Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

We willen de leden van Orman Lab bedanken voor hun waardevolle inbreng tijdens dit onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door de NIH/NIAID K22AI125468 career transition award en een University of Houston startup grant.

1. Bereiding van groeimedium, ofloxacineoplossing en E. coli-celvoorraden
<ol><li>Normaal Luria-Bertani (LB) medium: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L natriumchloride (NaCl) en 5 g/L gistextract toe in gedeïoniseerd (DI) water. Steriliseer het medium door autoclaaf.</li>
	<li>LB agar platen: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 15 g/L agar toe aan DI water en steriliseer het medium door autoclaaf. Giet bij de gewenste temperatuur (~55 °C) ~30 ml agar medium in vierkante platen (1...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

De hier beschreven persistentietest met hoge doorvoer is ontwikkeld om de effecten van verschillende chemicaliën op de persistentie van E. coli te verduidelijken. Naast commerciële PM-platen kunnen microarrays handmatig worden geconstrueerd zoals beschreven in stap 4.2. Bovendien is het hier gepresenteerde protocol flexibel en kan het worden gebruikt om andere microarrays te screenen, zoals medicijnpanelen en celbibliotheken, die in 96 putplaatformaten zijn. De experimentele omstandigheden, waaronder de groeif...

Bacteriële culturen bevatten een kleine subpopulatie van persistente cellen die tijdelijk tolerant zijn voor ongewoon hoge niveaus van antibiotica. Persistentiecellen zijn genetisch identiek aan hun antibioticagevoelige verwanten en hun overleving is toegeschreven aan voorbijgaande groeiremming1. Persistercellen werden voor het eerst ontdekt door Gladys Hobby2, maar de term werd voor het eerst gebruikt door Joseph Bigger toen hij ze identificeerde in met penicilline behandelde Staphylococcus pyogenesculturen 3. Een baanbrekende studie gepubliceerd door Balaban et al.4 ontdekte twee persistentietypen: type I-varianten die voornamelijk worden gevormd door passage door de stationaire fase, en type II-varianten die continu worden gegenereerd tijdens de exponentiële groei. Persistenten worden gedetecteerd door clonogene overlevingstesten, waarbij kweekmonsters met verschillende tussenpozen worden genomen tijdens antibioticabehandelingen, gewassen en geplateerd op een typisch groeimedium om de overlevende cellen te tellen die kunnen koloniseren bij afwezigheid van antibiotica. Het bestaan van persistenten in een celkweek wordt beoordeeld door een bifasische kill curve4,5 waarbij het initiële exponentiële verval wijst op de dood van antibioticagevoelige cellen. De moordtrend neemt echter in de loop van de tijd af, wat uiteindelijk leidt tot een plateaugebied dat de overlevende persistentiecellen vertegenwoordigt.
Persistercellen zijn geassocieerd met verschillende ziekten zoals tuberculose6, cystische fibrose7, candidiasis8 en urineweginfecties9. Bijna alle tot nu toe geteste micro-organismen bleken persistenterfenotypes te genereren, waaronder hoogpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 en Candida albicans8. Recente studies leveren ook bewijs voor de opkomst van multidrugresistente mutanten uit persistenter subpopulaties11,12. Uit aanzienlijke inspanningen op dit gebied is gebleken dat persistentiemechanismen zeer complex en divers zijn; van zowel stochastische als deterministische factoren geassocieerd met de SOS-respons13,14, reactieve zuurstofsoorten (ROS)15, toxine/antitoxine (TA) systemen16, autofagie of zelfvertering17 en ppGpp-gerelateerde strenge respons18 is bekend dat persistentievorming wordt vergemakkelijkt.
Ondanks aanzienlijke vooruitgang bij het begrijpen van het persistentiefenotype, zijn de effecten van osmolyten op bacteriële persistentie niet volledig begrepen. Aangezien het behoud van optimale osmotische druk een noodzaak is voor de groei, goede werking en overleving van cellen, kan een diepgaande studie van osmolyten leiden tot potentiële doelwitten voor anti-persisterstrategieën. Hoewel moeizame screening met hoge doorvoer een zeer effectieve benadering is voor het identificeren van metabolieten en andere chemische stoffen die een cruciale rol spelen in de persistentie fenotype19,20. In dit werk zullen we onze gepubliceerde methode19bespreken , waarbij we microarrays hebben gebruikt, d.w.z. 96 putplaten die verschillende osmolyten bevatten (bijv. natriumchloride, ureum, natriumnitriet, natriumnitraat, kaliumchloride), om osmolyten te identificeren die de persistentie van E. coli aanzienlijk beïnvloeden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Bacteriële persistenten worden gedefinieerd als een kleine subpopulatie van fenotypische varianten met het vermogen om hoge concentraties antibiotica te tolereren. Ze zijn een belangrijk gezondheidsprobleem omdat ze zijn geassocieerd met terugkerende chronische infecties. Hoewel bekend is dat stochastische en deterministische dynamiek van stressgerelateerde mechanismen een belangrijke rol speelt bij persistentie, worden mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische switch van/naar de persistentietoestand niet volledig begrepen. Hoewel persistentiefactoren die worden veroorzaakt door omgevingssignalen (bijv. uitputting van koolstof-, stikstof- en zuurstofbronnen) uitgebreid zijn bestudeerd, moeten de effecten van osmolyten op persistentie nog worden bepaald. Met behulp van microarrays (d.w.z. 96 putplaten met verschillende chemicaliën) hebben we een aanpak ontworpen om de effecten van verschillende osmolyten op escherichia coli persistentie op een hoge doorvoer manier op te helderen. Deze aanpak is transformerend omdat het gemakkelijk kan worden aangepast voor andere screeningarrays, zoals medicijnpanels en gen knock-outbibliotheken.

