Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
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Vorremmo ringraziare i membri di Orman Lab per i loro preziosi contributi durante questo studio. Questo studio è stato finanziato dal nih/NIAID K22AI125468 career transition award e da una borsa di studio per le startup dell'Università di Houston.

1. Preparazione del mezzo di crescita, della soluzione di ofloxacina e delle scorte di cellule E. coli
<ol><li>Mezzo regolare Luria-Bertani (LB): Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di cloruro di sodio (NaCl) e 5 g/L di estratto di lievito in acqua deionizzata (DI). Sterilizzare il mezzo con l'autoclave.</li>
	<li>Piastre di agar LB: Aggiungere 10 g/L di triptono, 10 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 15 g/L di agar in acqua DI e sterilizzare il mezzo mediante autoclave. Alla temper...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

Il saggio persister ad alta produttività qui descritto è stato sviluppato per chiarire gli effetti di varie sostanze chimiche sulla persistenza di E. coli. Oltre alle piastre PM commerciali, i microarray possono essere costruiti manualmente come descritto al passaggio 4.2. Inoltre, il protocollo qui presentato è flessibile e può essere utilizzato per schermare altri microarray, come pannelli antidroga e librerie cellulari, che sono in 96 formati di piastra di pozzo. Le condizioni sperimentali, compresa la fa...

Le colture batteriche contengono una piccola sottopopolazione di cellule persistenti che sono temporaneamente tolleranti a livelli insolitamente elevati di antibiotici. Le cellule persistenti sono geneticamente identiche ai loro parenti sensibili agli antibiotici e la loro sopravvivenza è stata attribuita all'inibizione transitoria della crescita1. Le cellule persistenti sono state scoperte per la prima volta da Gladys Hobby2, ma il termine è stato usato per la prima volta da Joseph Bigger quando le ha identificate nelle colture di Staphylococcus pyogenes trattate con penicillina3. Uno studio seminale pubblicato da Balaban et al. I persister sono rilevati da test di sopravvivenza clonogenici, in cui i campioni di coltura vengono prelevati a vari intervalli durante i trattamenti antibiotici, lavati e placcati su un tipico mezzo di crescita per contare le cellule sopravvissute che possono colonizzare in assenza di antibiotici. L'esistenza di persistenti in una coltura cellulare è valutata da una curva di uccisione bifasica4,5 in cui il decadimento esponenziale iniziale indica la morte di cellule sensibili agli antibiotici. Tuttavia, la tendenza all'uccisione diminuisce nel tempo, portando infine a una regione di altopiano che rappresenta le cellule persistenti sopravvissute.
Le cellule persistenti sono state associate a varie malattie come la tubercolosi6,la fibrosi cistica7,la candidosi8 e le infezioni del tratto urinario9. Quasi tutti i microrganismi testati finora hanno generato fenotipi persistenti, tra cui Mycobacterium tuberculosis6ad alta patogenicità, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 e Candida albicans8. Studi recenti forniscono anche prove dell'ascesa di mutanti multirrogatori dalle sottopopolazioni persistenti11,12. Notevoli sforzi in questo campo hanno rivelato che i meccanismi di persistenza sono molto complessi e diversificati; sia i fattori stocastico che deterministico associati ai sistemi di risposta SOS13,14, specie reattive dell'ossigeno (ROS)15, tossina/antitossina (TA)16, autofagia o autodigestione17 e risposta rigorosa correlata al ppGpp18 sono noti per facilitare la formazione persister.
Nonostante i significativi progressi nella comprensione del fenotipo di persistenza, gli effetti degli osmoliti sulla persistenza batterica non sono stati pienamente compresi. Poiché il mantenimento di una pressione osmotica ottimale è una necessità per la crescita delle cellule, il corretto funzionamento e la sopravvivenza, uno studio approfondito degli osmoliti potrebbe portare a potenziali obiettivi per strategie anti-persistenti. Sebbene lo screening laborioso e ad alta produttività sia un approccio molto efficace per identificare metaboliti e altre sostanze chimiche che svolgono un ruolo cruciale nel fenotipo di persistenza19,20. In questo lavoro, discuteremo il nostro metodopubblicato 19, dove abbiamo usato microarray, cioè 96 piastre di pozzo contenenti vari osmoliti (ad esempio, cloruro di sodio, urea, nitrito di sodio, nitrato di sodio, cloruro di potassio), per identificare gli osmoliti che influenzano significativamente la persistenza di E. coli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

