Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
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Nous tenons à remercier les membres d’Orman Lab pour leurs précieuses contributions au cours de cette étude. Cette étude a été financée par le nih/niaid K22AI125468 prix de transition de carrière et une subvention de démarrage de l’Université de Houston.

1. Préparation du milieu de croissance, de la solution d’ofloxacine et des stocks de cellules D’E. coli
<ol><li>Milieu régulier Luria-Bertani (LB) : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de chlorure de sodium (NaCl) et 5 g/L d’extrait de levure dans de l’eau désionisée (DI). Stériliser le milieu par autoclavage.</li>
	<li>Plaques de gélose LB : Ajouter 10 g/L de tryptone, 10 g/L de NaCl, 5 g/L d’extrait de levure et 15 g/L de gélose dans de l’eau DI et stériliser le milieu par...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

L’essai de persistance à haut débit décrit ici a été mis au point pour élucider les effets de divers produits chimiques sur la persistance de E. coli. En plus des plaques de particules commerciales, les puces à ADN peuvent être construites manuellement comme décrit à l’étape 4.2. De plus, le protocole présenté ici est flexible et peut être utilisé pour filtrer d’autres puces à ADN, telles que les panneaux de médicaments et les bibliothèques cellulaires, qui sont dans 96 formats de plaques...

Les cultures bactériennes contiennent une petite sous-population de cellules persistantes qui sont temporairement tolérantes à des niveaux anormalement élevés d’antibiotiques. Les cellules persistantes sont génétiquement identiques à leurs parents sensibles aux antibiotiques, et leur survie a été attribuée à l’inhibition transitoire de la croissance1. Les cellules persistantes ont été découvertes pour la première fois par Gladys Hobby2, mais le terme a été utilisé pour la première fois par Joseph Bigger lorsqu’il les a identifiées dans des cultures de Staphylococcus pyogenes traitées à la pénicilline3. Une étude séminale publiée par Balaban et al.4 a découvert deux types de persister : les variantes de type I qui sont principalement formées par le passage à travers la phase stationnaire, et les variantes de type II qui sont continuellement générées pendant la croissance exponentielle. Les persistants sont détectés par des tests de survie clonogènes, dans lesquels des échantillons de culture sont prélevés à divers intervalles pendant les traitements antibiotiques, lavés et plaqués sur un milieu de croissance typique pour compter les cellules survivantes qui peuvent coloniser en l’absence d’antibiotiques. L’existence de persisters dans une culture cellulaire est évaluée par une courbe de mise à mort biphasique4,5 où la décroissance exponentielle initiale indique la mort des cellules sensibles aux antibiotiques. Cependant, la tendance à tuer diminue au fil du temps, conduisant éventuellement à une région de plateau qui représente les cellules persistantes survivantes.
Les cellules persistantes ont été associées à diverses maladies telles que la tuberculose6,la mucoviscidose7,la candidose8 et les infections des voies urinaires9. Presque tous les micro-organismes testés jusqu’à présent se sont avérés pour générer des phénotypes persistants, y compris mycobacterium tuberculosishautement pathogène6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 et Candida albicans8. Des études récentes fournissent également des preuves de l’augmentation des mutants multirésistants dans les sous-populations persistantes11,12. Des efforts considérables dans ce domaine ont révélé que les mécanismes de persistance sont très complexes et divers; des facteurs stochastiques et déterministes associés à la réponse SOS13,14,aux espèces réactives de l’oxygène (ROS)15,aux systèmes toxine/antitoxine (TA)16,à l’autophagie ou à l’auto-digestion17 et à la réponse stricte liée au ppGpp18 sont connus pour faciliter la formation de persister.
Malgré des progrès significatifs dans la compréhension du phénotype de persistance, les effets des osmolytes sur la persistance bactérienne n’ont pas été entièrement compris. Étant donné que le maintien d’une pression osmotique optimale est une nécessité pour la croissance, le bon fonctionnement et la survie des cellules, une étude approfondie des osmolytes pourrait conduire à des cibles potentielles pour les stratégies anti-persister. Bien que laborieux, le criblage à haut débit est une approche très efficace pour identifier les métabolites et autres produits chimiques qui jouent un rôle crucial dans le phénotype de persistance19,20. Dans ce travail, nous discuterons de notre méthode publiée19, où nous avons utilisé des puces à ADN, c’est-à-dire 96 plaques de puits contenant divers osmolytes (par exemple, chlorure de sodium, urée, nitrite de sodium, nitrate de sodium, chlorure de potassium), pour identifier les osmolytes qui influencent considérablement la persistance de E. coli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Les bactéries persistantes sont définies comme une petite sous-population de variantes phénotypiques ayant la capacité de tolérer des concentrations élevées d’antibiotiques. Ils constituent un problème de santé important, car ils ont été associés à des infections chroniques récurrentes. Bien que la dynamique stochastique et déterministe des mécanismes liés au stress soit connue pour jouer un rôle significatif dans la persistance, les mécanismes sous-jacents au passage phénotypique à/de l’état de persistance ne sont pas complètement compris. Bien que les facteurs de persistance déclenchés par les signaux environnementaux (p. ex. épuisement des sources de carbone, d’azote et d’oxygène) aient fait l’objet d’études approfondies, les effets des osmolytes sur la persistance n’ont pas encore été déterminés. À l’aide de puces à ADN (c.-à-d. 96 plaques de puits contenant divers produits chimiques), nous avons conçu une approche pour élucider les effets de divers osmolytes sur la persistance d’Escherichia coli de manière à haut débit. Cette approche est transformatrice car elle peut être facilement adaptée à d’autres réseaux de dépistage, tels que les panels de médicaments et les bibliothèques de gènes knock-out.