Figuur 1 beschrijft ons experimentele protocol. De verdunnings-/groeicyclusexperimenten (zie Protocol 2) werden aangepast aan een studie uitgevoerd door Keren et al.5 om de persistenten afkomstig van de nachtelijke culturen te elimineren. Figuur 2A is een representatief beeld van agarplaten die worden gebruikt om CFU-niveaus van celculturen voor en na OFX-behandeling te bepalen. In deze experimenten werden cellen gekweekt in gemodificeerd...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.

High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om omstandigheden te identificeren die een aanzienlijke invloed kunnen hebben op de bacteriële persistentie op een manier met hoge doorvoer. Deze methode is gemakkelijk aan te passen aan het scherm voor verschillende gebieden, zoals medicijnpanelen, genbibliotheken en meer. Omdat de methode verschillende substappen omvat, die tegelijkertijd moeten worden uitgevoerd, kan visuele demonstratie onderzoekers helpen om hun timing te beheren om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.Begin met het voorbereiden van microarray celculturen. Breng 250 microliter exponentiële fasecellen over naar 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Meng vervolgens voorzichtig de celsuspensie om deze homogeen te maken.Breng de verdunde celsuspensie over in een steriel reservoir van 50 milliliter. Breng met behulp van een meerkanaals pipet 150 microliters van de celsuspensie over naar elke put van een microarrayplaat die verschillende chemicaliën bevat. Microarrays kunnen ook handmatig worden gegenereerd volgens de methode die in het teksthandschrift wordt beschreven.Bedek de microarrayplaat met een gasdoorlatend plafondmembraan en incubeer deze gedurende 24 uur in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Om persistenter testplaten te maken, bereidt u 25 milliliter gemodificeerd LB-medium met vijf microgram per milliliter Ofloxacine in een centrifugebuis van 50 milliliter en brengt u dit medium over in een steriel reservoir. Breng 190 microliters van het gemodificeerde LB-medium over in elke put van een generieke vlakke bodem 96 putplaat.Verwijder na de incubatie van 24 uur de microarray uit de shaker en breng 10 microliters celculturen over van de microarray naar de putten van de persistentertestplaat die gemodificeerd LB-medium met Ofloxacine bevat. Neem 10 microliters celsuspensingen uit de persister essayplaat en verdun deze drie keer in 290 microliters PBS-oplossing met behulp van een ronde bodem 96 putplaat en een meerkanaals pipet. Spot vervolgens 10 microliters van alle serieel verdunde celsuspensusingen op antibioticavrije verse agarplaten.Bedek de persistentertestplaat met een gasdoorlatend plafondmembraan en incubeer deze zes uur lang in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Herhaal na de incubatie van zes uur de seriële verdunning en het spotten op agarplaten. Incubeer de agarplaten gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius.Tel dan de kolonievormende eenheden of CFUs. Gebruik de CFU-spiegels vóór en zes uur na de antibioticabehandeling om de persistentiefractie in elke put te berekenen. De CFU telt voordat de OFX-behandeling ook helpt bij het beoordelen van de effecten van osmolieten op de levensvatbaarheid van e coli.Breng 250 microliter exponentiële fasecellen over naar 