Name: high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

Orman Lab üyelerine bu çalışma sırasındaki değerli girdileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH/NIAID K22AI125468 kariyer geçiş ödülü ve Houston Üniversitesi başlangıç hibesi tarafından finanse edildi.

1. Büyüme ortamının hazırlanması, ofloksasin çözeltisi ve E. coli hücre stokları
<ol><li>Normal Luria-Bertani (LB) ortamı: Deiyonize (DI) suya 10 g/L tripon, 10 g/L sodyum klorür (NaCl) ve 5 g/L maya özü ekleyin. Otomatik kapatarak ortamı sterilize edin.</li>
	<li>LB agar plakaları: DI suyuna 10 g/L tripon, 10 g/L NaCl, 5 g/L maya özü ve 15 g/L agar ekleyin ve ortamı otomatik kapatarak sterilize edin. İstenilen sıcaklıkta (~55 °C), kare plakalara (10 x 10 cm) ~30 mL agar...

<ol>
	<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells,+dormancy+and+infectious+disease.">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li><li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin.">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation.">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials.">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li><li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters.">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li><li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis.">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li><li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells.">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li><li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides.">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li><li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics.">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li><li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic.">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177 (2019).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates.">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li><li>D&#246;rr, T., Lewis, K., Vuli&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli.">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760 (2009).</li><li>V&#246;lzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery.">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li><li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals.">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li><li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci.">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li><li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli.">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983 (2015).</li><li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+(p)ppGpp+synthesis.">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li><li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters.">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393 (2020).</li><li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence.">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472 (2020).</li><li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li><li>Luidalepp, H., J&#245;ers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence.">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+The+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008 (2006).</li><li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli.">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li><li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157:H7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy.">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li></ol>

Burada açıklanan yüksek verim kalıcı tahlili, çeşitli kimyasalların E. coli kalıcılığı üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için geliştirilmiştir. Ticari PM plakalarına ek olarak, mikroarraylar adım 4.2'de açıklandığı gibi manuel olarak inşa edilebilir. Ayrıca, burada sunulan protokol esnektir ve 96 kuyu plakası formatında olan ilaç panelleri ve hücre kütüphaneleri gibi diğer mikroarrayları taramak için kullanılabilir. Büyüme evresi, aşılama oranı ve ortam dahil olmak ...

