonstration hjælpe forskere med at styre deres timing for at opnå præcise resultater.Begynd med at forberede mikroarray cellekulturer. Der overføres 250 mikroliter eksponentielle faseceller til 25 milliliter frisk modificeret LB-medium i et 50 milliliter centrifugerør. Bland derefter forsigtigt celleaffjedringen for at gøre den homogen.Overfør den fortyndede celleaffjedring til et sterilt reservoir på 50 milliliter. Ved hjælp af en multikanalpipette overføres 150 mikroliter af celleaffjedringen til hver brønd af en mikroarrayplade, der indeholder forskellige kemikalier. Mikroarrays kan også genereres manuelt efter den metode, der er beskrevet i tekstmanuskriptet.Dæk mikroarraypladen med en gaspermeable loftmembran og inkuber den i en orbital shaker ved 37 grader Celsius og 250 RPM i 24 timer. For at lave vedholdende assayplader skal der fremstilles 25 milliliter modificeret LB-medium, der indeholder fem mikrogram milliliter Ofloxacin i et 50 milliliter centrifugerør, og dette medium overføres til et sterilt reservoir. Overfør 190 mikroliter af det modificerede LB-medium til hver brønd af en generisk flad bund 96 brøndplade.Efter 24 timers inkubation fjernes mikroarrayen fra shakeren og overføres 10 mikroliter cellekulturer fra mikroarray til brøndene på den vedholdende analyseplade, der indeholder modificeret LB-medium med Ofloxacin. Tag 10 mikroliter af celle suspensioner fra den vedholdende essay plade og serielt fortynde det tre gange i 290 mikroliter af PBS opløsning ved hjælp af en rund bund 96 godt plade og en multi-kanal pipette. Derefter spot 10 mikroliter af alle serielt fortyndet celle suspensioner på antibiotikafri frisk agar plader.Dæk den vedholdende analyseplade med en gaspermeable loftmembran og inkuber den i en orbital shaker ved 37 grader Celsius og 250 RPM i seks timer. Efter seks timers inkubation gentages den serielle fortynding og spotting på agarplader. Inkuber agarpladerne i 16 timer ved 37 grader Celsius.Tæl derefter kolonien, der danner enheder eller CFU'er. Brug CFU niveauer før og seks timer efter antibiotika behandling til at beregne den persister fraktion i hver brønd. CFU tæller før OFX-behandlingen hjælper også med at vurdere osmolitternes virkninger på e coli levedygtighed.Der overføres 250 mikroliter eksponentielle faseceller til 25 milliliter frisk modificeret LB-medium, der indeholder den osmolit, der er identificeret fra mikroarrayscreeningen. Kolben inkuberes i en orbital shaker ved 250 RPM og 37 grader Celsius i 24 timer. Efter 24 timer fjernes kolben fra shakeren, og 250 mikroliter af cellekulturen overføres til 25 milliliter frisk modificeret LB-medium i en 250 milliliter forvirret kolbe.Der tilsættes 25 mikroliter ofloxacinbestandsopløsning til celleaffjedringen, og kolben rystes forsigtigt for at gøre analysen homogen. Kolben inkuberes i en shaker ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger. Ved hver time under behandlingen, herunder et tidspunkt før tilsætning af Ofloxacin, overføres en milliliter af analysens kultur fra kolben til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og centrifuge det ved 17.000 gange G i tre minutter.Fjern 950 mikroliter af supernatant og vask cellerne tre gange med 950 mikroliter PBS. Efter den endelige vask suspenderes cellepillen igen i 100 mikroliter PBS-opløsning. Tag 10 mikroliter af celleaffjedringen og fortynd den serielt seks gange med 90 mikroliter PBS inde i en 96 godt rund bundplade.Spot 10 mikroliter af de fortyndede celle suspensioner på en antibiotikafri agar plade. For at øge detektionsgrænsen skal de resterende 90 mikroliter celleaffjedring på en frisk agarpladepladen øges. Inkubat pladerne ved 37 grader Celsius i 16 timer, og tæl derefter CFU'er.Et repræsentativt billede af agarplader, der bruges til at bestemme CFU-niveauer af cellekulturer før og efter OFX-behandling, vises her. Den første kolonne er kontrolgruppen. Den anden kolonne har celler, der blev dyrket i 100 millimolar natriumnitrat og den tredje kolonne indeholder celler, der blev dyrket i 60 millimolar natriumnitrat.For enkelhed er kun to osmolitter fokuseret på her. En grafisk repræsentation af CFU-data fra plader og vedholdende fraktioner af cellekulturerne testet i 96 brøndplader vises her. For at beregne fraktionerne blev persistertællingerne normaliseret til de celletællinger, der blev opnået før antibiotikabehandlingen.For at generere bifasiske aflivningskurver blev cellerne dyrket i 25 milliliter modificeret LB-medium med de angivne osmolitter og forvirrede kolber i 24 timer og derefter overført til vedholdende assaykolber til vedvarende optælling. Når du forsøger denne protokol, skal du huske, at det er arbejdskrævende at spotte cellerne på agarpladen og kræver fokus. En fejl under trinnet kan føre til krydskontaminering blandt de forhold, der testes.Så det er vigtigt at øve sig i at spotte flere prøver samtidigt før eksperimentet. Efter denne protokol kan lægemiddelpaneler og mutantcellebiblioteker screenes for at studere virkningerne på persistensen. Med denne screening har vi identificeret en række osmolitter og PS-tilstande, der har en betydelig indvirkning på bakteriel persistens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Højkapacitetsforskning encellede cytotoksicitetsassay for T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En Microplade Assay til vurdering af kemiske Virkninger på RBL-2H3 mastcelledegranulering: Effekter af Triclosan uden brug af et organisk opløsningsmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi assays for high-throughput screening af Host faktorer involveret i<em&gt; Brucella</em&gt; Infektion af HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En Fluorescens-baserede lymfocyt Assay Egnet til high-throughput screening af små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Opbygge en høj overførselshastighed Screening Platform til at vurdere heterogenitet af HER2 genet forstærkning i brystkræft

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høj overførselshastighed Platform for Screening af Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høj overførselshastighed Shigella-specifikke bakteriedræbende Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Automatiseret, høj-gennemløbsdetektering af bakteriel overholdelse af værtsceller

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...