Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
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우리는이 연구 기간 동안 그들의 귀중한 입력에 대한 Orman 연구소의 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH /NIAID K22AI125468 경력 전환 상과 휴스턴 대학 스타트업 보조금에 의해 투자되었다.

1. 성장 배지, 용액 및 대장균 세포 주식의 준비
<ol><li>일반 Luria-Bertani (LB) 매체: 트라이프톤 10 g/L, 염화 나트륨 10g/L(NaCl) 및 5g/L의 효모 추출물을 탈온화(DI) 물에 넣습니다. 자동 적으로 매체를 살균합니다.</li>
	<li>LB 한천 플레이트: 트립톤 10g/L, NaCl 10g/L, 효모 추출물 5g/L, DI 물에 15g/L 천사를 넣고 오토클레이빙으로 배지를 살균합니다. 원하는 온도(~55°C)에서 천배지의 ~30mL를 정?...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

여기에 설명된 높은 처리량 퍼시스터 분석은 대장균 지속성에 대한 다양한 화학 물질의 효과를 해명하기 위해 개발되었다. 상용 PM 플레이트 외에도 마이크로어레이는 4.2 단계에서 설명된 대로 수동으로 시공할 수 있습니다. 더욱이, 여기에 제시된 프로토콜은 유연하고 96개의 웰 플레이트 형식으로 약물 패널 및 세포 라이브러리와 같은 다른 마이크로어레이를 선별하는 데 사용될 수 있다....

세균성 배양은 항생제의 비정상적으로 높은 수준에 일시적으로 관대 하는 persister 세포의 작은 하위 인구를 포함. Persister 세포는 그들의 항생제 에 민감한 친척과 유전적으로 동일하고, 그들의 생존은 일시적인 성장 억제1에기인했습니다. Persister 세포는 글래디스 취미2에 의해 처음 발견되었지만, 용어는 그가 페니실린 처리 황색포도상구균 pyogenes 배양3에서그(것)들을 확인했을 때 조셉 더 크에 의해 처음 이용되었습니다. 발라반 외4에 의해 간행된 정액 연구 결과는 2개의 persister 모형을 찾아냈습니다: 정지단계를 통해 통과하여 주로 형성되는 타입 I 변이체, 및 기하급수적인 성장 도중 지속적으로 생성되는 타입 II 변종. Persisters는 항생제 치료 중 다양한 간격으로 배양 샘플을 채취하여 항생제가 없는 경우 식민지화 할 수있는 생존 세포를 계산하기 위해 전형적인 성장 매체에 도금되는 clonogenic 생존 분석서에 의해 검출됩니다. 세포 배양에서 persisters의 존재는 초기 기하급수성 부패가 항생제에 민감한 세포의 죽음을 나타내는 biphasic 킬 곡선4,5에 의해 평가됩니다. 그러나, 살인 추세는 시간이 지남에 따라 감소, 결국 살아남은 persister 세포를 나타내는 고원 지역으로 이어지는.
퍼시스터 세포는 결핵6,낭포성 섬유증7,칸디다증8 및 요로 감염9와같은 다양한 질병과 관련이 있다. 지금까지 테스트된 거의 모든 미생물은 고병원성 진균결핵6, 황색포도상구균10, 슈도모나스 아에루기노사7 및 칸디다 알비칸스8을포함하여 퍼시스터 현상형을 생성하는 것으로 나타났다. 최근 연구는 또한 persister 하위 집단에서 다중 약물 내성 돌연변이의 상승의 증거를 제공합니다11,12. 이 분야에서 상당한 노력은 지속성 메커니즘이 매우 복잡하고 다양하다는 것을 밝혔습니다. SOS응답(13,14,반응성 산소 종(ROS)15,독소/항독소(TA)시스템(16),자가식 또는 자가소화(17) 및 ppGpp 관련 엄격한반응(18)과 관련된 관면 및 결정적 인자 모두 관음 형성을 용이하게 하는 것으로 알려져 있다.
지속성 표현형을 이해하는 중요한 진전에도 불구하고, 세균성 지속성에 대한 삼투병의 효력은 완전히 이해되지 않았습니다. 최적의 삼투압의 유지는 세포의 성장, 적절한 기능 및 생존에 필요한 이유이기 때문에 삼투석에 대한 심층연구는 반퍼 자매 전략에 대한 잠재적 인 대상으로 이어질 수 있습니다. 힘들지만, 고처리량 스크리닝은19,20에서중요한 역할을 하는 대사 산물 및 기타 화학 물질을 식별하기 위한 매우 효과적인 접근법이다. 이 작품에서는, 우리는 우리가 마이크로 어레이를 사용한 우리의 간행된 방법19,즉, 96 각종 삼투엽소를 포함하는 96 개의 잘 플레이트 (예를 들어, 염화나트륨, 우레아, 아질산나트륨, 나트륨 아질산염, 칼륨 염화) 대장균 지속성에 현저하게 영향을 미치는 osmolytes를 규명하기 위하여 토론할 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

