Name: collection of skeletal muscle biopsies from the superior compartment of human musculus tibialis anterior for mechanical evaluation
Uploaded: 2020-09-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation at JoVE.com

Agradecemos a Michaela Rau, Lea-Fedia Rissmann, Michael Marsh, Janina-Sophie Tennler, Kilian Kimmeskamp y Wolfgang Linke por ayudar con el proyecto. La financiación de este proyecto fue proporcionada por la Fundación MERCUR (ID: An-2016-0050) a DH.

NOTA: A continuación, delineamos un protocolo para cosechar fibras mecánicamente intactas de la TA de voluntarios que fueron inscritos en un estudio en curso separado. Este protocolo es similar al descrito por Shanely et al.3, que han descrito la técnica modificada de Bergstrom en vastus lateralis. La información presentada aquí ha sido refinada por nuestro grupo de investigación, pero puede no ser ideal para todos los grupos de laboratorio o configuraciones organizativas. Damos sólo pautas...

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En este informe, describimos una técnica para la biopsia de tejido muscular estructuralmente intacto de TA. Encontramos que este procedimiento produce un contenido aceptable de fibras musculares utilizables (5-10 preparaciones de haz de fibra por 50 mg de tejido recogido) para pruebas mecánicas. Además, tuvimos suficiente tejido para experimentos mecánicos, genéticos y proteómicos de seguimiento.
Hay varios métodos típicamente utilizados para la recolección de biopsias musculares<sup ...