Bakteri kültürleri, alışılmadık derecede yüksek antibiyotik seviyelerine geçici olarak hoşgörülü olan kalıcı hücrelerin küçük bir alt nüfusunu içerir. Persister hücreleri genetik olarak antibiyotiğe duyarlı kins ile aynıdır ve hayatta kalmaları geçici büyüme inhibisyonlarına bağlanmıştır1. Persister hücreleri ilk olarak Gladys Hobby2 tarafından keşfedildi, ancak bu terim ilk olarak Joseph Bigger tarafından penisilinle tedavi edilen Staphylococcus pyogenes kültürlerinde tanımlandığında kullanıldı3. Balaban ve ark.4 tarafından yayınlanan ufuk açıcı bir çalışma iki kalıcı tip keşfetti: öncelikle sabit fazdan geçişle oluşturulan tip I varyantları ve üstel büyüme sırasında sürekli olarak oluşturulan tip II varyantları. Kalıcılar, antibiyotik tedavileri sırasında çeşitli aralıklarla kültür örneklerinin alındığı, yıkandığı ve antibiyotik yokluğunda kolonileşebilen hayatta kalan hücreleri saymak için tipik bir büyüme ortamına kaplandığı klonojenik sağkalım tahlilleri ile tespit edilir. Bir hücre kültüründe kalıcıların varlığı, ilk üstel çürümenin antibiyotiğe duyarlı hücrelerin ölümünü gösterdiği bifazik öldürme eğrisi4,5 ile değerlendirilir. Bununla birlikte, öldürme eğilimi zamanla azalır ve sonunda hayatta kalan kalıcı hücreleri temsil eden bir plato bölgesine yol açmaktadır.
Kalıcı hücreler tüberküloz6, kistik fibrozis7,kandidiyazis8 ve idrar yolu enfeksiyonları9gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Şimdiye kadar test edilen hemen hemen tüm mikroorganizmaların, son derece patojenik Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 ve Candida albicans8dahil olmak üzere kalıcı fenotipler ürettiği bulunmuştur. Son çalışmalar ayrıca kalıcı subpopulasyonlardan multidrug dirençli mutantların yükselişinin kanıtlarını salar11,12. Bu alandaki önemli çabalar, kalıcılık mekanizmalarının son derece karmaşık ve çeşitli olduğunu ortaya koydu; SOS yanıtı13 , 14, reaktif oksijen türleri (ROS)15,toksin/antitoksin (TA) sistemleri16,otofaji veya kendi kendine sindirim17ve ppGpp ile ilgili sıkı yanıt18 ile ilişkili stokastik ve deterministik faktörlerin kalıcı oluşumu kolaylaştırdığı bilinmektedir.
Kalıcılık fenotipini anlamada önemli ilerlemeye rağmen, ozmolitlerin bakteriyel kalıcılık üzerindeki etkileri tam olarak anlaşılamamıştır. Optimal ozmotik basıncın sürdürülmesi hücrelerin büyümesi, düzgün çalışması ve hayatta kalması için bir gereklilik olduğundan, ozmolitlerin derinlemesine incelenmesi anti-persister stratejiler için potansiyel hedeflere yol açabilir. Zahmetli, yüksek verimli tarama, kalıcılık fenotipinde çok önemli bir rol oynayan metabolitleri ve diğer kimyasalları tanımlamak için çok etkili bir yaklaşım olmasına rağmen19,20. Bu çalışmada, E. coli persistence'ı önemli ölçüde etkileyen ozmolitleri tanımlamak için çeşitli ozmolitler (örneğin sodyum klorür, üre, sodyum nitrit, sodyum nitrat, potasyum klorür) içeren 96 kuyu plakası gibi mikroarraylar kullandığımız yayınlanmış yöntem19'utartışacağız.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1204px;" width="1202">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:334px;">14-ml test tube</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">14-959-1B</td>
			<td style="width:507px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E. coli strain MG1655</td>
			<td>Princeton University</td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Brynildsen lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-5161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas permeable sealing membrane</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102097-058</td>
			<td>Sterilized by gamma irradiation and free of cytotoxins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Half-area flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-2</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ofloxacin salt</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103466-232</td>
			<td>HPLC &#8805;97.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenotype microarray (PM-9 and PM-10)</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>N/A</td>
			<td>PM-9 and PM-10 plates contained various osmolytes and buffers respectively</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round-bottom 96-well plate</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5665-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td>Certified ACS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC424345000</td>
			<td>ACS reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrite</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA186680B</td>
			<td>98% purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Square petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875711A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Varioskan lux multi mode microplate reader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00D0</td>
			<td>Used for optical density measurement at 600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast extract</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-100</td>
			<td>Molecular genetics grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening of chemical compounds to elucidate their effects on bacterial persistence

Bakteriyel kalıcılar, yüksek konsantrasyonlarda antibiyotikleri tolere etme yeteneğine sahip fenotipik varyantların küçük bir altopülasyonu olarak tanımlanır. Tekrarlayan kronik enfeksiyonlarla ilişkili oldukları için önemli bir sağlık sorunudur. Strese bağlı mekanizmaların stokastik ve deterministik dinamiklerinin kalıcılıkta önemli rol oynadığı bilinse de, kalıcılık durumuna/kalıcılıktan fenotipik geçişin altında kalan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Çevresel sinyallerin tetiklediği kalıcılık faktörleri (örneğin karbon, azot ve oksijen kaynaklarının tükenmesi) kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, ozmolitlerin kalıcılık üzerindeki etkileri henüz belirlenmemiştir. Mikroarraylar (yani, çeşitli kimyasallar içeren 96 kuyu plakası) kullanarak, çeşitli ozmolitlerin Escherichia coli kalıcılığı üzerindeki etkilerini yüksek verimde aydınlatacak bir yaklaşım tasarladık. Bu yaklaşım, ilaç panelleri ve gen nakavt kütüphaneleri gibi diğer tarama dizileri için kolayca uyarlanabilebileceği için dönüştürücüdür.