세균성 퍼시스터는 항생제의 고농도를 용인하는 기능을 가진 현상변이의 작은 하위 집단으로 정의됩니다. 그(것)들은 재발하는 만성 감염과 연관되었기 때문에 중요한 건강 관심사입니다. 스트레스 관련 메커니즘의 금욕적이고 결정적인 역학은 지속성에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있지만, 지속성 상태에서 페노티픽 스위치의 기본 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 환경 신호(예: 탄소, 질소 및 산소 소스의 고갈)에 의해 유발되는 지속성 요인이 광범위하게 연구되었지만, 지속성에 대한 삼투석의 영향은 아직 결정되지 않았습니다. 마이크로어레이(즉, 다양한 화학 물질을 함유한 96개의 웰 플레이트)를 사용하여, 우리는 높은 처리량 방식으로 대장균 지속성에 대한 다양한 삼투석의 효과를 해명하는 접근법을 설계했습니다. 이 접근법은 약물 패널 및 유전자 녹아웃 라이브러리와 같은 다른 스크리닝 어레이에 쉽게 적응할 수 있으므로 변형적입니다.

그림 1은 실험 프로토콜을 설명합니다. 희석/성장 주기 실험(프로토콜 2 참조)은 케렌 외5가 실시한 연구에서 하룻밤 문화에서 유래한 퍼시스터를 제거하기 위해 조정하였다. 도 2A는 OFX 치료 전후세포 배양의 CFU 수준을 결정하는 데 사용되는 한천 플레이트의 대표적인 이미지이다. 이러한 실험에서, 세포는 4.2단계에서 설명된 바와 같?...

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High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

이 방법 논문에서, 우리는 세균성 지속성에 중대한 영향을 미치는 삼투병과 같은 화학 화합물을 확인하기 위하여 고처리량 검열 전략을 제시합니다.

