Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

ברצוננו להודות לחברי מעבדת אורמן על התשומות החשובות שלהם במהלך מחקר זה. מחקר זה מומן על ידי פרס המעבר לקריירה של NIH/NIAID K22AI125468 ומענק סטארט-אפ מאוניברסיטת יוסטון.

1. הכנת מדיום צמיחה, פתרון אולוקסאצין ומניות תאי E. coli
<ol><li>מדיום לוריא-ברטני רגיל (LB): הוסף 10 גרם/ליטר של טריפטון, 10 גרם/ליטר של נתרן כלורי (NaCl) ו-5 גרם/ליטר של תמצית שמרים במים שעברו דה-יון (DI). לעקר את המדיום על ידי autoclaving.</li>
	<li>צלחות אגר LB: להוסיף 10 גרם / ליטר של טריפטון, 10 גרם / L של NaC...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

תפוקה גבוהה מתמיד assay המתואר כאן פותחה כדי להבהיר את ההשפעות של כימיקלים שונים על התמדה E. coli. בנוסף ללוחות PM מסחריים, microarrays ניתן לבנות באופן ידני כמתואר בשלב 4.2. יתר על כן, הפרוטוקול המוצג כאן הוא גמיש והוא יכול לשמש כדי לסנן microarrays אחרים, כגון לוחות סמים וספריות תאים, כי הם 96 פורמטים צלח?...

תרביות חיידקים מכילות תת-אוכלוסיות קטנות של תאים מתמידים הסובלניים באופן זמני לרמות גבוהות במיוחד של אנטיביוטיקה. תאים מתמידים זהים גנטית לקינס הרגישים לאנטיביוטיקה שלהם, והישרדותם יוחסה לעיכוב גדילה חולף1. תאים מתמידים התגלו לראשונה על ידי גלדיסתחביב 2 אבל המונח שימש לראשונה על ידי ג'וזף ביגר כאשר הוא זיהה אותם בתרבויות פיוגנס סטפילוקוקוס שטופלו פניצילין3. מחקר מכונן שפורסם על ידי Balaban et al.4 גילה שני סוגים מתמידים: גרסאות מסוג I הנוצרות בעיקר על ידי מעבר דרך השלב הנייח, וגרסאות סוג II הנוצרות ברציפות במהלך הצמיחה המעריכית. מתמידים מזוהים על ידי מבחני הישרדות קלונוגניים, שבהם דגימות תרבות נלקחות במרווחי זמן שונים במהלך טיפולים אנטיביוטיים, שטופים, מצופים על מדיום צמיחה טיפוסי לספור את התאים ששרדו שיכולים להתיישב בהעדר אנטיביוטיקה. קיומם של מתמידים בתרבית התא מוערך על ידי עקומת להרוג biphasic4,5 שבו הריקבון המעריכי הראשוני מציין את מותם של תאים רגישים לאנטיביוטיקה. עם זאת, מגמת ההרג פוחתת עם הזמן, ובסופו של דבר מובילה לאזור מישור המייצג את התאים המתמשכים ששרדו.
תאים מתמידים קושרו עם מחלות שונות כגון שחפת6, סיסטיק פיברוזיס7, קנדידה8 ודלקות בדרכי השתן9. כמעט כל המיקרואורגניזמים שנבדקו עד כה נמצאו כדי ליצור פנוטיפים מתמידים, כולל שחפת מיקובקטריוםפתוגנית מאוד6, סטפילוקוקוס אוראוס10, פסאודומונס aeruginosa7 ו קנדידה אלביקנס8. מחקרים אחרונים מספקים גם ראיות לעלייתם של מוטנטים עמידים multidrug מתת-אוכלוסיות מתמידות11,12. מאמצים ניכרים בתחום זה גילו כי מנגנוני ההתמדה מורכבים ומגוונים ביותר; הן גורמים סטוכסטיים ודטרמיניסטיים הקשורים לתגובת SOS13,14, מיני חמצן תגובתי (ROS)15, מערכות רעלן/אנטיטוקסין (ת"א)16, אוטופגיה או עיכול עצמי17 ותגובה מחמירה הקשורה ל- ppGpp18 ידועים כמקלים על היווצרות מתמשכת.
למרות התקדמות משמעותית בהבנת פנוטיפ ההתמדה, ההשפעות של אוסמוליטים על התמדה חיידקית לא הובנו במלואן. מאז השמירה על לחץ אוסמוטי אופטימלי הוא הכרח לצמיחה של התאים, תפקוד תקין והישרדות, מחקר מעמיק של osmolytes יכול להוביל מטרות פוטנציאליות עבור אסטרטגיות אנטי מתמיד. למרות מייגע, סינון תפוקה גבוהה היא גישה יעילה מאוד לזיהוי מטבוליטים וכימיקלים אחרים הממלאים תפקיד מכריע בפנוטיפ התמדה19,20. בעבודה זו, נדון בשיטה שפורסמהשלנו 19, שם השתמשנו microarrays, כלומר, 96 לוחות באר המכילים osmolytes שונים (למשל, נתרן כלורי, אוריאה, נתרן חנקתי, נתרן חנקתי, אשלגן כלורי), כדי לזהות osmolytes המשפיעים באופן משמעותי E. coli התמדה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

