Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

Vi vil takke medlemmene av Orman Lab for deres verdifulle innspill i løpet av denne studien. Denne studien ble finansiert av NIH/NIAID K22AI125468 karriereovergangspris og et oppstartsstipend fra University of Houston.

1. Fremstilling av vekstmedium, ofloxacinløsning og E. coli-cellelagrer
<ol><li>Vanlig Luria-Bertani (LB) medium: Tilsett 10 g/l trypton, 10 g/l natriumklorid (NaCl) og 5 g/l gjærekstrakt i deionisert (DI) vann. Steriliser mediet ved autoklavering.</li>
	<li>LB agarplater: Tilsett 10 g/l trypton, 10 g/l nacl, 5 g/l gjærekstrakt og 15 g/l agar i DI-vann og steriliser mediet ved autoklavering. Ved ønsket temperatur (~55 °C) hell ~30 ml agarmedium i firkantede plater (10 x 10 cm). Tørk plat...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

Den høye gjennomstrømningen vedvarer analysen beskrevet her ble utviklet for å belyse effekten av ulike kjemikalier på E. coli utholdenhet. I tillegg til kommersielle PM-plater kan mikroarrayer konstrueres manuelt som beskrevet i trinn 4.2. Dessuten er protokollen som presenteres her fleksibel og kan brukes til å screene andre mikroarrays, for eksempel narkotikapaneler og cellebiblioteker, som er i 96 brønnplateformater. De eksperimentelle forholdene, inkludert vekstfasen, inokulasjonsraten og mediet, kan ...

Bakteriekulturer inneholder en liten subpopulasjon av utholdenhetsceller som er midlertidig tolerante for uvanlig høye nivåer av antibiotika. Persisterceller er genetisk identiske med deres antibiotikafølsomme huder, og deres overlevelse har blitt tilskrevet forbigående veksthemming1. Persister celler ble først oppdaget av Gladys Hobby2, men begrepet ble først brukt av Joseph Bigger da han identifiserte dem i penicillin-behandlet Staphylococcus pyogenes kulturer3. En seminalstudie publisert av Balaban et al.4 oppdaget to utholdenhetstyper: type I-varianter som hovedsakelig dannes ved passasje gjennom den stasjonære fasen, og type II-varianter som kontinuerlig genereres under den eksponentielle veksten. Persisters oppdages av clonogenic overlevelsesanalyser, der kulturprøver tas med ulike intervaller under antibiotikabehandlinger, vasket og belagt på et typisk vekstmedium for å telle de overlevende cellene som kan kolonisere i fravær av antibiotika. Eksistensen av persisters i en cellekultur vurderes av en bifasisk drapskurve4,5 der det første eksponentielle forfallet indikerer død av antibiotikafølsomme celler. Imidlertid reduseres drapstrenden over tid, noe som til slutt fører til en platåregion som representerer de overlevende utholdenhetscellene.
Persisterceller har vært forbundet med ulike sykdommer som tuberkulose6, cystisk fibrose7, candidiasis8 og urinveisinfeksjoner9. Nesten alle mikroorganismer testet så langt ble funnet å generere persister fenotyper, inkludert svært patogen Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 og Candida albicans8. Nyere studier gir også bevis på økningen av multidrug-resistente mutanter fra persister subpopulations11,12. Betydelig innsats på dette feltet har avdekket at utholdenhetsmekanismer er svært komplekse og mangfoldige; både stokastiske og deterministiske faktorer forbundet med SOS-responsen13,14, reaktive oksygenarter (ROS)15, toksin/antitoksin (TA) systemer16, autofagi eller selvfordøyelse17 og ppGpp-relatert streng respons18 er kjent for å lette utholdenhetsdannelse.
Til tross for betydelig fremgang i å forstå utholdenhet fenotypen, har effekten av osmolytter på bakteriell utholdenhet ikke blitt fullt ut forstått. Siden vedlikehold av optimalt osmotisk trykk er en nødvendighet for cellenes vekst, riktig funksjon og overlevelse, kan en grundig studie av osmolytter føre til potensielle mål for anti-persister strategier. Selv om arbeidskrevende, høy gjennomstrømning screening er en svært effektiv tilnærming for å identifisere metabolitter og andre kjemikalier som spiller en avgjørende rolle i utholdenhet fenotype19,20. I dette arbeidet vil vi diskutere vår publiserte metode19, hvor vi har brukt mikroarrays, det vil si 96 brønnplater som inneholder ulike osmolytter (f.eks. natriumklorid, urea, natriumnitritt, natriumnitrat, kaliumklorid), for å identifisere osmolytter som betydelig påvirker E. coli utholdenhet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Bakterielle persisters er definert som en liten subpopulation av fenotypiske varianter med evnen til å tolerere høye konsentrasjoner av antibiotika. De er et viktig helseproblem da de har vært forbundet med tilbakevendende kroniske infeksjoner. Selv om stokastisk og deterministisk dynamikk i stressrelaterte mekanismer er kjent for å spille en betydelig rolle i utholdenhet, er mekanismer som ligger til grunn for fenotypisk bytte til / fra utholdenhetstilstanden ikke helt forstått. Mens utholdenhetsfaktorer utløst av miljøsignaler (f.eks. uttømming av karbon-, nitrogen- og oksygenkilder) er grundig studert, er virkningene av osmolytter på utholdenhet ennå ikke bestemt. Ved hjelp av mikroarrays (dvs. 96 brønnplater som inneholder ulike kjemikalier), har vi designet en tilnærming for å belyse effekten av ulike osmolytter på Escherichia coli utholdenhet på en høy gjennomstrømning måte. Denne tilnærmingen er transformativ, da den lett kan tilpasses andre screeningmatriser, for eksempel stoffpaneler og genutslagsbiblioteker.

