Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
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Nos gustaría agradecer a los miembros de Orman Lab por sus valiosos aportes durante este estudio. Este estudio fue financiado por el premio de transición profesional K22AI125468 de los NIH/NIAID y una beca de inicio de la Universidad de Houston.

1. Preparación de medio de crecimiento, solución de ofloxacina y acciones de células de E. coli
<ol><li>Medio regular Luria-Bertani (LB): Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura en agua desionizada (DI). Esterilizar el medio por autoclave.</li>
	<li>Placas de agar LB: Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 15 g/L de agar en agua DI y esterilizar el medio por autoclave. A la temperatura deseada (~55 °...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

El ensayo persistente de alto rendimiento descrito aquí se desarrolló para dilucidar los efectos de varios productos químicos sobre la persistencia de E. coli. Además de las placas PM comerciales, los microarrays se pueden construir manualmente como se describe en el paso 4.2. Además, el protocolo presentado aquí es flexible y se puede utilizar para examinar otros microarrays, como paneles de medicamentos y bibliotecas celulares, que están en formatos de placa de 96 pozos. Las condiciones experimentales, ...

Los cultivos bacterianos contienen una pequeña subpoblación de células persistentes que son temporalmente tolerantes a niveles inusualmente altos de antibióticos. Las células persistentes son genéticamente idénticas a sus parientes sensibles a los antibióticos, y su supervivencia se ha atribuido a la inhibición transitoria del crecimiento1. Las células persistentes fueron descubiertas por primera vez por Gladys Hobby2, pero el término fue utilizado por primera vez por Joseph Bigger cuando las identificó en cultivos de Staphylococcus pyogenes tratados con penicilina3. Un estudio seminal publicado por Balaban et al.4 descubrió dos tipos persistentes: variantes de tipo I que se forman principalmente por paso a través de la fase estacionaria, y variantes de tipo II que se generan continuamente durante el crecimiento exponencial. Los persistentes son detectados por ensayos clonogénicos de supervivencia, en los que se toman muestras de cultivo a varios intervalos durante los tratamientos con antibióticos, se lavan y se platean en un medio de crecimiento típico para contar las células sobrevivientes que pueden colonizarse en ausencia de antibióticos. La existencia de persistientes en un cultivo celular se evalúa mediante una curva de muerte bifásica4,5 donde la desintegración exponencial inicial indica la muerte de células sensibles a los antibióticos. Sin embargo, la tendencia a matar disminuye con el tiempo, lo que eventualmente conduce a una región de meseta que representa las células persistentes sobrevivientes.
Las células persistentes se han asociado con diversas enfermedades como la tuberculosis6,la fibrosis quística7,la candidiasis8 y las infecciones del tracto urinario9. Se encontró que casi todos los microorganismos analizados hasta el momento generan fenotipos persistentes, incluyendo Mycobacterium tuberculosis6altamente patógena, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 y Candida albicans8. Estudios recientes también proporcionan evidencia del aumento de mutantes multirresistentes de subpoblaciones persistentes11,12. Los esfuerzos sustanciales en esta esfera han revelado que los mecanismos de persistencia son muy complejos y diversos; Se sabe que tanto los factores estocásticos como los deterministas asociados con la respuesta SOS13,14,las especies reactivas de oxígeno (ROS)15,los sistemas toxina/antitoxina (TA)16,la autofagia o autogestión17 y la respuesta rigurosa relacionada con ppGpp18 son conocidos por facilitar la formación de persistidores.
A pesar del progreso significativo en la comprensión del fenotipo de persistencia, los efectos de los osmolitos sobre la persistencia bacteriana no se han entendido completamente. Dado que el mantenimiento de la presión osmótica óptima es una necesidad para el crecimiento, el funcionamiento adecuado y la supervivencia de las células, un estudio en profundidad de los osmolitos podría conducir a posibles objetivos para las estrategias anti-persistentes. Aunque laborioso, la detección de alto rendimiento es un enfoque muy eficaz para identificar metabolitos y otras sustancias químicas que desempeñan un papel crucial en el fenotipo de persistencia19,20. En este trabajo, discutiremos nuestro método publicado19,donde hemos utilizado microarrays, es decir, 96 placas de pozo que contienen varios osmolitos (por ejemplo, cloruro de sodio, urea, nitrito de sodio, nitrato de sodio, cloruro de potasio), para identificar osmolitos que influyen significativamente en la persistencia de E. coli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Los persistentes bacterianos se definen como una pequeña subpoblación de variantes fenotípicas con la capacidad de tolerar altas concentraciones de antibióticos. Son un problema de salud importante, ya que se han asociado con infecciones crónicas recurrentes. Aunque se sabe que la dinámica estocástica y determinista de los mecanismos relacionados con el estrés juega un papel significativo en la persistencia, los mecanismos subyacentes al cambio fenotípico hacia / desde el estado de persistencia no se entienden completamente. Si bien los factores de persistencia desencadenados por las señales ambientales (por ejemplo, el agotamiento de las fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno) han sido ampliamente estudiados, los impactos de los osmolitos en la persistencia aún no se han determinado. Utilizando microarrays (es decir, 96 placas de pozo que contienen diversos productos químicos), hemos diseñado un enfoque para dilucidar los efectos de varios osmolitos en la persistencia de Escherichia coli de una manera de alto rendimiento. Este enfoque es transformador, ya que se puede adaptar fácilmente para otras matrices de cribado, como paneles de medicamentos y bibliotecas de eliminación de genes.