מתמידי חיידקים מוגדרים כתת-אוכלוסיות קטנות של גרסאות פנוטיפיות עם היכולת לסבול ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה. הם דאגה בריאותית חשובה כפי שהם קושרו עם זיהומים כרוניים חוזרים ונשנים. למרות הדינמיקה סטוכסטי ודטרמיניסטי של מנגנונים הקשורים ללחץ ידועים לשחק תפקיד משמעותי בהתמדה, מנגנונים שבבסיס המעבר פנוטיפי אל / ממצב ההתמדה אינם מובנים לחלוטין. בעוד גורמי התמדה המופעלים על ידי אותות סביבתיים (למשל, דלדול של מקורות פחמן, חנקן וחמצן) נחקרו בהרחבה, ההשפעות של osmolytes על התמדה עדיין לא נקבעו. באמצעות microarrays (כלומר, 96 לוחות באר המכילים כימיקלים שונים), עיצבנו גישה כדי להבהיר את ההשפעות של osmolytes שונים על Escherichia coli התמדה באופן תפוקה גבוהה. גישה זו היא טרנספורמטיבית כפי שהוא יכול להיות מותאם בקלות עבור מערכי הקרנה אחרים, כגון לוחות סמים וספריות נוקאאוט גנים.

איור 1 מתאר את הפרוטוקול הניסיוני שלנו. ניסויי מחזור הדילול/צמיחה (ראו פרוטוקול 2) הותאמו ממחקר שערכה קרן ואח'5 כדי לחסל את המתמידים שמקורם בתרבויות הלילה. איור 2A הוא תמונה מייצגת של לוחות אגר המשמשים לקביעת רמות CFU של תרביות תאים לפני ואחרי טיפול...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

