Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer aos membros do Laboratório Orman por suas valiosas contribuições durante este estudo. Este estudo foi financiado pelo prêmio nih/NIAID K22AI125468 de transição de carreira e uma bolsa de startup da Universidade de Houston.

1. Preparação de estoques médios de crescimento, solução de deloxacina e estoques de células E. coli
<ol><li>Meio regular luria-bertani (LB): Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura em água desionizada (DI). Esterilize o meio autoclavando.</li>
	<li>Placas de ágar LB: Adicione 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extrato de levedura e 15 g/L de ágar em água DI e esterilize o meio por autoclavagem. Na temperatura desejada ...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

O alto ensaio de persistência de rendimento descrito aqui foi desenvolvido para elucidar os efeitos de vários produtos químicos na persistência de E. coli. Além das placas comerciais da PM, as microarrays podem ser construídas manualmente conforme descrito na etapa 4.2. Além disso, o protocolo aqui apresentado é flexível e pode ser usado para tela de outras microarrays, como painéis de drogas e bibliotecas celulares, que estão em 96 formatos de placas de poço. As condições experimentais, incluindo ...

Culturas bacterianas contêm uma pequena subpopulação de células persisteras que são temporariamente tolerantes a níveis extraordinariamente altos de antibióticos. As células persisteras são geneticamente idênticas aos seus parentes sensíveis a antibióticos, e sua sobrevivência tem sido atribuída à inibição transitória do crescimento1. Células persisteres foram descobertas pela primeira vez por Gladys Hobby2, mas o termo foi usado pela primeira vez por Joseph Bigger quando ele as identificou nas culturas Staphylococcus pyogenes tratadas com penicilina3. Um estudo seminal publicado por Balaban et al.4 descobriu dois tipos de persistência: variantes tipo I que são formadas principalmente por passagem através da fase estacionária, e variantes tipo II que são geradas continuamente durante o crescimento exponencial. Persisters são detectados por ensaios de sobrevivência clonogênico, nos quais amostras de cultura são colhidas em vários intervalos durante tratamentos com antibióticos, lavadas e banhadas em um meio de crescimento típico para contar as células sobreviventes que podem colonizar na ausência de antibióticos. A existência de persisters em uma cultura celular é avaliada por uma curva de morte bifásica4,5 onde a decadência exponencial inicial indica a morte de células sensíveis a antibióticos. No entanto, a tendência de morte diminui com o tempo, eventualmente levando a uma região platô que representa as células persisteres sobreviventes.
As células persisteres têm sido associadas a várias doenças como tuberculose6,fibrose cística7,candidíase8 e infecções do trato urinário9. Quase todos os microrganismos testados até agora foram encontrados para gerar fenótipos persisteres, incluindo mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 e Candida albicans8. Estudos recentes também fornecem evidências do surgimento de mutantes multidroga resistentes a subpopulaçõespersistentes 11,12. Esforços substanciais neste campo revelaram que os mecanismos de persistência são altamente complexos e diversos; tanto fatores estocásticos quanto determinísticos associados à resposta SOS13,14, espécies reativas de oxigênio (ROS)15,sistemas toxina/antitoxina (TA)16,autofagia ou auto-digestão17 e resposta rigorosa relacionada ao PPGPP18 são conhecidos por facilitar a formação de persister.
Apesar dos progressos significativos na compreensão do fenótipo persistência, os efeitos dos osmólises sobre a persistência bacteriana não foram totalmente compreendidos. Uma vez que a manutenção da pressão osmótica ideal é uma necessidade para o crescimento das células, o bom funcionamento e a sobrevivência, um estudo aprofundado dos osmólises poderia levar a potenciais alvos para estratégias anti-persistência. Embora a triagem laboriosa e de alto rendimento seja uma abordagem muito eficaz para identificar metabólitos e outros produtos químicos que desempenham um papel crucial no fenótipo de persistência19,20. Neste trabalho, discutiremos nosso método publicado19, onde usamos microarrays, ou seja, 96 placas de poço contendo vários osmólises (por exemplo, cloreto de sódio, ureia, nitrito de sódio, nitrato de sódio, cloreto de potássio), para identificar osmólitos que influenciam significativamente a persistência de E. coli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Persisters bacterianos são definidos como uma pequena subpopulação de variantes fenotípicas com a capacidade de tolerar altas concentrações de antibióticos. São uma importante preocupação para a saúde, pois têm sido associadas a infecções crônicas recorrentes. Embora a dinâmica estocástica e determinística dos mecanismos relacionados ao estresse seja conhecida por desempenhar um papel significativo na persistência, os mecanismos subjacentes à mudança fenotípica para/do estado de persistência não são completamente compreendidos. Embora os fatores de persistência desencadeados por sinais ambientais (por exemplo, esgotamento das fontes de carbono, nitrogênio e oxigênio) tenham sido extensivamente estudados, os impactos dos osmólises sobre a persistência ainda estão para ser determinados. Usando microarrays (ou seja, 96 placas de poço contendo vários produtos químicos), projetamos uma abordagem para elucidar os efeitos de vários osmólises na persistência de Escherichia coli de forma de alto rendimento. Essa abordagem é transformadora, pois pode ser prontamente adaptada para outras matrizes de triagem, como painéis de drogas e bibliotecas de genes knockout.

A Figura 1 descreve nosso protocolo experimental. Os experimentos do ciclo de diluição/crescimento (ver Protocolo 2) foram adaptados de um estudo conduzido por Keren et al.5 para eliminar os persisters originários das culturas noturnas. Figura 2A é uma imagem representativa das placas de ágar usadas para determinar os níveis de CFU de culturas celulares antes e depois do tratamento OFX. Nesses experimentos, as células foram cultiva...