La Figura 1 describe nuestro protocolo experimental. Los experimentos del ciclo de dilución/crecimiento (ver Protocolo 2) fueron adaptados de un estudio realizado por Keren et al.5 para eliminar los persistidores originarios de los cultivos nocturnos. La Figura 2A es una imagen representativa de las placas de agar utilizadas para determinar los niveles de UFC de los cultivos celulares antes y después del tratamiento con OFX. En estos ex...

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High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

En este documento de método, presentamos una estrategia de cribado de alto rendimiento para identificar compuestos químicos, como los osmolitos, que tienen un impacto significativo en la persistencia bacteriana.

Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

El protocolo descrito aquí permite identificar las condiciones que pueden afectar significativamente la persistencia bacteriana de una manera de alto rendimiento. Este método es fácilmente adaptable a la detección de varias áreas, tales como paneles de medicamentos, bibliotecas de genes y más. Como el método incluye varios pasos secundarios, que deben llevarse a cabo simultáneamente, la demostración visual puede ayudar a los investigadores a administrar su tiempo para obtener resultados precisos.Comience por preparar cultivos celulares de microarrays. Transfiera 250 microlitros de células de fase exponencial a 25 mililitros de medio LB fresco modificado en un tubo centrífuga de 50 mililitros. Luego mezcle suavemente la suspensión celular para que sea homogénea.Transfiera la suspensión de celda diluida a un depósito estéril de 50 mililitros. Usando una pipeta multicanal, transfiera 150 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de microarray que contenga varios productos químicos. Los microarrays también se pueden generar manualmente siguiendo el método descrito en el manuscrito del texto.Cubra la placa de microarrays con una membrana de techo permeable al gas e incubarla en una coctelera orbital a 37 grados Celsius y 250 RPM durante 24 horas. Para hacer placas de ensayo persistentes, prepare 25 mililitros de medio LB modificado que contenga cinco microgramos por mililitro de Ofloxacina en un tubo centrífugo de 50 mililitros y transfiera este medio a un depósito estéril. Transfiera 190 microlitros del medio LB modificado a cada pozo de una placa genérica de fondo plano de 96 pozos.Después de la incubación de 24 horas, retire el microarray de la coctelera y transfiera 10 microlitros de cultivos celulares del microarray a los pozos de la placa de ensayo persistente que contiene el medio LB modificado con Ofloxacina. Tome 10 microlitros de suspensiones celulares de la placa de ensayo persistente y diluya en serie tres veces en 290 microlitros de solución PBS usando una placa redonda inferior de 96 pozos y una pipeta multicanal. A continuación, detecte 10 microlitros de todas las suspensiones celulares diluidas en serie en placas de agar fresco libres de antibióticos.Cubra la placa de ensayo persistente con una membrana de techo permeable al gas e incubarla en una coctelera orbital a 37 grados Celsius y 250 RPM durante seis horas. Después de la incubación de seis horas, repita la dilución en serie y la manchado en placas de agar. Incubar las placas de agar durante 16 horas a 37 grados centígrados.A continuación, cuente las unidades formantes de colonias o UFC. Utilice los niveles de UFC antes y seis horas después del tratamiento antibiótico para calcular la fracción persistente en cada pozo. Los recuentos de UFC antes del tratamiento con OFX también ayudan a evaluar los efectos de los osmolitos sobre la viabilidad de e coli.Transfiera 250 microlitros de células