בנייר שיטה זה, אנו מציגים אסטרטגיית סינון בתפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות, כגון אוסמוליטים, שיש להן השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לזהות תנאים שיכולים להשפיע באופן משמעותי על התמדה חיידקית באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למסך בתחומים שונים, כגון לוחות תרופות, ספריות גנים ועוד. מכיוון שהשיטה כוללת צעדי משנה שונים, שאמורים להתבצע בו זמנית, הדגמה חזותית יכולה לסייע לחוקרים לנהל את העיתוי שלהם כדי להשיג תוצאות מדויקות.התחל על ידי הכנת תרביות תא microarray. העבר 250 מיקרוליטרים של תאי פאזה אקספוננציאליים ל-25 מיליליטר של מדיום LB שונה טרי בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. ואז בעדינות לערבב את ההשעיה התא כדי להפוך אותו הומוגני.להעביר את השעיית התא מדולל לתוך מאגר סטרילי 50 מיליליטר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 150 microliters של השעיית התא לכל באר של צלחת microarray המכיל כימיקלים שונים. Microarrays יכול גם להיווצר באופן ידני בעקבות השיטה המתוארת בכתב היד טקסט.מכסים את לוחית המיקרו-ראי בקרום תקרה חדיר לגז ומדגרים אותו בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס וב-250 סל"ד למשך 24 שעות. כדי להפוך את לוחות ההסמכה מתמיד, להכין 25 מיליליטר של מדיום LB שונה המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר של Ofloxacin בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ולהעביר את המדיום הזה למאגר סטרילי. העבר 190 מיקרוליטרים של מדיום LB שונה לתוך כל באר של צלחת שטוחה גנרית 96 היטב.לאחר הדגירה 24 שעות ביממה, להסיר את microarray מן שייקר ולהעביר 10 microliters של תרביות התא מן microarray אל בארות של צלחת בדיקה מתמיד המכיל מדיום LB שונה עם Ofloxacin. קח 10 מיקרוליטרים של מתלי תאים מלוח החיבור מתמיד באופן סדרתי לדלל אותו שלוש פעמים ב 290 microliters של פתרון PBS באמצעות צלחת עגולה 96 גם פיפטה רב ערוצית. ואז לזהות 10 microliters של כל השעיות תאים בדילול סדרתי על צלחות אגר טרי ללא אנטיביוטיקה.מכסים את צלחת ההסמכה המתמדת בקרום תקרה חדיר לגז ומדגרים אותה בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-250 סל"ד למשך שש שעות. לאחר הדגירה בת שש השעות, חזרו על הדילול הסדרתי והבחינו בצלחות אגר. דגירה צלחות אגר במשך 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן לספור את המושבה להרכיב יחידות או CFUs. השתמש ברמות CFU לפני ושש שעות לאחר הטיפול האנטיביוטי כדי לחשב את השבר המתמשך בכל באר. CFU נחשב לפני הטיפול OFX גם לעזור להעריך את ההשפעות של osmolites על הכדאיות e coli.העבר 250 מיקרוליטרים של תאי פאזה אקספוננציאליים ל-25 מיליליטר של מדיום LB שונה טרי המכיל את האוסמוליט שזוהה מההקרנה של המיקרו-קרינה. דגירה את הבקבוק בשייקר מסלולי ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, להסיר את הבקבוק מן שייקר ולהעביר 250 microliters של תרבות התא ל 25 מיליליטר של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מיליליטר מבולבל.הוסיפו 25 מיקרוליטרים של תמיסת מלאי Ofloxacin להשעיית התא ונערו את הבקבוק בעדינות כדי להפוך את תרבות התספורת להומוגנית. דגירה את הבקבוק בשייקר ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד. בכל שעה במהלך הטיפול, כולל נקודת זמן לפני הוספת Ofloxacin, להעביר מיליליטר אחד של תרבות התסעפות מן הבקבוק לצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה אותו ב 17, 000 פעמים G במשך שלוש דקות.הסר 950 מיקרוליטרים של supernatant ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 950 microliters של PBS. לאחר הכביסה הסופית, להשעות מחדש את גלולת התא ב 100 microliters של פתרון PBS. קח 10 מיקרוליטרים של המתלים התא באופן סדרתי לדלל אותו שש פעמים עם 90 microliters של PBS בתוך צלחת 96 גם עגול התחתון.ספוט 10 microliters של השעיות תא מדולל על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה. כדי להגדיל את מגבלת הגילוי, צלחת 90 microliters הנותרים של השעיית תא על צלחת אגר טרי. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות, ואז לספור CFUs.תמונה מייצגת של לוחות אגר המשמשים לקביעת רמות CFU של תרביות תאים לפני ואחרי טיפול OFX מוצג כאן. העמודה הראשונה היא קבוצת הביקורת. בעמודה השנייה יש תאים שתרביתו ב-100 מילימולאר נתרן חנקתי והעמודה השלישית מכילה תאים שתרביתו ב-60 מילימולאר נתרן חנקתי.לפשטות, רק שני אוסמוליטים מתמקדים כאן. ייצוג גרפי של נתוני CFU מן הלוחות שברים מתמידים של תרביות התא נבדק 96 לוחות באר מוצגים כאן. כדי לחשב את השברים, ספירות מתמידים נורמלו לספירת התאים שהושגו לפני הטיפול האנטיביוטי.כדי ליצור עקומות להרוג byphasic, התאים היו מתורבתים 25 מיליליטר של מדיום LB שונה עם osmolites המצוין ובקבוקים מבולבלים במשך 24 שעות, ולאחר מכן הועברו צלושי assay מתמיד לספירה מתמיד. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי איתור התאים על צלחת אגר הוא עבודה אינטנסיבית ודורש מיקוד. שגיאה במהלך הצעד יכולה להוביל לזיהום צולב בין התנאים הנבדקים.לכן חשוב לתרגל איתור דגימות מרובות בו זמנית לפני הניסוי. בעקבות פרוטוקול זה, לוחות סמים וספריות תאים מוטנטים ניתן לסנן כדי ללמוד את ההשפעות על ההתמדה. עם הקרנה זו, זיהינו מספר osmolites ותנאי PS שיש להם השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

מיקרוסקופי מבוססת מבחנים עבור הקרנת תפוקה גבוהה של גורמי מארח המעורבים<em&gt; Brucella</em&gt; זיהום של תאים הלה

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

בניית פלטפורמה תפוקה גבוהה ההקרנה כדי להעריך את הטרוגניות של HER2 הגברה ג'ין סרטן שד

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...