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium met de osmoliet die is geïdentificeerd uit de microarrayscreening. Incubeer de kolf in een orbitale shaker bij 250 RPM en 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Verwijder na 24 uur de kolf uit de shaker en breng 250 microliter van de celkweek over op 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 milliliter.Voeg 25 microliters Ofloxacine-bouillonoplossing toe aan de celsuspensie en schud de kolf zachtjes om de testcultuur homogeen te maken. Incubeer de kolf in een shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Breng elk uur tijdens de behandeling, inclusief een tijdstip voor toevoeging van Ofloxacine, één milliliter van de testkweek over van de kolf naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer deze gedurende drie minuten op 17.000 maal G.Verwijder 950 microliter supernatant en was de cellen driemaal met 950 microliter PBS. Na de laatste wasbeurt de celkorrel opnieuw opschorten in 100 microliter PBS-oplossing. Neem 10 microliters van de celsuspensie en verdun deze zes keer serieel met 90 microliters PBS in een 96 goed ronde bodemplaat.Spot 10 microliters van de verdunde celsuspensussingen op een antibioticavrije agarplaat. Om de detectielimiet te verhogen, plaat de resterende 90 microliters celsuspensie op een verse agarplaat. Incubeer de platen gedurende 16 uur op 37 graden Celsius en tel cfus.Een representatief beeld van agarplaten die worden gebruikt om CFU-niveaus van celculturen voor en na OFX-behandeling te bepalen, wordt hier weergegeven. De eerste kolom is de controlegroep. De tweede kolom bevat cellen die zijn gekweekt in 100 millimolair natriumnitraat en de derde kolom bevat cellen die zijn gekweekt in 60 millimolair natriumnitraat.Voor de eenvoud zijn hier slechts twee osmolieten op gericht. Een grafische weergave van de CFU-gegevens van de platen en persistenterfracties van de celculturen getest in 96 putplaten worden hier weergegeven. Om de fracties te berekenen, werden persistentertellingen genormaliseerd tot de celtellingen die vóór de antibioticabehandeling werden verkregen.Om byphasic kill curves te genereren, werden de cellen gedurende 24 uur gekweekt in 25 milliliter gemodificeerd LB-medium met de aangegeven osmolieten en verbijsterde kolven, en vervolgens overgebracht naar persistenter assay flasks voor persistenter enumeration. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het spotten van de cellen op agarplaat arbeidsintensief is en focus vereist. Een fout tijdens de stap kan leiden tot kruisbesmetting onder de geteste omstandigheden.Het is dus belangrijk om voorafgaand aan het experiment te oefenen met het spotten van meerdere monsters tegelijk. Volgens dit protocol kunnen medicijnpanels en mutante celbibliotheken worden gescreend om de effecten op de persistentie te bestuderen. Met deze screening hebben we een aantal osmolieten en PS-condities geïdentificeerd die een significante impact hebben op bacteriële persistentie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in<em&gt; Brucella</em&gt; Infectie van Hela cellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Het opbouwen van een High-throughput Screening Platform te beoordelen van de heterogeniteit van de HER2-gen Amplification in kanker van de borst

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...