Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить членов Orman Lab за их ценный вклад в это исследование. Это исследование финансировалось премией NIH / NIAID K22AI125468 за переход к карьере и грантом на запуск Университета Хьюстона.

1. Приготовление питательной среды, раствора офлоксацина и запасов клеток E. coli
<ol><li>Обычная среда Лурия-Бертани (LB): Добавьте 10 г / л триптона, 10 г / л хлорида натрия (NaCl) и 5 г / л дрожжевого экстракта в деионизированную (DI) воду. Стерилизуйте среду путем автоклавирования.</li>
	<li>?...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

Описанный здесь высокопроизводительный персистерный анализ был разработан для выяснения влияния различных химических веществ на персистенцию E. coli. В дополнение к коммерческим пластинам ТЧ микрочипы могут быть изготовлены вручную, как описано в шаге 4.2. Кроме того, протокол, пред?...

Бактериальные культуры содержат небольшую субпопуляцию персистентных клеток, которые временно терпимы к необычно высоким уровням антибиотиков. Персистентные клетки генетически идентичны своим чувствительным к антибиотикам сородиням, и их выживание объясняется временным ингибированием роста1. Персистентные клетки были впервые обнаружены Глэдис Хобби2, но этот термин был впервые использован Джозефом Биггером, когда он идентифицировал их в обработанных пенициллином культурах Staphylococcus pyogenes 3. Основополагающее исследование, опубликованное Balaban et al.4, обнаружило два типа персистентов: варианты типа I, которые в основном формируются при прохождении через стационарную фазу, и варианты типа II, которые непрерывно генерируются во время экспоненциального роста. Персистенты обнаруживаются с помощью клоногенных анализов выживаемости, в которых образцы культуры берутся через различные промежутки времени во время лечения антибиотиками, промываются и покрываются на типичной питательной среде для подсчета выживших клеток, которые могут колонизироваться в отсутствие антибиотиков. Существование персистентов в клеточной культуре оценивается по двухфазной кривой убийства4,5, где начальный экспоненциальный распад указывает на гибель чувствительных к антибиотикам клеток. Тем не менее, тенденция к уничтожению со временем уменьшается, что в конечном итоге приводит к плато, которая представляет собой выжившие персистентные клетки.
Персистентные клетки были связаны с различными заболеваниями, такими как туберкулез6,муковисцидоз7,кандидоз8 и инфекции мочевыводящих путей9. Было обнаружено, что почти все микроорганизмы, протестированные до сих пор, генерируют персистентные фенотипы, включая высокопатогенные Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 и Candida albicans8. Недавние исследования также свидетельствуют о росте мутантов с множественной лекарственной устойчивостью из персистных субпопуляций11,12. Значительные усилия в этой области показали, что механизмы сохранения являются весьма сложными и разнообразными; известно, что как стохастические и детерминированныефакторы,связанные с реакцией SOS13,14,активных форм кислорода (АФК)15,системами токсина/антитоксина (ТА)16,аутофагией или самоперевариванием17 и строгим ответом18, связанным с ppGpp, облегчают образование персистаторов.
Несмотря на значительный прогресс в понимании фенотипа персистенции, влияние осмолитов на бактериальную персистенцию не было полностью понято. Поскольку поддержание оптимального осмотического давления является необходимостью для роста клеток, правильного функционирования и выживания, углубленное изучение осмолитов может привести к потенциальным целям для антиперсистентных стратегий. Несмотря на трудоемкий, высокопроизводительный скрининг является очень эффективным подходом к выявлению метаболитов и других химических веществ, которые играют решающую роль в фенотипе персистенции19,20. В этой работе мы обсудим наш опубликованный метод19,где мы использовали микрочипы, т.е. 96 пластин скважин, содержащих различные осмолиты (например, хлорид натрия, мочевину, нитрит натрия, нитрат натрия, хлорид калия), для выявления осмолитов, которые существенно влияют на персистенцию E. coli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Бактериальные персистенты определяются как небольшая субпопуляция фенотипических вариантов со способностью выдерживать высокие концентрации антибиотиков. Они являются важной проблемой для здоровья, поскольку они связаны с рецидивирующими хроническими инфекциями. Хотя стохастическая и детерминированная динамика механизмов, связанных со стрессом, как известно, играет значительную роль в персистентности, механизмы, лежащие в основе фенотипического перехода в состояние персистентности / из него, не полностью поняты. Хотя факторы стойкости, вызванные сигналами окружающей среды (например, истощение источников углерода, азота и кислорода), были широко изучены, воздействие осмолитов на стойкость еще предстоит определить. Используя микрочипы (т.е. 96 пластин скважин, содержащих различные химические вещества), мы разработали подход к выяснению влияния различных осмолитов на персистенцию кишечной палочки с высокой пропускной способностью. Этот подход является преобразующим, поскольку он может быть легко адаптирован для других скрининговых массивов, таких как панели лекарств и библиотеки нокаута генов.

