Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
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Wir danken den Mitgliedern des Orman Lab für ihre wertvollen Beiträge während dieser Studie. Diese Studie wurde durch den NIH / NIAID K22AI125468 Career Transition Award und ein Startup-Stipendium der University of Houston finanziert.

1. Herstellung von Wachstumsmedium, Ofloxacinlösung und E. coli-Zellbeständen
<ol><li>Normales Luria-Bertani (LB) Medium: Fügen Sie 10 g / L Trypton, 10 g / L Natriumchlorid (NaCl) und 5 g / L Hefeextrakt in entionisiertem (DI) Wasser hinzu. Sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren.</li>
	<li>LB-Agarplatten: Fügen Sie 10 g / L Trypton, 10 g / L NaCl, 5 g / L Hefeextrakt und 15 g / L Agar in DI-Wasser hinzu und sterilisieren Sie das Medium durch Autoklavieren. Bei der gewünschten T...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

Der hier beschriebene Hochdurchsatz-Persister-Assay wurde entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Chemikalien auf die Persistenz von E. coli aufzuklären. Zusätzlich zu kommerziellen PM-Platten können Microarrays manuell konstruiert werden, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Darüber hinaus ist das hier vorgestellte Protokoll flexibel und kann verwendet werden, um andere Microarrays wie Drug Panels und Zellbibliotheken zu screenen, die in 96 Well-Plate-Formaten vorliegen. Die experimentellen Bedingungen ein...

Bakterienkulturen enthalten eine kleine Subpopulation von Persisterzellen, die vorübergehend tolerant gegenüber ungewöhnlich hohen Antibiotikaspiegeln sind. Persisterzellen sind genetisch identisch mit ihren antibiotikaempfindlichen Verwandten, und ihr Überleben wurde der vorübergehenden Wachstumshemmung zugeschrieben1. Persisterzellen wurden zuerst von Gladys Hobby2 entdeckt, aber der Begriff wurde zuerst von Joseph Bigger verwendet, als er sie in Penicillin-behandelten Staphylococcus pyogenes-Kulturen identifizierte3. Eine bahnbrechende Studie, die von Balaban et al.4 veröffentlicht wurde, entdeckte zwei Persistertypen: Typ-I-Varianten, die hauptsächlich durch die Passage durch die stationäre Phase gebildet werden, und Typ-II-Varianten, die während des exponentiellen Wachstums kontinuierlich erzeugt werden. Persister werden durch klonogene Überlebenstests nachgewiesen, bei denen Während der Antibiotikabehandlung in verschiedenen Abständen Kulturproben entnommen, gewaschen und auf einem typischen Wachstumsmedium plattiert werden, um die überlebenden Zellen zu zählen, die sich ohne Antibiotika ansiedeln können. Die Existenz von Persistern in einer Zellkultur wird durch eine biphasische Tötungskurve4,5 beurteilt,wobei der anfängliche exponentielle Zerfall den Tod antibiotikaempfindlicher Zellen anzeigt. Der Tötungstrend nimmt jedoch im Laufe der Zeit ab, was schließlich zu einer Plateauregion führt, die die überlebenden Persisterzellen darstellt.
Persisterzellen wurden mit verschiedenen Krankheiten wie Tuberkulose6, Mukoviszidose7, Candidiasis8 und Harnwegsinfektionen9 inVerbindung gebracht . Fast alle bisher getesteten Mikroorganismen erzeugen persistere Phänotypen, darunter hochpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 und Candida albicans8. Neuere Studien liefern auch Hinweise auf den Anstieg multiresistenter Mutanten aus persisteren Subpopulationen11,12. Erhebliche Anstrengungen in diesem Bereich haben gezeigt, dass Persistenzmechanismen sehr komplex und vielfältig sind; Es istbekannt,dass sowohl stochastische als auch deterministische Faktoren, die mit der SOS-Reaktion13,14, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)15, Toxin/Antitoxin (TA) -Systemen16, Autophagie oder Selbstverdauung17 und ppGpp-bezogener strenger Reaktion18 verbunden sind, die Persisterbildung erleichtern.
Trotz signifikanter Fortschritte beim Verständnis des Persistenzphänotyps sind die Auswirkungen von Osmolyten auf die bakterielle Persistenz nicht vollständig verstanden. Da die Aufrechterhaltung eines optimalen osmotischen Drucks eine Notwendigkeit für das Wachstum, die ordnungsgemäße Funktion und das Überleben der Zellen ist, könnte eine eingehende Untersuchung von Osmolyten zu potenziellen Zielen für Anti-Persister-Strategien führen. Obwohl mühsam, ist das Hochdurchsatz-Screening ein sehr effektiver Ansatz zur Identifizierung von Metaboliten und anderen Chemikalien, die eine entscheidende Rolle bei der Persistenz des Phänotyps19,20spielen. In dieser Arbeit werden wir unsere veröffentlichte Methode19diskutieren, bei der wir Microarrays verwendet haben, dh 96 Wellplatten, die verschiedene Osmolyte enthalten (z. B. Natriumchlorid, Harnstoff, Natriumnitrit, Natriumnitrat, Kaliumchlorid), um Osmolyte zu identifizieren, die die Persistenz von E. coli signifikant beeinflussen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Bakterielle Persister sind definiert als eine kleine Subpopulation phänotypischer Varianten mit der Fähigkeit, hohe Konzentrationen von Antibiotika zu vertünden. Sie sind ein wichtiges Gesundheitsproblem, da sie mit wiederkehrenden chronischen Infektionen in Verbindung gebracht wurden. Obwohl bekannt ist, dass stochastische und deterministische Dynamiken stressbezogener Mechanismen eine bedeutende Rolle bei der Persistenz spielen, sind die Mechanismen, die dem phänotypischen Wechsel zum/vom Persistenzzustand zugrunde liegen, nicht vollständig verstanden. Während Persistenzfaktoren, die durch Umweltsignale ausgelöst werden (z. B. Erschöpfung von Kohlenstoff-, Stickstoff- und Sauerstoffquellen), umfassend untersucht wurden, müssen die Auswirkungen von Osmolyten auf die Persistenz noch bestimmt werden. Mit Microarrays (d.h. 96 Brunnenplatten, die verschiedene Chemikalien enthalten) haben wir einen Ansatz entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Osmolyte auf die Persistenz von Escherichia coli mit hohem Durchsatz aufzuklären. Dieser Ansatz ist transformativ, da er leicht für andere Screening-Arrays wie Arzneimittelpanels und Gen-Knockout-Bibliotheken angepasst werden kann.