La figure 1 décrit notre protocole expérimental. Les expériences sur le cycle de dilution/croissance (voir protocole 2) ont été adaptées d’une étude menée par Keren et al.5 pour éliminer les persistants provenant des cultures nocturnes. La figure 2A est une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux d’UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement ofx. Dans ces expérience...

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High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Dans ce document de méthode, nous présentons une stratégie de criblage à haut débit pour identifier les composés chimiques, tels que les osmolytes, qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.

Criblage à haut débit des composés chimiques pour élucider leurs effets sur la persistance bactérienne

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Le protocole décrit ici permet d’identifier les conditions qui peuvent avoir un impact significatif sur la persistance bactérienne de manière à haut débit. Cette méthode est facilement adaptable pour dépister divers domaines, tels que les panels de médicaments, les bibliothèques de gènes et plus encore. Comme la méthode comprend diverses sous-étapes, qui doivent être menées simultanément, la démonstration visuelle peut aider les chercheurs à gérer leur calendrier pour obtenir des résultats précis.Commencez par préparer des cultures de cellules de puces à ADN. Transférer 250 microlitres de cellules de phase exponentielle à 25 millilitres de milieu LB modifié frais dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. Ensuite, mélangez doucement la suspension cellulaire pour la rendre homogène.Transférer la suspension de cellules diluées dans un réservoir stérile de 50 millilitres. À l’aide d’une pipette multicanal, transférer 150 microlitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de microréseau contenant divers produits chimiques. Les puces à ADN peuvent également être générées manuellement en suivant la méthode décrite dans le manuscrit de texte.Couvrez la plaque de microréseau avec une membrane de plafond perméable aux gaz et incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 250 tr / min pendant 24 heures. Pour fabriquer des plaques d’analyse de persister, préparer 25 millilitres de milieu LB modifié contenant cinq microgrammes par millilitre d’ofloxacine dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et transférer ce milieu dans un réservoir stérile. Transférer 190 microlitres du milieu LB modifié dans chaque puits d’une plaque générique à fond plat de 96 puits.Après l’incubation de 24 heures, retirer le microréseau du shaker et transférer 10 microlitres de cultures cellulaires du microréseau vers les puits de la plaque d’essai du persister contenant du milieu LB modifié avec de l’ofloxacine. Prenez 10 microlitres de suspensions cellulaires de la plaque d’essai du persister et diluez-la en série trois fois dans 290 microlitres de solution PBS à l’aide d’une plaque de puits à fond rond de 96 et d’une pipette multicanal. Ensuite, repérez 10 microlitres de toutes les suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques de gélose fraîche sans antibiotiques.Couvrez la plaque d’essai du persister avec une membrane de plafond perméable aux gaz et incuber dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et 250 tr / min pendant six heures. Après l’incubation de six heures, répéter la dilution en série et le repérage sur les plaques de gélose. Incuber les plaques de gélose pendant 16 heures à 37 degrés Celsius.Comptez ensuite les unités formant colonies ou UFC. Utilisez les niveaux d’UFC avant et six heures après le traitement antibiotique pour calculer la fraction persistante dans chaque puits. Le dénombrement de l’UFC avant le traitement ofx aide également à évaluer les effets des osmolites sur la viabilité d’E coli.Transférer 250 microlitres de cellules de phase exponentielle à 25 millilitres