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High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Neste artigo de método, apresentamos uma estratégia de triagem de alto rendimento para identificar compostos químicos, como osmolitos, que têm um impacto significativo na persistência bacteriana.

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

O protocolo aqui descrito permite identificar condições que podem impactar significativamente a persistência bacteriana de forma de alto rendimento. Este método é prontamente adaptável à tela para várias áreas, como painéis de drogas, bibliotecas genéticas e muito mais. Como o método inclui várias sub etapas, que devem ser conduzidas simultaneamente, a demonstração visual pode ajudar os pesquisadores a gerenciar seu tempo para obter resultados precisos.Comece preparando culturas de células de microarray. Transfira 250 microliters de células de fase exponencial para 25 mililitros de meio LB modificado fresco em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, misture suavemente a suspensão da célula para torná-la homogênea.Transfira a suspensão da célula diluída para um reservatório estéril de 50 mililitros. Usando uma pipeta multicanal, transfira 150 microliters da suspensão celular para cada poço de uma placa de microarray contendo vários produtos químicos. Microarrays também podem ser gerados manualmente seguindo o método descrito no manuscrito do texto.Cubra a placa de microarray com uma membrana de teto permeável a gás e incuba-a em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 250 RPM por 24 horas. Para fazer placas de ensaio persister, prepare 25 mililitros de meio LB modificado contendo cinco microgramas por mililitro de Ofloxacina em um tubo centrífuga de 50 mililitros e transfira este meio para um reservatório estéril. Transfira 190 microliters do meio LB modificado para cada poço de uma placa de fundo plana genérica 96.Após a incubação de 24 horas, remova a microarray do agitador e transfira 10 microlitadores de culturas celulares da microarray para os poços da placa de ensaio persistente contendo meio LB modificado com Ofloxacina. Pegue 10 microliters de suspensões celulares da placa de ensaio persister e dilua-a em série três vezes em 290 microliters de solução PBS usando uma placa de poço fundo redondo 96 e uma pipeta multicanal. Em seguida, local 10 microliters de todas as suspensões celulares diluídas em série em placas de ágar frescos sem antibióticos.Cubra a placa de ensaio persistente com uma membrana de teto permeável a gás e incuba-a em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 250 RPM por seis horas. Após a incubação de seis horas, repita a diluição serial e manchas em placas de ágar. Incubar as placas de ágar por 16 horas a 37 graus Celsius.Em seguida, conte as unidades formadoras da colônia ou CFUs. Use os níveis de UFC antes e seis horas após o tratamento com antibióticos para calcular a fração persistência em cada poço. A CFU conta antes do tratamento OFX também ajudar a avaliar os efeitos dos osmolitos na viabilidade e coli.Transfira 250 microliters de células de fase exponencial para 25 mililitros de meio LB modificado fresco contendo o osmolito identificado a partir da triagem de microarray. Incubar o frasco em um agitador orbital a 250 RPM e 37 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, remova o frasco do agitador e transfira 250 microliters da cultura celular para 25 mililitros de meio LB modificado fresco em um frasco perplexo de 250 mililitros.Adicione 25 microliters de solução de estoque de Ofloxacina à suspensão celular e agite o frasco suavemente para tornar a cultura do ensaio homogênea. Incubar o frasco em um shaker a 37 graus Celsius e 250 RPM. A cada hora durante o tratamento, incluindo um ponto de tempo antes da adição de Ofloxacin, transfira um mililitro da cultura de ensaio do frasco para um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e centrifuá-lo a 17.000 vezes G por três minutos.Remova 950 microliters de supernascer e lave as células três vezes com 950 microliters de PBS. Após a lavagem final, suspenda a pelota de célula em 100 microliters de solução PBS. Pegue 10 microliters da suspensão celular e dilui-a em série seis vezes com 90 microliters de PBS dentro de uma placa inferior bem redonda de 96.Local 10 microliters das suspensões de células diluídas em uma placa de ágar livre de antibióticos. Para aumentar o limite de detecção, aplaque os 90 microliters restantes de suspensão celular em uma placa de ágar fresca. Incubar as placas a 37 graus Celsius durante 16 horas, depois contar CFUs.Uma imagem representativa das placas de ágar usada para determinar os níveis de CFU das culturas celulares antes e depois do tratamento OFX é mostrada aqui. A primeira coluna é o grupo de controle. A segunda coluna tem células que foram cultivadas em nitrato de sódio de 100 milimônios e a terceira coluna contém células que foram cultivadas em 60 milimilas de nitrato de sódio.Para simplificar, apenas dois osmólitos estão focados aqui. Uma representação gráfica dos dados da UFC a partir das placas e frações persisteras das culturas celulares testadas em 96 placas de poço são mostradas aqui. Para calcular as frações, as contagens persisteres foram normalizadas para a contagem celular obtida antes do tratamento com antibióticos.Para gerar curvas de morte porfásicas, as células foram cultivadas em 25 mililitros de meio LB modificado com os osmolitos indicados e frascos perplexos por 24 horas, depois transferidos para frascos de ensaio persistente para enumeração persistente. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que detectar as células na placa de ágar é trabalhoso e requer foco. Um erro durante a etapa pode levar à contaminação cruzada entre as condições que estão sendo testadas.Por isso, é importante praticar a 800 mlyetos simultaneamente antes do experimento. Seguindo este protocolo, painéis de drogas e bibliotecas de células mutantes podem ser examinados para estudar os impactos na persistência. Com essa triagem, identificamos uma série de osmolitos e condições de PS que têm um impacto significativo na persistência bacteriana.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

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Imunologia e Infecção

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RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Detecção automatizada e de alto rendimento da adesão bacteriana às células hospedeiras

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...