El estudio de la fisiología muscular humana con fines clínicos o de investigación a menudo requiere biopsias musculares. Por ejemplo, un desafío importante en la fisiología muscular humana y la biomecánica es distinguir y entender las diversas adaptaciones del rendimiento muscular al ejercicio. Las adaptaciones de rendimiento no sólo incluyen adaptaciones estructurales (por ejemplo, cambios en las proteínas contráctiles, arquitectura muscular) sino que también incluyen adaptaciones neuronales1,que son muy duras, si no imposibles, de evaluar por separado cuando se prueban intactos músculos humanos in situ. Los experimentos a nivel de fibra eliminan estos componentes de orden superior y permiten una evaluación más directa de la contracción muscular y se pueden recolectar mediante técnicas de biopsia. Las biopsias musculares se han recogido desde al menos 18682. Hoy en día, la técnica predominante para recoger biopsias musculares es la técnica modificada Bergstrom3,4,5, aunque hay otras técnicas disponibles incluyendo el uso de un conchotóma Weil-Blakesley6 o la llamada aguja fina7,8. Todas estas técnicas utilizan instrumentos especiales similares a agujas que están diseñados para pasar al músculo y cortar un pedazo de tejido. Específicamente, la técnica modificada de Bergstrom utiliza una aguja modificada grande (tamaño de aguja de 5 mm aquí; Figura 1) que tiene una ventana cerca de la punta de la aguja y un trocar interno más pequeño que se mueve hacia arriba y hacia abajo de la aguja, cortando el músculo al pasar por encima de la ventana de la aguja. Dentro de este trocar hallado hay una varilla que se mueve hacia arriba y hacia abajo en el eje del trocar y empuja la biopsia hacia la ventana de la aguja. Para tirar del músculo dentro de la ventana de la aguja, se une una manguera de succión, que succiona el aire de la aguja y tira del músculo hacia la ventana de la aguja a través de la presión negativa.
Las biopsias musculares a menudo se adquieren para estudiar los cambios en el contenido de proteínas, la expresión génica o la morfología causada por la enfermedad o en una respuesta a un programa deejercicios 1,9,10,11. Otro uso crítico para las biopsias musculares son experimentos mecánicos como la medición de la fuerza contráctil de fibra, rigidez de la fibra muscular y propiedades musculares dependientes de la historia12,,13,14,15,16. La mecánica de un solo haz de fibra o fibra se mide mediante la unión de fibras entre un motor de longitud y un transductor de fuerza en plataformas especializadas que controlan la longitud de la fibra mientras miden simultáneamente la fuerza. Al permeabilizar (por ejemplo, despellejar) las fibras, la membrana sarcolemma se vuelve permeable a los productos químicos en la solución de baño, lo que permite el control de activación al variar la concentración de calcio. Además, el efecto de las propiedades contráctiles en los productos químicos/farmacéuticos/otras proteínas se puede evaluar fácilmente añadiendo el reactivo en cuestión a la solución de baño. Sin embargo, mientras que esta técnica es muy utilizada en otros modelos animales, notablemente menos estudios realizaron pruebas mecánicas en fibras despellejadas de biopsias musculares humanas17,18,19. Una razón es que las herramientas y protocolos de biopsia están diseñados para eliminar tanto tejido muscular como sea posible con menos consideración por el nivel de daño estructural sufrido durante la extracción de tejido. De hecho, un protocolo de biopsia reciente sugiere conducir la aguja de la biopsia en el músculo y recoger 2-4 trozos de músculo3. El proceso en sí hace poco daño al ADN o al material proteico, pero a menudo destruye la fibra y las estructuras sarcoméricas de tal manera que la activación de las fibras musculares se vuelve inestable o imposible. Además, la longitud relativa de las fibras dentro de la biopsia son típicamente cortas (<2 mm) y no se manejan fácilmente para pruebas mecánicas. Para pruebas mecánicas, las fibras ideales son largas (3-5 mm) y no están estructuralmente dañadas.
Se pueden utilizar técnicas de extracción de tejido más avanzadas para limitar el daño de la fibra. Por ejemplo, un grupo20 se aprovechó de las "cirugías abiertas" previamente planificadas de antebrazos (por ejemplo, reparación de fracturas óseas), donde los músculos estaban completamente expuestos y un cirujano fue capaz de visualizar la estructura muscular y diseccionar cuidadosamente muestras relativamente grandes y estructuralmente intactas de tejido muscular (15 mm x 5 mm x 5 mm). Esta técnica de "biopsia abierta" se ve favorecida cuando los participantes se someten a un procedimiento previamente planeado, por lo que limita el grupo de participantes potenciales, especialmente para adultos sanos, donde de lo contrario no se realizarían cirugías. Por lo tanto, muchas biopsias realizadas con fines de investigación se realizan como un procedimiento ambulatorio y el sitio de incisión se mantiene lo más pequeño posible para limitar el riesgo de infección, cicatrices, y el tiempo de curación. Por lo tanto, la mayoría de las biopsias se recogen ciegamente (es decir, el operador no puede ver la aguja de recolección a medida que pasa a través de la fascia en el músculo). Esto implica que la calidad de la biopsia se basa casi en su totalidad en la habilidad y experiencia del operador. Cada músculo tiene sus propias dificultades al recolectar tejido, como los riesgos de violar los nervios y los vasos sanguíneos, la selección de una profundidad y ubicación de recolección ideal, y decidir una posición corporal adecuada para mantener el músculo lo más flojo posible. Desafortunadamente, la mayoría de los conjuntos de habilidades específicos del músculo no están escritos y por lo tanto cada médico debe "reinventar la rueda" al realizar biopsias en los músculos nuevos para ellos. Esta falta de experiencia generalmente conduce a varias colecciones con baja calidad hasta que el médico identifica las mejores prácticas para biopsias en ese músculo. Los médicos novatos a menudo aprenden la habilidad a través de conversaciones con sus colegas más experimentados, pero existen relativamente pocos textos informativos y revisados por pares sobre el asunto, especialmente para los músculos que no se utilizan tradicionalmente para la recolección de biopsias. Si consideramos la información anterior, junto con la dificultad de reclutar voluntarios humanos para biopsias, está claro que se necesita más información didáctica que maximice las posibilidades de éxito para cada participante.
Por lo tanto, el propósito de este artículo era presentar una técnica de biopsia muscular que proporciona protocolos para la recolección exitosa de biopsias musculares con fragmentos de fibra largos y no dañados para pruebas mecánicas. Las biopsias musculares humanas generalmente se llevan a cabo, y la mayor parte del material de entrenamiento de biopsia está en, el musculus vastus lateralis. Su tamaño muscular relativamente grande y su ubicación superficial en relación con la piel permite la acumulación de tejido muscular adecuado, minimizando al mismo tiempo el malestar del paciente y el trauma físico1,,21. Sin embargo, hay algunas limitaciones en el uso de los vastus lateralis para estudios de entrenamiento longitudinal. Por ejemplo, durante los protocolos experimentales que incluyen un programa de capacitación, los participantes deben abstenerse de una formación adicional fuera del estudio durante un período que a menudo abarca 2-6 meses. Para los atletas, esto a menudo no es posible, ya que el vastus lateralis se entrena generalmente durante los ejercicios típicos (por ejemplo, sentadillas, saltos), o se utiliza generalmente para el deporte (por ejemplo, correr, ciclismo). Estas experiencias de entrenamiento separadas lejos del objetivo del estudio pueden causar adaptaciones musculares que alteran la mecánica muscular, la arquitectura y la fisiología de tal manera que es difícil o imposible conocer el verdadero efecto del protocolo experimental del estudio sobre las propiedades musculares. Para este tipo de estudios, sería ideal seleccionar un músculo objetivo que a menudo no es el foco de los regimientos de entrenamiento. El musculus tibialis anterior (TA) es un músculo objetivo ideal que satisface los requisitos anteriores. Además, las intervenciones de entrenamiento se pueden orientar hacia la TA mediante enfoques controlables, como con el uso de un dinamómetro. Casi no hay material de entrenamiento relacionado con una biopsia muscular TA. Por lo tanto, desarrollamos un protocolo modificado para recoger biopsias musculares relativamente indesadas de la TA.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG 
			Carl-Braun-Stra&#223;e 1 
			34212 Melsungen, Hessen 
			Germany 
			&#160;</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Drug administration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mm Berst&#246;m needle</td>
			<td>homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Tissue collection. Similar to other Berst&#246;m needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylastic</td>
			<td>BSN medical GmbH 
			22771 Hamburg</td>
			<td>269700</td>
			<td>elastic compression bandage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td>11836145001</td>
			<td>Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutasept</td>
			<td>PAUL HARTMANN AG 
			Paul-Hartmann-Stra&#223;e 12 
			89522 Heidenheim 
			Germany</td>
			<td>9805630</td>
			<td>Disenfectant spray for the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucomed T plus</td>
			<td>BSN medical GmbH 
			22771 Hamburg</td>
			<td>7238201</td>
			<td>Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukostrip</td>
			<td>Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, 
			Hull 
			Great Britain</td>
			<td>66002876</td>
			<td>wound closure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical disposable scalpels</td>
			<td>Aesculap AG 
			Am Aesculap-Platz 
			78532 Tuttlingen 
			Germany</td>
			<td>BA200 series</td>
			<td>Incision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unihaft cohesive elastic bandage</td>
			<td>BSN medical GmbH 
			22771 Hamburg</td>
			<td>4589600</td>
			<td>cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocitin 2% with Epinephrin</td>
			<td>Milbe GmbH 
			M&#252;nchner Stra&#223;e 15 
			06796 Brehna 
			Germany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Controlled substance anesthesia, vasoconstriction</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of skeletal muscle biopsies from the superior compartment of human musculus tibialis anterior for mechanical evaluation