Şekil 1 deneysel protokolümüzü açıklar. Seyreltme/büyüme döngüsü deneyleri (bkz. Protokol 2), keren ve ark.5 tarafından gece kültürlerinden kaynaklanan kalıcıları ortadan kaldırmak için yapılan bir çalışmadan uyarlanmıştır. Şekil 2A, OFX tedavisinden önce ve sonra hücre kültürlerinin CFU seviyelerini belirlemek için kullanılan agar plakalarının temsili bir görüntüsüdür. Bu deneylerde hücreler, adı...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence at JoVE.com

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bu yöntem makalesinde, bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkisi olan ozmolitler gibi kimyasal bileşikleri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama stratejisi sunuyoruz.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Burada açıklanan protokol, bakteri kalıcılığını yüksek verimli bir şekilde önemli ölçüde etkileyebilecek koşulları tanımlamayı mümkün kılar. Bu yöntem, ilaç panelleri, gen kütüphaneleri ve daha fazlası gibi çeşitli alanlar için taramaya kolayca uyarlanabilir. Yöntem, aynı anda gerçekleştirilecek çeşitli alt adımları içerdiği için, görsel gösterim araştırmacıların kesin sonuçlar elde etmek için zamanlamalarını yönetmelerine yardımcı olabilir.Mikroarray hücre kültürleri hazırlayarak başlayın. 250 mikrolitre üstel faz hücresini 50 mililitrelik santrifüj tüpünde 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonu homojen hale getirmek için hafifçe karıştırın.Seyreltilmiş hücre süspansiyonu steril bir 50 mililitrelik rezervuara aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 150 mikrolitresini çeşitli kimyasallar içeren bir mikroarray plakasının her kuyusuna aktarın. Mikroarraylar, metin el yazmasında açıklanan yöntemi izleyerek manuel olarak da oluşturulabilir.Mikroarray plakasını gaz geçirgen tavan zarı ile örtün ve 37 santigrat derece ve 250 RPM'de 24 saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Daha kalıcı test plakaları yapmak için, 50 mililitre santrifüj tüpünde mililitre Ofloksasin başına beş mikrogram içeren 25 mililitre modifiye LB ortamı hazırlayın ve bu ortamı steril bir rezervuara aktarın. Modifiye LB ortamının 190 mikrolitresini genel bir düz alt 96 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın.24 saatlik inkübasyondan sonra, mikroarray'ı çalkalayıcıdan çıkarın ve 10 mikrolitre hücre kültürünü mikroarraydan Ofloxacin ile modifiye LB ortamı içeren kalıcı test plakasının kuyularına aktarın. Kalıcı deneme plakasından 10 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve yuvarlak bir alt 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanarak 290 mikrolitre PBS çözeltisinde üç kez seri olarak seyreltin. Daha sonra antibiyotik içermeyen taze agar plakalarında seri olarak seyreltilmiş tüm hücre süspansiyonlarının 10 mikrolitresini tespit edin.Kalıcı test plakasını gaz geçirgen tavan zarı ile örtün ve altı saat boyunca 37 santigrat derece ve 250 RPM'de bir yörünge çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Altı saatlik inkübasyondan sonra, seri seyreltme ve lekelenmeyi agar plakalarında tekrarlayın. Agar plakalarını 37 santigrat derecede 16 saat kuluçkaya yatırın.Daha sonra koloni oluşturan birimleri veya CFO'ları sayın. Her kuyudaki kalıcı fraksiyonu hesaplamak için antibiyotik tedavisinden önce ve altı saat sonra CFU seviyelerini kullanın. OFX tedavisinden önce CFU sayar, osmolites'in e coli canlılığı üzerindeki etkilerini değerlendirmeye de yardımcı yardımcıdır.250 mikrolitre üstel faz hücresini mikroarray taramasından tanımlanan osmolit içeren 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın. Matarayı 250 RPM ve 37 santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda 24 saat boyunca kuluçkaya yatır. 