Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmarna i Orman Lab för deras värdefulla insatser under denna studie. Denna studie finansierades av NIH/ NIAID K22AI125468 karriärövergångsutmärkelse och ett university of Houston startup-bidrag.

1. Beredning av tillväxtmedium, avloxacinlösning och E. coli-celllager
<ol><li>Vanligt Luria-Bertani -medium ( LB): Tillsätt 10 g/L tryptone, 10 g/L natriumklorid (NaCl) och 5 g/L jästextrakt i avjoniserat (DI) vatten. Sterilisera mediet genom autoklavering.</li>
	<li>LB agarplattor: Tillsätt 10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g/L jästextrakt och 15 g/L agar i DI-vatten och sterilisera mediet genom autoklavering. Vid önskad temperatur (~55 °C), häll ~30 ml agarmedium i fyrkantiga plattor...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

Den höga genomströmning persister analys beskrivs här utvecklades för att klargöra effekterna av olika kemikalier på E. coli persistens. Förutom kommersiella PM-plattor kan mikroarrayer konstrueras manuellt enligt beskrivningen i steg 4.2. Dessutom är protokollet som presenteras här flexibelt och kan användas för att screena andra mikroarrays, såsom läkemedelspaneler och cellbibliotek, som finns i 96 brunnsplåtformat. Försöksförhållandena inklusive tillväxtfasen, vaccinationshastigheten och me...

Bakteriekulturer innehåller en liten subpopulation av persisterceller som tillfälligt är toleranta mot ovanligt höga nivåer av antibiotika. Persisterceller är genetiskt identiska med deras antibiotikakänsliga släktingar, och deras överlevnad har tillskrivits övergående tillväxthämning1. Persister celler upptäcktes först av Gladys Hobby2 men termen användes först av Joseph Bigger när han identifierade dem i penicillin-behandlade Staphylococcus pyogenes kulturer3. En seminal studie publicerad av Balaban et al.4 upptäckte två persistertyper: typ I-varianter som främst bildas genom passage genom den stationära fasen och typ II-varianter som kontinuerligt genereras under den exponentiella tillväxten. Persisters detekteras av clonogenic överlevnadsanalyser, där odlingsprover tas med olika intervall under antibiotikabehandlingar, tvättas och pläteras på ett typiskt tillväxtmedium för att räkna de överlevande cellerna som kan kolonisera i avsaknad av antibiotika. Förekomsten av persisters i en cellkultur bedöms av en bifasiskdödskurva 4,5 där det första exponentiella förfallet indikerar döden av antibiotikakänsliga celler. Men mördartrenden minskar med tiden, vilket så småningom leder till en platåregion som representerar de överlevande persistercellerna.
Persister celler har associerats med olika sjukdomar såsom tuberkulos6,cystisk fibros7,candidiasis8 och urinvägsinfektioner9. Nästan alla mikroorganismer som testats hittills konstaterades generera persister fenotyper, inklusive högpatogen Mycobacterium tuberkulos6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 och Candida albicans8. Nyligen genomförda studier ger också bevis för ökningen av multiresistenta mutanter från persister subpopulationer11,12. Betydande insatser på detta område har visat att uthållighetsmekanismerna är mycket komplexa och olika. Både stokastiska och deterministiska faktorer i samband med SOS svar13,14,reaktiva syre arter (ROS)15,toxin/antitoxin (TA) system16,autofagi eller självsmälta17 och ppGpp-relaterade strängasvar 18 är kända för att underlätta persister bildas.
Trots betydande framsteg i förståelsen av den envishet fenotyp, effekterna av osmolyter på bakteriell persistens har inte förståtts fullt ut. Eftersom upprätthållandet av optimalt osmotiskt tryck är en nödvändighet för cellernas tillväxt, funktion och överlevnad, kan en djupgående studie av osmolyter leda till potentiella mål för anti-persister strategier. Även om mödosam screening med hög genomströmning är ett mycket effektivt tillvägagångssätt för att identifiera metaboliter och andra kemikalier som spelar en avgörande roll i den envisa fenotyp19,20. I detta arbete kommer vi att diskutera vår publicerade metod19, där vi har använt mikroarrays, dvs 96 brunnsplattor som innehåller olika osmolyter (t.ex. natriumklorid, urea, natriumnitrit, natriumnitrat, kaliumklorid), för att identifiera osmolyter som väsentligt påverkar E. coli persistens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Bakteriell persisters definieras som en liten subpopulation av fenotypiska varianter med förmågan att tolerera höga koncentrationer av antibiotika. De är ett viktigt hälsoproblem eftersom de har associerats med återkommande kroniska infektioner. Även om stokastisk och deterministisk dynamik av stress-relaterade mekanismer är kända för att spela en betydande roll i persistens, mekanismer som ligger till grund för fenotypiska övergången till/från persistens tillstånd är inte helt förstådda. Även om beständighetsfaktorer som utlöses av miljösignaler (t.ex. utarmning av kol-, kväve- och syrekällor) har studerats i stor utsträckning, har osmolytornas inverkan på persistens ännu inte fastställts. Med hjälp av mikroarrays (dvs. 96 brunnsplattor som innehåller olika kemikalier) har vi utformat ett tillvägagångssätt för att belysa effekterna av olika osmolyter på Escherichia coli persistens på ett högt genomströmningssätt. Detta tillvägagångssätt är omvälvande eftersom det lätt kan anpassas för andra screeningsystem, såsom läkemedelspaneler och gen knockout-bibliotek.