Abbildung 1 beschreibt unser experimentelles Protokoll. Die Verdünnungs-/Wachstumszyklusexperimente (siehe Protokoll 2) wurden aus einer Studie von Keren et al.5 adaptiert, um die Persister aus den Nachtkulturen zu eliminieren. Abbildung 2A ist ein repräsentatives Bild von Agarplatten, die zur Bestimmung des KBE-Gehalts von Zellkulturen vor und nach der OFX-Behandlung verwendet werden. In diesen Experimenten wurden Zellen in modifiziert...

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High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

In diesem Methodenpapier stellen wir eine Hochdurchsatz-Screening-Strategie vor, um chemische Verbindungen wie Osmolyte zu identifizieren, die einen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Persistenz haben.

Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es, Zustände zu identifizieren, die die bakterielle Persistenz in hoher Durchsatzweise erheblich beeinflussen können. Diese Methode ist leicht an das Screening für verschiedene Bereiche wie Arzneimittelpanels, Genbibliotheken und mehr anpassbar. Da die Methode verschiedene Teilschritte umfasst, die gleichzeitig durchgeführt werden sollen, kann die visuelle Demonstration den Forschern helfen, ihr Timing zu verwalten, um präzise Ergebnisse zu erhalten.Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Microarray-Zellkulturen. 250 Mikroliter exponentieller Phasenzellen in 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen. Dann mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, um sie homogen zu machen.Die verdünnte Zellsuspension wird in ein steriles 50-Milliliter-Reservoir überführen. Übertragen Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Microarray-Platte, die verschiedene Chemikalien enthält. Microarrays können auch manuell nach der im Textmanuskript beschriebenen Methode generiert werden.Decken Sie die Microarray-Platte mit einer gasdurchlässigen Deckenmembran ab und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U/min. Um Persister-Assay-Platten herzustellen, bereiten Sie 25 Milliliter modifiziertes LB-Medium mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Ofloxacin in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor und übertragen Sie dieses Medium in ein steriles Reservoir. 190 Mikroliter des modifizierten LB-Mediums in jede Vertiefung einer generischen flachen Bodenplatte mit 96 Well geben.Nach der 24-stündigen Inkubation entfernen Sie das Microarray aus dem Shaker und übertragen 10 Mikroliter Zellkulturen aus dem Microarray in die Vertiefungen der Persister-Assay-Platte, die modifiziertes LB-Medium mit Ofloxacin enthält. Nehmen Sie 10 Mikroliter Zellsuspensionen von der Persister-Aufsatzplatte und verdünnen Sie sie dreimal in 290 Mikroliter PBS-Lösung mit einer runden bodenigen 96-Well-Platte und einer Mehrkanalpipette. Entdecken Sie dann 10 Mikroliter aller seriell verdünnten Zellsuspensionen auf antibiotikafreien frischen Agarplatten.Decken Sie die Persister-Assay-Platte mit einer gasdurchlässigen Deckenmembran ab und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang in einem Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 250 U / min. Wiederholen Sie nach der sechsstündigen Inkubation die serielle Verdünnung und Fleckenbildung auf Agarplatten. Inkubieren Sie die Agarplatten 16 Stunden bei 37 Grad Celsius.Zählen Sie dann die koloniebildenden Einheiten oder CFUs. Verwenden Sie die CFU-Werte vor und sechs Stunden nach der Antibiotikabehandlung, um die Persisterfraktion in jeder Vertiefung zu berechnen. Die CFU-Zählungen vor der OFX-Behandlung helfen auch, die Auswirkungen von Osmoliten auf die Lebensfähigkeit von E-Coli zu beurteilen.