Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
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この研究の中で、オーマン・ラボのメンバーの貴重なインプットに感謝したいと思います。この研究は、NIH/NIAID K22AI125468キャリア移行賞とヒューストン大学のスタートアップ助成金によって資金提供されました。

1. 成長培地、フロキサシン溶液、 大腸菌 細胞株の調製
<ol><li>通常のルリア・ベルタニ(LB)培地:トリプトン10g/L、塩化ナトリウム10g/L(NaCl)、酵母エキス5g/Lを脱イオン化(DI)水に添加します。オートクレーブ処理で培地を殺菌する。</li>
	<li>LB寒天プレート:トリプトン10g/L、NaCl10g/L、酵母エキス5g/L、DI水中15g/L寒天を加え、オートクレーブ処理で培地を殺菌します。所望の温度(?...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

ここで説明する高スループットパーシスターアッセイは、大 腸菌 の持続性に対する様々な化学物質の影響を解明するために開発されました。商用PMプレートに加えて、マイクロアレイはステップ4.2で説明されているように手動で構築することができます。さらに、ここで提示されるプロトコルは柔軟性があり、96ウェルプレート形式の薬物パネルや細胞ライブラリなどの他のマイクロ?...

細菌培養は、異常に高いレベルの抗生物質に対して一時的に耐性があるパーシスター細胞の小さな亜集団を含む。パーシスター細胞は、抗生物質感受性の親族と遺伝的に同一であり、その生存は一過性の増殖阻害に起因する1。パーシスター細胞はグラディスホビー2によって最初に発見されたが、ペニシリン処理ブドウ球菌培養3でそれらを同定したときにジョセフ・ビガーによって最初に使用された。Balabanら4が発表した精巧な研究では、主に定常相を通過して形成されるタイプI変異体と、指数成長の間に連続的に生成されるII型の2つのパーシスタータイプが発見された。パーシスターは、抗生物質治療中に様々な間隔で培養サンプルを採取し、洗浄し、典型的な成長培地上でメッキし、抗生物質の不在時にコロニー形成できる生き残った細胞を数えるクロノジェニック生存アッセイによって検出される。細胞培養におけるパーシスターの存在は、初期指数崩壊が抗生物質感受性細胞の死を示す二額殺し曲線4、5によって評価される。しかし、殺死傾向は時間の経過とともに減少し、最終的には生き残ったパーシスター細胞を表す高原領域につながる。
パーシスター細胞は、結核6、嚢胞性線維症7、カンジダ症8および尿路感染症9などの様々な疾患に関連している。これまでに試験されたほとんどすべての微生物が、結核菌の高病原性抗酸菌6、黄色ブドウ球菌10、緑膿菌7およびカンジダ・アルビカンス8を含むパーシスター表現型を生成することが判明した。最近の研究はまた、パーシスター亜集団11、12からの多剤耐性変異体の上昇の証拠を提供する。この分野での多くの努力は、持続性メカニズムが非常に複雑で多様であることを明らかにしました。SOS応答13、14、活性酸素種(ROS)15、毒素/抗毒素(TA)系16、オートファジーまたは自己消化17およびppGpp関連ストリンジェント応答18に関連する確率的および決定的因子の両方が、パーシスター形成を促進することが知られている。
持続性表現型の理解において有意な進歩を遂げたにもかかわらず、浸透性の細菌性持続性に及ぼす影響は十分に理解されていない。最適な浸透圧の維持は細胞の成長、適切な機能および生存のために必要であるため、浸透圧の詳細な研究は、抗姉妹戦略の潜在的な標的につながる可能性がある。面倒な、ハイスループットスクリーニングは、持続性表現型19、20において重要な役割を果たす代謝産物および他の化学物質を同定するための非常に効果的なアプローチである。本研究では、マイクロアレイ、すなわち、各種浸透量体(例えば、塩化ナトリウム、尿素、亜硝酸ナトリウム、塩化カリウム)を含む96個のウェルプレートを用いた、大腸菌の持続性に大きな影響を与える浸透性を同定する方法19を紹介する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

細菌のパーシスターは、高濃度の抗生物質を容認する能力を有する表現型変異体の小さな亜集団として定義される。彼らは再発性慢性感染症に関連付けられているので、彼らは重要な健康上の懸念です。ストレス関連機構の確率的かつ決定論的なダイナミクスは持続性において重要な役割を果たしていることが知られているが、持続性状態との間でのフェロティピック切り替えの根底にあるメカニズムは完全には理解されていない。環境シグナルによって引き起こされる持続性因子(例えば、炭素、窒素、酸素源の枯渇)は広範囲に研究されているが、浸透性に及ぼす浸透率は未だ決定されていない。マイクロアレイ(すなわち、様々な化学物質を含む96ウェルプレート)を用いて、様々な浸透量体が 大腸菌 持続性に及ぼす影響を高スループットで解明するアプローチを設計しました。このアプローチは、薬物パネルや遺伝子ノックアウトライブラリなどの他のスクリーニングアレイに容易に適応できるため、変革的です。

図 1 は、実験プロトコルについて説明しています。希釈/成長サイクル実験(プロトコル2参照)は、一晩培養に由来するパー シスターを排除するためにKerenらら5によって行われた研究から適応した。 図2A は、OFX処理前後の細胞培養のCFUレベルを決定するために用いられる寒天プレートの代表的な画像である。これらの実験では、細?...