de milieu LB modifié frais contenant l’osmolite identifiée à partir du criblage de microréseau. Incuber le ballon dans un agitateur orbital à 250 tr/min et 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après 24 heures, retirer le ballon du agitateur et transférer 250 microlitres de la culture cellulaire dans 25 millilitres de milieu LB modifié frais dans une fiole déconcertée de 250 millilitres.Ajouter 25 microlitres de solution mère d’ofloxacine à la suspension cellulaire et agiter doucement le ballon pour rendre la culture d’essai homogène. Incuber le ballon dans un agitateur à 37 degrés Celsius et 250 tr / min. À chaque heure pendant le traitement, y compris un point de temps avant l’addition d’ofloxacine, transférer un millilitre de la culture d’essai du ballon dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 millilitre et le centrifuger à 17 000 fois G pendant trois minutes.Retirer 950 microlitres de surnageant et laver les cellules trois fois avec 950 microlitres de PBS. Après le lavage final, re-suspendre le culot cellulaire dans 100 microlitres de solution de PBS. Prenez 10 microlitres de la suspension cellulaire et diluez-la en série six fois avec 90 microlitres de PBS à l’intérieur d’une plaque inférieure ronde de 96 puits.Repérez 10 microlitres des suspensions de cellules diluées sur une plaque de gélose sans antibiotiques. Pour augmenter la limite de détection, plaquez les 90 microlitres restants de suspension cellulaire sur une plaque de gélose fraîche. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 16 heures, puis compter les UFC.Une image représentative des plaques de gélose utilisées pour déterminer les niveaux de UFC des cultures cellulaires avant et après le traitement OFX est montrée ici. La première colonne est le groupe témoin. La deuxième colonne contient des cellules qui ont été cultivées dans du nitrate de sodium 100 millimolaire et la troisième colonne contient des cellules qui ont été cultivées dans du nitrate de sodium 60 millimolaire.Par souci de simplicité, seuls deux osmolites sont ciblés ici. Une représentation graphique des données de l’UFC provenant des plaques et des fractions persistantes des cultures cellulaires testées dans 96 plaques de puits est présentée ici. Pour calculer les fractions, les comptes de persister ont été normalisés aux comptes de cellules obtenus avant le traitement antibiotique.Pour générer des courbes de mise à mort aléatoires, les cellules ont été cultivées dans 25 millilitres de milieu LB modifié avec les osmolites indiquées et les flacons déconcertés pendant 24 heures, puis transférées dans des flacons d’essai de persister pour le dénombrement de persister. En essayant ce protocole, gardez à l’esprit que repérer les cellules sur la plaque de gélose est laborieux et nécessite une concentration. Une erreur au cours de l’étape peut entraîner une contamination croisée entre les conditions testées.Il est donc important de s’entraîner à repérer plusieurs échantillons simultanément avant l’expérience. Suivant ce protocole, les panels de médicaments et les bibliothèques de cellules mutantes peuvent être examinés pour étudier les impacts sur la persistance. Grâce à ce dépistage, nous avons identifié un certain nombre d’osmolites et d’affections de SP qui ont un impact significatif sur la persistance bactérienne.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

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Immunologie et infection

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d&#39;un solvant organique

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l&#39;ARN virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit afin d’évaluer l’hétérogénéité d’Amplification de gène HER2 dans les Cancers du sein

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Détection automatisée et à haut débit de l’adhérence bactérienne aux cellules hôtes

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...