Übertragen Sie 250 Mikroliter exponentieller Phasenzellen auf 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium, das das beim Microarray-Screening identifizierte Osmolit enthält. Inkubieren Sie den Kolben in einem Orbitalschüttler bei 250 U / min und 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Nach 24 Stunden den Kolben aus dem Shaker nehmen und 250 Mikroliter der Zellkultur in einen 250 Milliliter geblendeten Kolben auf 25 Milliliter frisches modifiziertes LB-Medium übertragen.25 Mikroliter Ofloxacin-Stammlösung in die Zellsuspension geben und den Kolben vorsichtig schütteln, um die Assay-Kultur homogen zu machen. Inkubieren Sie den Kolben in einem Shaker bei 37 Grad Celsius und 250 U / min. Zu jeder Stunde während der Behandlung, einschließlich eines Zeitpunkts vor der Zugabe von Ofloxacin, einen Milliliter der Assay-Kultur aus dem Kolben in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und drei Minuten lang bei 17.000 mal G zentrifugieren.Entfernen Sie 950 Mikroliter Überstand und waschen Sie die Zellen dreimal mit 950 Mikrolitern PBS. Nach der abschließenden Wäsche suspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern PBS-Lösung erneut. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension und verdünnen Sie sie sechsmal seriell mit 90 Mikrolitern PBS in einer 96 gut runden Bodenplatte.Spot 10 Mikroliter der verdünnten Zellsuspensionen auf einer antibiotikafreien Agarplatte. Um die Nachweisgrenze zu erhöhen, legen Sie die restlichen 90 Mikroliter Zellsuspension auf eine frische Agarplatte. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden und zählen Sie dann CFUs.Ein repräsentatives Bild von Agarplatten, die zur Bestimmung des CFU-Gehalts von Zellkulturen vor und nach der OFX-Behandlung verwendet werden, ist hier gezeigt. Die erste Spalte ist die Kontrollgruppe. Die zweite Säule enthält Zellen, die in 100 Millimolar-Natriumnitrat kultiviert wurden, und die dritte Säule enthält Zellen, die in 60 Millimolar-Natriumnitrat kultiviert wurden.Der Einfachheit halber werden hier nur zwei Osmolite im Fokus. Eine grafische Darstellung der CFU-Daten der Platten und Persisterfraktionen der in 96 Well-Platten getesteten Zellkulturen ist hier dargestellt. Um die Fraktionen zu berechnen, wurden die Persisterzahlen auf die vor der Antibiotikabehandlung erhaltenen Zellzahlen normalisiert.Um byphasische Tötungskurven zu erzeugen, wurden die Zellen in 25 Millilitern modifiziertem LB-Medium mit den angegebenen Osmomiten und verblüfften Kolben für 24 Stunden kultiviert und dann zur Persister-Enumeration in Persister-Assay-Kolben überführt. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, dass das Erkennen der Zellen auf der Agarplatte arbeitsintensiv ist und Konzentration erfordert. Ein Fehler während des Schritts kann zu einer Kreuzkontamination zwischen den zu testenden Bedingungen führen.Daher ist es wichtig, vor dem Experiment zu üben, mehrere Proben gleichzeitig zu erkennen. Nach diesem Protokoll können Wirkstoffpanels und mutierte Zellbibliotheken untersucht werden, um die Auswirkungen auf die Persistenz zu untersuchen. Mit diesem Screening haben wir eine Reihe von Osmomiten und PS-Zuständen identifiziert, die einen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Persistenz haben.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em&gt; Brucella</em&gt; Die Infektion von HeLa-Zellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...