Figur 1 beskriver vårt experimentella protokoll. Utspädnings-/tillväxtcykelexperimenten (se protokoll 2) anpassades från en studie utförd av Keren et al.5 för att eliminera persisters som härrör från över natten kulturer. Figur 2A är en representativ bild av agarplattor som används för att bestämma CFU-nivåerna av cellkulturer före och efter OFX-behandling. I dessa experiment odlades celler i modifierat LB medium med osmol...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

I detta metoddokument presenterar vi en screeningstrategi med hög genomströmning för att identifiera kemiska föreningar, såsom osmolyter, som har en betydande inverkan på bakteriell persistens.

Screening av kemiska föreningar med hög genomströmning för att belysa deras effekter på bakteriell persistens

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att identifiera tillstånd som avsevärt kan påverka bakteriell persistens på ett höggenomströmnings sätt. Denna metod är lätt anpassningsbar för att screena för olika områden, såsom läkemedelspaneler, genbibliotek och mer. Eftersom metoden innehåller olika delsteg, som ska genomföras samtidigt, kan visuell demonstration hjälpa forskare att hantera sin timing för att få exakta resultat.Börja med att förbereda mikroarraycellkulturer. Överför 250 mikroliter exponentiella fasceller till 25 milliliter färsk modifierat LB-medium i ett 50 milliliter centrifugerör. Blanda sedan försiktigt cellfjädringen för att göra den homogen.Överför den utspädda cellupphängningen till en steril reservoar på 50 milliliter. Använd en flerkanalspipett och överför 150 mikroliter av cellupphängningen till varje brunn på en mikroarrayplatta som innehåller olika kemikalier. Mikroarrayer kan också genereras manuellt enligt den metod som beskrivs i textmanuskriptet.Täck mikroarrayplattan med ett gaspermeabelt takmembran och inkubera den i en orbital shaker vid 37 grader Celsius och 250 RPM i 24 timmar. För att göra persister analysplattor, förbered 25 milliliter modifierat LB-medium som innehåller fem mikrogram per milliliter Ofloxacin i ett 50 milliliter centrifugerör och överför detta medium till en steril reservoar. Överför 190 mikroliter av det modifierade LB-mediet till varje brunn på en generisk platt botten 96 brunnsplatta.Efter 24 timmars inkubation, ta bort mikroarrayen från skakapparaten och överför 10 mikroliter cellkulturer från mikroarrayen till brunnarna på persisteranalysplattan som innehåller modifierat LB-medium med Ofloxacin. Ta 10 mikroliter cellupphängningar från persister essäplattan och späd den seriellt tre gånger i 290 mikroliter PBS-lösning med en rund botten 96 brunnsplatta och en flerkanalspipett. Upptäck sedan 10 mikroliter av alla seriellt utspädda cellupphängningar på antibiotikafria färska agarplattor.Täck persisteranalysplattan med ett gaspermeabelt takmembran och inkubera den i en orbital shaker vid 37 grader Celsius och 250 RPM i sex timmar. Efter sex timmars inkubation, upprepa seriell utspädning och spotting på agarplattor. Inkubera agarplattorna i 16 timmar vid 37 grader Celsius.Räkna sedan koloniformningsenheterna eller CFUs. Använd CFU-nivåerna före och sex timmar efter antibiotikabehandlingen för att beräkna den persisterfraktionen i varje brunn. CFU räknas före OFX-behandlingen hjälper också till att bedöma osmoliternas effekter på e coli livskraft.