I persister batterici sono definiti come una piccola sottopopolazione di varianti fenotipiche con la capacità di tollerare alte concentrazioni di antibiotici. Sono un'importante preoccupazione per la salute in quanto sono stati associati a infezioni croniche ricorrenti. Sebbene le dinamiche stocastiche e deterministiche dei meccanismi legati allo stress svolgano un ruolo significativo nella persistenza, i meccanismi alla base del passaggio fenotipico da/verso lo stato di persistenza non sono completamente compresi. Mentre i fattori di persistenza innescati dai segnali ambientali (ad esempio, l'esaurimento delle fonti di carbonio, azoto e ossigeno) sono stati ampiamente studiati, gli impatti degli osmoliti sulla persistenza devono ancora essere determinati. Utilizzando microarray (cioè 96 piastre di pozzo contenenti varie sostanze chimiche), abbiamo progettato un approccio per chiarire gli effetti di vari osmoliti sulla persistenza di Escherichia coli in modo ad alta produttività. Questo approccio è trasformativo in quanto può essere facilmente adattato per altri array di screening, come pannelli di farmaci e librerie di knockout genico.

La figura 1 descrive il nostro protocollo sperimentale. Gli esperimenti del ciclo di diluizione/crescita (cfr. protocollo n. 2) sono stati adattati da uno studio condotto da Keren etal. La figura 2A è un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. In questi esperimenti, le cellule sono state coltivate in mezzo LB modificato con osmolit...

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High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

In questo documento di metodo, presentiamo una strategia di screening ad alta produttività per identificare composti chimici, come gli osmoliti, che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.

Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Il protocollo qui descritto consente di identificare condizioni che possono avere un impatto significativo sulla persistenza batterica in modo ad alta produttività. Questo metodo è facilmente adattabile allo schermo per varie aree, come pannelli farmacologici, librerie geniche e altro ancora. Poiché il metodo comprende varie sottofase, che devono essere condotte simultaneamente, la dimostrazione visiva può aiutare i ricercatori a gestire i loro tempi per ottenere risultati precisi.Inizia preparando le colture cellulari di microarray. Trasferire 250 microlitri di celle di fase esponenziali a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Quindi mescolare delicatamente la sospensione cellulare per renderla omogenea.Trasferire la sospensione cellulare diluita in un serbatoio sterile da 50 millilitri. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 150 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di microarray contenente varie sostanze chimiche. I microarray possono anche essere generati manualmente seguendo il metodo descritto nel manoscritto testuale.Coprire la piastra di microarray con una membrana del soffitto permeabile al gas e incubarla in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 250 RPM per 24 ore. Per realizzare piastre di dosaggio più persistenti, preparare 25 millilitri di mezzo LB modificato contenente cinque microgrammi per millilitro di Ofloxacina in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e trasferire questo mezzo in un serbatoio sterile. Trasferire 190 microlitri del mezzo LB modificato in ogni pozzo di una piastra generica piatta inferiore di 96 poggiasto.Dopo l'incubazione 24 ore su 24, rimuovere il microarray dallo shaker e trasferire 10 microlitri di colture cellulari dal microarray ai pozzi della piastra di dosaggio persister contenente mezzo LB modificato con Ofloxacina. Prendi 10 microlitri di sospensioni cellulari dalla piastra del saggio persister e diluila serialmente tre volte in 290 microlitri di soluzione PBS utilizzando una piastra rotonda inferiore di 96 pozza e una pipetta multicanale. Quindi individuare 10 microlitri di tutte le sospensioni cellulari diluite in serie su piastre di agar fresche senza antibiotici.Coprire la piastra di dosaggio persister con una membrana del soffitto permeabile al gas e incubarla in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius e 250 RPM per sei ore. Dopo l'incubazione di sei ore, ripetere la diluizione seriale e l'avvistamento sulle piastre di agar. Incubare le piastre di agar per 16 ore a 37 gradi Celsius.Quindi conta le unità di formazione della colonia o CNO. Utilizzare i livelli di CFU prima e sei ore dopo il trattamento antibiotico per calcolare la frazione più persistente in ogni pozzo. Il CFU conta prima del trattamento OFX aiuta anche a valutare gli effetti delle osmoliti sulla vitalità dell'e coli.Trasferire 250 microlitri di cellule di fase esponenziale a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato contenente l'osmolite identificata dallo screening del microarray. Incubare il pallone in uno shaker orbitale a 250 giri/min e 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il pallone dallo shaker e trasferire 250 microlitri della coltura cellulare a 25 millilitri di mezzo LB fresco modificato in un pallone sconcertato da 250 millilitri.Aggiungere 25 microlitri di soluzione di stock di Ofloxacina alla sospensione cellulare e agitare delicatamente il pallone per rendere omogenea la coltura del saggio. Incubare il pallone in uno shaker a 37 gradi Celsius e 250 giri/min. Ad ogni ora durante il trattamento, incluso un punto di tempo prima dell'aggiunta di Ofloxacina, trasferire un millilitro della coltura del saggio dal pallone a un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri e centrifugarlo a 17.000 volte G per tre minuti.Rimuovere 950 microlitri di supernatante e lavare le cellule tre volte con 950 microlitri di PBS. Dopo il lavaggio finale, sospendere di nuovo il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione PBS. Prendi 10 microlitri della sospensione cellulare e diluila serialmente sei volte con 90 microlitri di PBS all'interno di una piastra inferiore ben rotonda da 96.Individua 10 microlitri delle sospensioni cellulari diluite su una piastra di agar priva di antibiotici. Per aumentare il limite di rilevamento, placcare i restanti 90 microlitri di sospensione cellulare su una piastra di agar fresca. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16 ore, quindi contare i CFC.Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa delle piastre di agar utilizzate per determinare i livelli di CFU delle colture cellulari prima e dopo il trattamento OFX. La prima colonna è il gruppo di controlli. La seconda colonna ha cellule coltivate in nitrato di sodio millimolare da 100 millimolari e la terza colonna contiene cellule coltivate in nitrato di sodio millimolare da 60 millimolare.Per semplicità, qui si concentrano solo due osmoliti. Qui viene mostrata una rappresentazione grafica dei dati CFU delle piastre e delle frazioni persistenti delle colture cellulari testate in 96 piastre di pozzo. Per calcolare le frazioni, i conteggi dei persistenti sono stati normalizzati al conteggio cellulare ottenuto prima del trattamento antibiotico.Per generare curve di uccisione byfasica, le cellule sono state coltivate in 25 millilitri di mezzo LB modificato con le osmoliti indicate e i mastri sconcertati per 24 ore, quindi trasferite a mastri di dosaggio persistenti per l'enumerazione persister. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che individuare le celle sulla piastra di agar richiede un'intensa attività e richiede messa a fuoco. Un errore durante la fase può portare a contaminazione incrociata tra le condizioni in esame.Quindi è importante esercitarsi a individuare più campioni contemporaneamente prima dell'esperimento. Seguendo questo protocollo, pannelli di farmaci e librerie cellulari mutanti possono essere schermati per studiare gli impatti sulla persistenza. Con questo screening, abbiamo identificato una serie di osmoliti e condizioni PS che hanno un impatto significativo sulla persistenza batterica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Immunologia e infezioni

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infezione di cellule HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Costruire una piattaforma di High-throughput Screening per valutare l'eterogeneità dell'amplificazione del Gene HER2 nei cancri al seno

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...