세균성 지속성에 미치는 영향을 밝히기 위해 화학 화합물의 높은 처리량 선별

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

여기에 설명된 프로토콜은 높은 처리량 방식으로 세균 지속성에 크게 영향을 미칠 수 있는 조건을 식별할 수 있게 합니다. 이 방법은 약물 패널, 유전자 라이브러리 등과 같은 다양한 영역에 대한 화면에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 방법에는 동시에 실시되어야 하는 다양한 서브 단계가 포함되어 있기 때문에, 시각적 데모는 연구원이 정확한 결과를 얻기 위해 타이밍을 관리하는 데 도움이 될 수 있습니다.마이크로어레이 세포 배양을 준비하는 것으로 시작합니다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에서 25밀리리터의 신선한 변형 LB 배지에 지수상 세포의 250마이크로리터를 전달한다. 그런 다음 셀 현탁액을 부드럽게 혼합하여 균일하게 만듭니다.희석된 세포 현탁액을 멸균 50 밀리리터 저수지로 옮기다. 다중 채널 파이펫을 사용하여, 다양한 화학 물질을 포함하는 마이크로 어레이 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션의 150 마이크로 리터를 전송. 마이크로어레이는 텍스트 원고에 설명된 메서드에 따라 수동으로 생성될 수도 있습니다.마이크로어레이 플레이트를 가스 투과성 천장 멤브레인으로 덮고 섭씨 37도, RPM 250에서 24시간 동안 궤도 셰이커에 배양합니다. 퍼시언니 분석 판을 만들려면 50밀리리터 원심분리기 튜브에 Ofloxacin의 밀리리터 당 5 마이크로그램을 포함하는 수정된 LB 배지 25밀리리터를 준비하고 이 매체를 멸균 저수지로 옮길 수 있습니다. 수정된 LB 배지의 190마이크로리터를 일반 평면 바닥(96)의 각 웰으로 옮기다.24시간 인큐베이션 후, 셰이커로부터 마이크로어레이를 제거하고 세포 배양10마이크로리터를 마이크로어레이에서 Ofloxacin을 함유한 배구 분석 플레이트의 우물까지 이송한다. 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 퍼sister 에세이 플레이트에서 가져 와서 라운드 하단 96 웰 플레이트와 멀티 채널 파이펫을 사용하여 PBS 용액 의 290 마이크로 리터에서 세 번 연속적으로 희석하십시오. 그런 다음 항생제 무료 신선한 한천 접시에 모든 연속적으로 희석 된 세포 현탁액의 10 마이크로 리터를 발견하십시오.퍼시언니 분석판을 가스 투과성 천장 멤브레인으로 덮고 6시간 동안 섭씨 37도, RPM 250의 궤도 셰이커에 배양합니다. 6시간 의 배양 후, 일련 희석을 반복하고 한천 접시에 발견한다. 37°C에서 16시간 동안 한천 접시를 배양합니다.그런 다음 식민지 형성 단위 또는 CfU를 계산합니다. 항생제 치료 전후 6시간 전과 6시간 후에 CFU 수준을 사용하여 각 우물에서 persister 분획을 계산합니다. OfX 처리의 앞에 CFU 는 또한 e coli 생존가능성에 osmolites의 효력을 평가하는 것을 돕습니다.마이크로어레이 스크리닝에서 확인된 오스몰라이트를 함유한 신선한 변형 LB 배지의 25밀리리터에 지수상 세포의 250마이크로리터를 전달한다. 250 RPM과 섭씨 37도에서 24시간 동안 플라스크를 궤도 셰이커에 배양합니다. 24시간 후, 셰이커에서 플라스크를 제거하고 250 밀리리터 배플 플라스크에서 25밀리리터의 신선한 변형 LB 배지 25밀리리터로 세포 배양의 250 마이크로리터를 이송한다.Ofloxacin 스톡 용액 25마이크로리터를 세포 현탁액에 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 분석 문화를 균질하게 만듭니다. 플라스크를 섭씨 37도, RPM 250도에서 셰이커에 배양합니다. Ofloxacin을 추가하기 전에 시간 지점을 포함하여 치료 중 매 시간마다 플라스크에서 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브로 분석 문화의 1 밀리리터를 전송하고 원심분리기는 17, 000회 G에서 3분 동안 전송합니다.950 마이크로리터의 상체를 제거하고 PBS의 950 마이크로리터로 세포를 세 번 씻으시다. 최종 세척 후, PBS 용액의 100 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 셀 서스펜션의 10 마이크로리터를 복용하고 96 개의 잘 둥근 바닥 플레이트 내부에 PBS의 90 마이크로 리터로 6 번 연속적으로 희석하십시오.항생제 없는 한천 판에 희석된 세포 현탁액의 10마이크로리터를 반점하십시오. 검출 의 한계를 증가시키기 위하여는, 신선한 한천 접시에 셀 현탁액의 나머지 90 마이크로리터를 접시. 16시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양한 다음 CfU를 계산합니다.OFX 치료 전후세포 배양의 CFU 수준을 결정하는 데 사용되는 한천 플레이트의 대표적인 이미지가 여기에 나와 있다. 첫 번째 열은 컨트롤 그룹입니다. 두 번째 컬럼에는 질산나트륨 100밀리머나트륨으로 배양된 세포가 있으며, 세 번째 컬럼에는 질산나트륨 60밀리머 나트륨으로 배양된 세포가 포함되어 있다.단순성으로 는 두 개의 osmolites만이 여기에 집중됩니다. 96개의 웰 플레이트에서 테스트된 세포 배양의 플레이트 및 퍼시누분수로부터의 CFU 데이터의 그래픽 표현이 여기에 나와 있다. 분획을 계산하기 위해, persister 수는 항생제 치료 전에 얻은 세포 수로 정규화되었다.세포는 25밀리리터의 수정된 LB 배지에서 24시간 동안 표시된 오스몰라이트와 당황한 플라스크로 배양한 다음, 퍼시누열 열거곡에 대한 인가 분석 플라스크로 옮겨졌다. 이 프로토콜을 시도할 때, 한천 판에 세포를 발견하는 것은 노동 집약적이며 초점이 필요하다는 것을 명심하십시오. 단계 중 오류는 테스트 중인 조건 중 교차 오염으로 이어질 수 있습니다.따라서 실험 전에 동시에 여러 샘플을 발견하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 약물 패널 및 돌연변이 세포 라이브러리를 선별하여 지속성에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 이 검열을 통해, 우리는 세균성 지속성에 중요한 충격이 있는 osmolites 및 PS 조건의 수를 확인했습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

연구

면역학 및 감염병학

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

유방암에서 HER2 유전자 증폭의이 질을 평가 하기 위해 높은 처리량 검열 플랫폼을 구축

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...