Figur 1 beskriver vår eksperimentelle protokoll. Fortynnings-/vekstsykluseksperimentene (se protokoll 2) ble tilpasset fra en studie utført av Keren et al.5 for å eliminere utholdenhetene som stammer fra nattkulturene. Figur 2A er et representativt bilde av agarplater som brukes til å bestemme CFU-nivåer av cellekulturer før og etter OFX-behandling. I disse eksperimentene ble celler dyrket i modifisert LB-medium med osmolytter i hal...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

I dette metodepapiret presenterer vi en screeningstrategi med høy gjennomstrømning for å identifisere kjemiske forbindelser, for eksempel osmolytter, som har en betydelig innvirkning på bakteriell utholdenhet.

Høy gjennomstrømning screening av kjemiske forbindelser for å belyse deres effekter på bakteriell utholdenhet

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Protokollen som er beskrevet her gjør det mulig å identifisere forhold som kan påvirke bakteriell utholdenhet betydelig på en høy gjennomstrømningsmåte. Denne metoden er lett tilpasningsdyktig til skjerm for ulike områder, for eksempel legemiddelpaneler, genbiblioteker og mer. Siden metoden inkluderer ulike undertrinn, som skal utføres samtidig, kan visuell demonstrasjon hjelpe forskere med å administrere timingen for å oppnå nøyaktige resultater.Begynn med å forberede mikroarraycellekulturer. Overfør 250 mikroliter eksponentielle faseceller til 25 milliliter fersk modifisert LB-medium i et 50 milliliter sentrifugerør. Bland deretter celleopphenget forsiktig for å gjøre det homogent.Overfør den fortynnede cellefjæringen til et sterilt reservoar på 50 milliliter. Bruk en flerkanals pipette, overfør 150 mikroliter av cellefjæringen til hver brønn av en mikroarrayplate som inneholder ulike kjemikalier. Mikroarrayer kan også genereres manuelt etter metoden som er beskrevet i tekstmanuskriptet.Dekk mikroarrayplaten med en gassgjennomtrengelig takmembran og inkuber den i en orbital shaker ved 37 grader Celsius og 250 RPM i 24 timer. For å lage vedvarende analyseplater, lag 25 milliliter modifisert LB-medium som inneholder fem mikrogram per milliliter Ofloxacin i et 50 milliliter sentrifugerør og overfør dette mediet til et sterilt reservoar. Overfør 190 mikroliter av det modifiserte LB-mediet til hver brønn av en generisk flat bunn 96 brønnplate.Etter 24 timers inkubasjon, fjern mikroarray fra shaker og overfør 10 mikroliter cellekulturer fra mikroarrayen til brønnene til den vedvarende analyseplaten som inneholder modifisert LB-medium med Ofloxacin. Ta 10 mikroliter cellefjæringer fra den vedvarende essayplaten og fortynn den tre ganger i 290 mikroliter PBS-oppløsning ved hjelp av en rund bunn 96 brønnplate og en flerkanals pipette. Deretter spot 10 mikroliter av alle serie fortynnede celle suspensjoner på antibiotikafrie friske agarplater.Dekk den vedvarende analyseplaten med en gassgjennomtrengelig takmembran og inkuber den i en orbital shaker ved 37 grader Celsius og 250 RPM i seks timer. Etter seks timers inkubasjon, gjenta seriell fortynning og spotting på agarplater. Inkuber agarplatene i 16 timer ved 37 grader Celsius.Tell deretter koloniformingsenhetene eller CFUene. Bruk CFU-nivåene før og seks timer etter antibiotikabehandlingen for å beregne den vedvarende fraksjonen i hver brønn. CFU teller før OFX-behandlingen også bidra til å vurdere effekten av osmolitter på e coli levedyktighet.Overfør 250 mikroliter eksponentielle faseceller til 25 milliliter fersk modifisert LB-medium som inneholder osmolitten identifisert fra mikroarrayscreeningen. Inkuber kolben i en orbital shaker ved 250 RPM og 37 grader Celsius i 24 timer. Etter 24 timer, fjern kolben fra shakeren og overfør 250 