24 saat sonra şişeyi çalkalayıcıdan çıkarın ve hücre kültürünün 250 mikrolitresini 250 mililitrelik şaşkın bir şişede 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın.Hücre süspansiyonu için 25 mikrolitre Ofloxacin stok çözeltisi ekleyin ve tahlil kültürünü homojen hale getirmek için şişeyi hafifçe sallayın. Şişeyi 37 santigrat derece ve 250 RPM'de bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Tedavi sırasında her saat, Ofloxacin'in eklenmesinden önceki bir zaman noktası da dahil olmak üzere, test kültürünün bir mililitresini şişeden 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın ve üç dakika boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin.950 mikrolitre süpernatantı çıkarın ve hücreleri 950 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücre peletini 100 mikrolitre PBS çözeltisinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini alın ve 96 kuyu yuvarlak alt plakanın içinde 90 mikrolitre PBS ile altı kez seri olarak seyreltin.Seyreltilmiş hücre süspansiyonlarının 10 mikrolitresini antibiyotiksiz bir agar plakasında tespit edin. Algılama sınırını artırmak için, kalan 90 mikrolitre hücre süspansiyonunun plakasını taze bir agar plakasına koyun. Plakaları 16 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, sonra CFO'ları sayın.OFX tedavisinden önce ve sonra hücre kültürlerinin CFU seviyelerini belirlemek için kullanılan agar plakalarının temsili bir görüntüsü burada gösterilmiştir. İlk sütun denetim grubudur. İkinci sütunda 100 milimoler sodyum nitratta kültürlenmiş hücreler, üçüncü sütunda ise 60 milimoler sodyum nitratta kültürlenmiş hücreler bulunmaktadır.Basitlik için, sadece iki osmolites buraya odaklanmıştır. 96 kuyu plakasında test edilen hücre kültürlerinin plakalarından ve kalıcı fraksiyonlarından alınan CFU verilerinin grafiksel bir gösterimi burada gösterilmiştir. Fraksiyonları hesaplamak için, kalıcı sayımlar antibiyotik tedavisinden önce elde edilen hücre sayılarına normalleştirildi.Byphasic kill eğrileri oluşturmak için, hücreler belirtilen osmolitler ve şaşkın şişelerle 24 saat boyunca 25 mililitre değiştirilmiş LB ortamında kültürlendi, daha sonra kalıcı numaralandırma için kalıcı test şişelerine aktarıldı. Bu protokolü denerken, agar plakasındaki hücreleri tespit etmenin emek yoğun olduğunu ve odaklanma gerektirdiğini unutmayın. Adım sırasındaki bir hata, test edilen koşullar arasında çapraz kontaminasyona neden olabilir.Bu nedenle, deneyden önce aynı anda birden fazla örneği tespit etmek önemlidir. Bu protokolün ardından, kalıcılık üzerindeki etkileri incelemek için ilaç panelleri ve mutant hücre kütüphaneleri taranabilir. Bu tarama ile bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkiye sahip bir dizi osmolite ve PS durumu belirledik.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Organik Solvent kullanımı olmadan Triklosan Etkileri: RBL-2H3 Mast Hücre Degranülasyon üzerinde kimyasal etkileri değerlendirmek için bir Mikroplaka Testi

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

HER2 Gene amplifikasyon meme kanserleri heterojen değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tarama Platform kurma

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...