На рисунке 1 описан наш экспериментальный протокол. Эксперименты с циклом разбавления/роста (см. Протокол 2) были адаптированы из исследования, проведенного Keren et al.5, для устранения персистентов, происходящих из ночных культур. Рисунок 2А пред...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

В этой статье мы представляем высокопроизводительную стратегию скрининга для выявления химических соединений, таких как осмолиты, которые оказывают значительное влияние на бактериальную персистенцию.

Высокопроизводительный скрининг химических соединений для выяснения их влияния на бактериальную персистенцию

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Протокол, описанный здесь, позволяет идентифицировать условия, которые могут значительно повлиять на бактериальную персистенцию с высокой пропускной способностью. Этот метод легко адаптируется для скрининга для различных областей, таких как панели лекарств, библиотеки генов и многое другое. Поскольку метод включает в себя различные поду этапы, которые должны проводиться одновременно, визуальная демонстрация может помочь исследователям управлять своим временем для получения точных результатов.Начните с подготовки культур клеток микрочипов. Перенесите 250 микролитров экспоненциальных фазовых ячеек в 25 миллилитров свежей модифицированной среды LB в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Затем аккуратно перемешайте клеточную суспензию, чтобы сделать ее однородной.Переложите разбавленный клеточный суспензию в стерильный резервуар объемом 50 миллилитров. Используя многоканальный пипетку, перенесите 150 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку пластины микрочипа, содержащей различные химические вещества. Микрочипы также могут быть сгенерированы вручную по методу, описанию в текстовой рукописи.Накройте пластину микрочипов газопроницаемой потолочной мембраной и инкубирует ее в орбитальном шейкере при 37 градусах Цельсия и 250 оборотах в минуту в течение 24 часов. Чтобы сделать пластины для анализа персистенции, подготовьте 25 миллилитров модифицированной среды LB, содержащей пять микрограммов на миллилитр офлоксацина в 50-миллилитрной центрифужной трубке, и перенесите эту среду в стерильный резервуар. Перенесите 190 микролитров модифицированной среды LB в каждую скважину общей пластины с плоским дном 96 скважин.После 24-часовой инкубации извлекают микрочип из шейкера и переносят 10 микролитров клеточных культур из микрочипы в лунки пластины для анализа персистента, содержащей модифицированную среду LB с офлоксацином. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии с пластины эссе и последовательно разбавьте ее три раза в 290 микролитрах раствора PBS, используя пластину с круглым дном 96 скважин и многоканальной пипетки. Затем найдите 10 микролитров всех последовательно разбавленных клеточных суспензий на свежих агаровых пластинах без антибиотиков.Накройте пластину для анализа персистера газопроницаемой потолочной мембраной и инкубируете ее в орбитальном шейкере при 37 градусах Цельсия и 250 оборотах в минуту в течение шести часов. После шестичасовой инкубации повторите серийное разведение и пятнистость на агаровых пластинах. Инкубировать агариные пластины в течение 16 часов при 37 градусах Цельсия.Затем подсчитайте колониеобразующие единицы или КОЕ. Используйте уровни КОЕ до и через шесть часов после лечения антибиотиками, чтобы рассчитать персистентную фракцию в каждой скважине. Количество КОЕ перед лечением OFX также помогает оценить влияние осмолитов на жизнеспособность e coli.Перенесите 250 микролитров экспоненциальных фазовых ячеек в 25 миллилитров свежей модифицированной среды LB, содержащей осмолит, идентифицированный в результате скрининга микрочипов. Высиживание колбы в орбитальном шейкере при 250 об/мин и 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Через 24 часа извлеките колбу из шейкера и переложите 250 микролитров клеточной культуры на 25 миллилитров свежей модифицированной среды LB в 250-миллилитровой перегородке.