mikroliter av cellekulturen til 25 milliliter fersk modifisert LB-medium i en 250 milliliter forbløffet kolbe.Tilsett 25 mikroliter Ofloxacin lagerløsning til cellefjæringen og rist kolben forsiktig for å gjøre analysekulturen homogen. Inkuber kolben i en shaker ved 37 grader Celsius og 250 RPM. Hver time under behandlingen, inkludert et tidspunkt før tilsetning av Ofloxacin, overfør en milliliter av analysekulturen fra kolben til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerrør og sentrifuger det ved 17 000 ganger G i tre minutter.Fjern 950 mikroliter supernatant og vask cellene tre ganger med 950 mikroliter PBS. Etter den endelige vasken, re-suspendere cellepellet i 100 mikroliter av PBS-løsning. Ta 10 mikroliter av cellefjæringen og fortynn den seks ganger med 90 mikroliter PBS inne i en 96 brønn rund bunnplate.Spot 10 mikroliter av de fortynnede celle suspensjonene på en antibiotikafri agarplate. For å øke deteksjonsgrensen, skriv de resterende 90 mikroliter cellefjæringen på en fersk agarplate. Inkuber platene ved 37 grader Celsius i 16 timer, og tell deretter CFUer.Et representativt bilde av agarplater som brukes til å bestemme CFU-nivåer av cellekulturer før og etter OFX-behandling, vises her. Den første kolonnen er kontrollgruppen. Den andre kolonnen har celler som ble dyrket i 100 millimolar natriumnitrat og den tredje kolonnen inneholder celler som ble dyrket i 60 millimolar natriumnitrat.For enkelhets skyld er bare to osmolitter fokusert på her. En grafisk fremstilling av CFU-dataene fra platene og vedvarende brøkdeler av cellekulturene som er testet i 96 brønnplater er vist her. For å beregne fraksjonene ble vedvarende tellinger normalisert til celletallene oppnådd før antibiotikabehandlingen.For å generere byfasiske drapskurver ble cellene dyrket i 25 milliliter modifisert LB-medium med de angitte osmolittene og forvirrede kolber i 24 timer, og deretter overført til vedvarende analyseflasker for vedvarende opplisting. Når du prøver denne protokollen, husk at å oppdage cellene på agarplaten er arbeidskrevende og krever fokus. En feil i løpet av trinnet kan føre til krysskontaminering blant forholdene som testes.Så det er viktig å øve på å oppdage flere prøver samtidig før eksperimentet. Etter denne protokollen kan legemiddelpaneler og mutante cellebiblioteker screenes for å studere virkningene på utholdenheten. Med denne screeningen har vi identifisert en rekke osmolitter og PS-forhold som har en betydelig innvirkning på bakteriell utholdenhet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ Høy gjennomstrømming encellede Cytotoksisitet analysen for T celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En Microplate Assay å vurdere Kjemiske Effekter på RBL-2H3 Mast Cell degranulation: Effekter av Triklosan uten bruk av et organisk løsemiddel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi-baserte analyser for High-throughput screening av Host faktorer involvert i<em&gt; Brucella</em&gt; Infeksjon av HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescens-basert lymfocyttkontroll analyse Egnet for høy gjennomstrømming screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Bygge opp en høy gjennomstrømming Screening plattform å vurdere heterogenitet HER2 genet forsterkning i brystkreft

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En høy gjennomstrømming plattform for Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En høy gjennomstrømming Shigella-spesifikke bakteriedrepende analysen

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Automatisert, høy gjennomstrømningsdeteksjon av bakteriell overholdelse av vertsceller

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...