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High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

本方法論文では、細菌の持続性に大きな影響を与える浸透性物質などの化合物を同定するためのハイスループットスクリーニング戦略を紹介する。

細菌の持続性に及ぼす影響を解明するための化学化合物のハイスループットスクリーニング

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

ここで説明するプロトコルにより、細菌の持続性に大きく影響する可能性のある条件を、高スループットで識別することができます。この方法は、薬物パネル、遺伝子ライブラリーなどの様々な領域のスクリーンに容易に適応可能である。この方法には同時に行われるさまざまなサブステップが含まれているため、視覚的なデモンストレーションは、研究者が正確な結果を得るためにタイミングを管理するのに役立つ。マイクロアレイ細胞培養を準備するから始めます。指数相細胞の250マイクロリットルを50ミリリットル遠心管で25ミリリットルの新鮮な改変LB培地に移す。その後、細胞懸濁液を穏やかに混ぜて均質にします。希釈した細胞懸濁液を無菌50ミリリットルの貯蔵所に移す。マルチチャネルピペットを使用して、細胞懸濁液の150マイクロリットルを様々な化学物質を含むマイクロアレイプレートの各ウェルに移す。マイクロアレイは、テキスト原稿に記載された方法に従って手動で生成することもできる。マイクロアレイプレートにガス透過性の天井膜を覆い、摂氏37度、250RPMの軌道シェーカーで24時間インキュベートします。パーシスターアッセイプレートを作るには、50ミリリットル遠心分離管にOfloxacatの1ミリリットル当たり5マイクログラムを含む25ミリリットルの修飾LB培地を調製し、この培地を無菌貯留槽に移します。修正されたLB培地の190マイクロリットルを一般的なフラットボトム96ウェルプレートの各ウェルに移します。24時間インキュベーション後、シェーカーからマイクロアレイを取り出し、10マイクロリットルの細胞培養液をマイクロアレイから、オフロキサシンとの改質LB培地を含むパーシスターアッセイプレートのウェルに移します。パーシスターエッセイプレートから10マイクロリットルの細胞懸濁液を取り出し、ラウンドボトム96ウェルプレートとマルチチャンネルピペットを使用してPBS溶液の290マイクロリットルで3回連続希釈します。その後、抗生物質を含まない新鮮な寒天プレートに、連続希釈された細胞懸濁液の10マイクロリットルを見つけます。パーシスターアッセイプレートをガス透過性の天井膜で覆い、摂氏37度、250 RPMの軌道シェーカーで6時間インキュベートします。6時間のインキュベーションの後、寒天プレートに連続希釈とスポッティングを繰り返します。寒天プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。次にコロニー形成ユニットまたはCFUsを数えます。抗生物質治療の前と6時間後にCFUレベルを使用して、各井戸のパーシスター分数を計算します。OfX治療前のCFUカウントはまた、大腸菌の生存率に対するオスモリトの影響を評価するのに役立ちます。マイクロアレイスクリーニングから同定されたオスモライトを含む新しい改変LB培地の250マイクロリットルの指数相細胞を25ミリリットルに移す。250 RPM、摂氏37度でフラスコを24時間インキュベートします。24時間後、シェーカーからフラスコを取り出し、250ミリリットルのバッフルフラスコ中の新鮮な改変LB培地の25ミリリットルに細胞培養物250マイクロリットルを移す。25マイクロリットルのOfloxacinストック溶液を細胞懸濁液に加え、フラスコを穏やかに振ってアッセイ培養を均質にします。フラスコを摂氏37度と250RPMのシェーカーでインキュベートします。治療中の1時間ごとに、Ofloxacinを添加する前の時点を含め、フラスコから1ミリリットルのアッセイ培養液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、それを17,000回Gで3分間遠心分離する。950マイクロリットルの上清を取り除き、950マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗います。最終洗浄後、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBS溶液で再懸濁する。細胞懸濁液を10マイクロリットルにして、96ウェルラウンドボトムプレート内の90マイクロリットルのPBSで6回連続して希釈します。抗生物質フリー寒天プレートに希釈された細胞懸濁液の10マイクロリットルを見つける。検出の限界を高めるには、新鮮な寒天プレートに残りの90マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートします。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートし、CFUsを数えます。OFX処理前後の細胞培養のCFUレベルを決定するために使用される寒天プレートの代表的な画像をここに示す。最初の列は制御グループです。第2列は、100ミリモル硝酸ナトリウムで培養した細胞を有し、第3列には、60ミリモルの硝酸ナトリウムで培養した細胞が含まれている。簡単にするために、ここで焦点を当てているのは2つのオスモリ素だけです。96のウェルプレートでテストされた細胞培養物のプレートとパーシスター分画からのCFUデータのグラフィカルな表現をここに示す。分数を計算するために、パーシスター数は抗生物質治療前に得られた細胞数に正規化した。バイファシスキル曲線を生成するために、細胞を示されたオスモリ酸剤とバッフルフラスコを用いて25ミリリットルの修飾LB培地で24時間培養し、パーシスター列挙のためにパーシスターアッセイフラスコに移した。このプロトコルを試みるとき、寒天プレート上の細胞を見つけることは労働集約的であり、焦点を必要とすることに注意してください。ステップ中のエラーは、テストされている条件間でクロスコンタミネーションにつながる可能性があります。したがって、実験の前に複数のサンプルを同時に見つける練習が重要です。このプロトコルに従って、薬剤パネルおよび変異細胞ライブラリーをスクリーニングして、持続性への影響を調べることができる。このスクリーニングにより、細菌の持続性に大きな影響を与える多数のオスモリトおよびPS条件を同定しました。

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Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

乳癌の HER2 遺伝子増幅の不均一性を評価する高スループット スクリーニング プラットフォームを構築

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

ホスト細胞への細菌の付着を自動的に、ハイスループットで検出

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...