Добавьте 25 микролитров раствора офлоксацина в клеточную суспензию и аккуратно встряхните колбу, чтобы сделать культуру анализа однородной. Высиживание колбы в шейкере при 37 градусах Цельсия и 250 об/мин. Каждый час во время лечения, включая момент времени перед добавлением Офлоксацина, переносят один миллилитр культуры анализа из колбы в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку и центрифугируют ее в 17 000 раз G в течение трех минут.Удалите 950 микролитров супернатанта и трижды промыте клетки 950 микролитрами PBS. После окончательной промывки повторно суспендируют ячейку гранулы в 100 микролитрах раствора PBS. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии и последовательно разбавьте ее шесть раз 90 микролитрами PBS внутри пластины с круглым дном из 96 скважин.Надените 10 микролитров разбавленной клеточной суспензии на пластину без антибиотика. Чтобы увеличить предел обнаружения, наклеиваем оставшиеся 90 микролитров клеточной суспензии на свежую агаровую пластину. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в течение 16 часов, затем считать КОЕ.Здесь показано репрезентативное изображение агаровых пластин, используемых для определения уровней КОЕ клеточных культур до и после обработки OFX. Первый столбец является контрольной группой. Вторая колонка содержит клетки, которые были культивированы в 100 миллимолярных нитратах натрия, а третья колонка содержит клетки, которые культивировались в 60 миллимолярных нитратах натрия.Для простоты здесь сосредоточены только два осмолита. Здесь показано графическое представление данных КОЕ с пластин и персистентных фракций клеточных культур, протестированных в 96 пластинах скважин. Для расчета фракций количество персистаторов нормализовали количество клеток, полученных до лечения антибиотиками.Для получения пофазных кривых уничтожения клетки культивировали в 25 миллилитрах модифицированной среды LB с указанными осмолитами и сбитыми с толку колбами в течение 24 часов, а затем переносили в колбы для персистентного анализа для перечисления персистентов. При попытке этого протокола имейте в виду, что обнаружение клеток на агаровой пластине является трудоемким и требует фокусировки. Ошибка во время этапа может привести к перекрестному загрязнению среди тестируемых условий.Поэтому важно практиковать обнаружение нескольких образцов одновременно перед экспериментом. Следуя этому протоколу, панели лекарств и библиотеки мутантных клеток могут быть проверены для изучения воздействия на персистенцию. С помощью этого скрининга мы выявили ряд осмолитов и состояний PS, которые оказывают значительное влияние на бактериальную персистенцию.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Количественные высокой пропускной Single-клеточной цитотоксичности анализа для Т-клеток

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Микропланшет анализа для оценки химического воздействия на RBL-2H3 дегрануляцию тучных клеток: Влияние триклозан без использования органического растворителя

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в<em&gt; Brucella</em&gt; Инфицирование клеток HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Создание высокопроизводительного скрининга платформы для оценки гетерогенности амплификации гена HER2 в опухоли молочной железы

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Высок объём шигеллезом-конкретные бактерицидной Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Автоматизированное, высокопроизводительное обнаружение бактериальной приверженности клеткам-хозяевам

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...