de fase exponencial a 25 mililitros de medio LB fresco modificado que contiene la osmolita identificada a partir del cribado de microarrays. Incubar el matraz en una coctelera orbital a 250 RPM y 37 grados Centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el matraz de la coctelera y transfiera 250 microlitros del cultivo celular a 25 mililitros de medio LB fresco modificado en un matraz desconcertado de 250 mililitros.Añadir 25 microlitros de solución madre de Ofloxacina a la suspensión celular y agitar el matraz suavemente para que el cultivo ensayado sea homogéneo. Incubar el matraz en una coctelera a 37 grados centígrados y 250 RPM. A cada hora durante el tratamiento, incluido un punto de tiempo antes de la adición de Ofloxacina, transfiera un mililitro del cultivo de ensayo del matraz a un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y centrífugalo a 17,000 veces G durante tres minutos.Retire 950 microlitros de sobrenadante y lave las células tres veces con 950 microlitros de PBS. Después del lavado final, vuelva a suspender el pellet celular en 100 microlitros de solución de PBS. Tome 10 microlitros de la suspensión celular y diluya en serie seis veces con 90 microlitros de PBS dentro de una placa inferior redonda de 96 pozos.Detecte 10 microlitros de las suspensiones de células diluidas en una placa de agar libre de antibióticos. Para aumentar el límite de detección, platee los 90 microlitros restantes de suspensión celular en una placa de agar fresco. Incubar las placas a 37 grados Centígrados durante 16 horas, luego contar las UFC.Una imagen representativa de las placas de agar usadas para determinar niveles de CFU de cultivos celulares antes y después del tratamiento de OFX se muestra aquí. La primera columna es el grupo de control. La segunda columna tiene células que se cultivaron en nitrato de sodio de 100 milimolares y la tercera columna contiene células que se cultivaron en nitrato de sodio de 60 milimolares.Para simplificar, sólo dos osmolitos se centran en aquí. Aquí se muestra una representación gráfica de los datos de la UFC de las placas y fracciones persistentes de los cultivos celulares probados en 96 placas de pozos. Para calcular las fracciones, las cuentas persistentes fueron normalizadas a las cuentas de célula obtenidas antes del tratamiento antibiótico.Para generar curvas de muerte porfásicas, las células se cultivaron en 25 mililitros de medio LB modificado con los osmolitos indicados y frascos desconcertados durante 24 horas, luego se transfirieron a frascos de ensayo persistentes para la enumeración persistente. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la detección de las células en la placa de agar es intensiva en mano de obra y requiere enfoque. Un error durante el paso puede conducir a la contaminación cruzada entre las condiciones que se están probando.Por lo tanto, es importante practicar la detección de múltiples muestras simultáneamente antes del experimento. Siguiendo este protocolo, los paneles de fármacos y las bibliotecas de células mutantes pueden ser examinados para estudiar los impactos en la persistencia. Con esta investigación, hemos identificado un número de osmolitos y de condiciones del PS que tengan un impacto significativo en persistencia bacteriana.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en<em&gt; Brucella</em&gt; Infección de células Hela

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Construcción de una plataforma de proyección de alto rendimiento para evaluar la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 en cáncer de mama

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Un alto rendimiento Shigella-ensayo bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...