Överför 250 mikroliter exponentiella fasceller till 25 milliliter färsk modifierat LB-medium som innehåller osmolit som identifierats från mikroarrayscreeningen. Inkubera kolven i en orbital shaker vid 250 varv/min och 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter 24 timmar, ta bort kolven från skakapparaten och överför 250 mikroliter av cellkulturen till 25 milliliter färsk modifierat LB-medium i en 250 milliliter baffelkolv.Tillsätt 25 mikroliter Ofloxacin-stamlösning till cellupphängningen och skaka kolven försiktigt för att göra analyskulturen homogen. Inkubera kolven i en skakapparat vid 37 grader Celsius och 250 varv/min. Vid varje timme under behandlingen, inklusive en tidpunkt före tillsats av Ofloxacin, överför du en milliliter av analyskulturen från kolven till ett mikrocentrifugrör på 1,5 milliliter och centrifugerar det vid 17 000 gånger G i tre minuter.Ta bort 950 mikroliter supernatant och tvätta cellerna tre gånger med 950 mikroliter PBS. Efter den slutliga tvätten, suspendera cellpelleten i 100 mikroliter PBS-lösning. Ta 10 mikroliter av cellupphängningen och späd den sex gånger med 90 mikroliter PBS inuti en 96 väl rund bottenplatta.Spot 10 mikroliter av de utspädda cellupphängningar på en antibiotikafri agarplatta. För att öka detektionsgränsen, plätera de återstående 90 mikroliter cellupphängningen på en färsk agarplatta. Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i 16 timmar och räkna sedan CFUs.En representativ bild av agarplattor som används för att bestämma CFU nivåer av cellkulturer före och efter OFX behandling visas här. Den första kolumnen är kontrollgruppen. Den andra kolumnen har celler som odlades i 100 millimolar natriumnitrat och den tredje kolumnen innehåller celler som odlades i 60 millimolar natriumnitrat.För enkelhetens skull är endast två osmoliter fokuserade på här. En grafisk representation av CFU-data från plattorna och persister fraktioner av de cellkulturer som testats i 96 brunnsplattor visas här. För att beräkna fraktionerna normaliserades persisterantalet till de cellantal som erhölls före antibiotikabehandlingen.För att generera byfasiska kill kurvor odlades cellerna i 25 milliliter modifierat LB medium med de angivna osmoliterna och förbryllade kolvarna i 24 timmar och överfördes sedan till persister analyskolvar för persister uppräkning. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att upptäcka cellerna på agar plattan är arbetsintensiv och kräver fokus. Ett fel under steget kan leda till korskontaminering bland de förhållanden som testas.Så det är viktigt att öva på att upptäcka flera prover samtidigt före experimentet. Enligt detta protokoll kan läkemedelspaneler och mutantcellbibliotek screenas för att studera effekterna på uthålligheten. Med denna screening har vi identifierat ett antal osmoliter och PS-tillstånd som har en betydande inverkan på bakteriell persistens.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

En mikroplatta analys för att bedöma Kemiska Effekter på RBL-2H3 mastcelldegranulering: Effekter av Triclosan utan användning av ett organiskt lösningsmedel

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Mikroskopi baserade analyser för high-throughput screening av Host faktorer som<em&gt; Brucella</em&gt; Infektion av HeLa-celler

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

En fluorescensbaserade lymfocyter analys Lämplig för high-throughput screening av små molekyler

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Bygga upp en High-throughput Screening plattform att bedöma heterogenitet HER2 genen amplifiering i bröstcancer

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

En hög genomströmning plattform för Screening av Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Automatiserad, hög genomströmningsdetektering av bakteriell efterlevnad av värdceller

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...