Las propiedades mecánicas de la contraer fibras esqueléticas son indicadores cruciales de la salud muscular general, función, y el rendimiento. Las biopsias de músculo esquelético humano a menudo se recogen para estos esfuerzos. Sin embargo, hay disponibles relativamente pocas descripciones técnicas de los procedimientos de biopsia, fuera del musculus vastus lateralis comúnmente utilizado. Aunque las técnicas de biopsia a menudo se ajustan para adaptarse a las características de cada músculo en estudio, pocos informes técnicos comparten estos cambios a la comunidad en general. Por lo tanto, el tejido muscular de los participantes humanos a menudo se desperdicia a medida que el operador reinventa la rueda. La ampliación del material disponible en biopsias de una variedad de músculos puede reducir el incidente de biopsias fallidas. Este informe técnico describe una variación de la técnica modificada de Bergstrom en el musculus tibialis anterior que limita el daño de la fibra y proporciona longitudes de fibra adecuadas para la evaluación mecánica. La cirugía es un procedimiento ambulatorio que se puede completar en una hora. El período de recuperación de este procedimiento es inmediato para la actividad ligera (es decir, caminar), hasta tres días para la reanudación de la actividad física normal, y aproximadamente una semana para el cuidado de heridas. El tejido extraído se puede utilizar para experimentos de fuerza mecánica y aquí presentamos datos representativos de activación. Este protocolo es apropiado para la mayoría de los propósitos de recolección, potencialmente adaptable a otros músculos esqueléticos, y puede mejorarse mediante modificaciones en la aguja de recolección.

El compromiso de tiempo completo para un participante fue de aproximadamente una hora (consulta de 10 minutos, ultrasonido de 10 min, preparación de cirugía de 20 minutos y administración anestésica, cirugía de 10 minutos y recuperación de 10 minutos). A menudo, los participantes activan inconscientemente su TA y necesitaron recordatorios consistentes para mantener el músculo lo más relajado posible. Cuando la aguja de la biopsia estaba dentro del músculo, los participantes generalmente reportaron una sensación...

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Collection of Skeletal Muscle Biopsies from the Superior Compartment of Human Musculus Tibialis Anterior for Mechanical Evaluation

Este informe técnico describe una variación de la técnica modificada de Bergstrom para la biopsia del musculus tibialis anterior que limita el daño de la fibra.

Colección de biopsias de músculo esquelético del Compartimiento Superior del Musculus Humano Tibialis Anterior para la Evaluación Mecánica

The mechanical properties of contracting skeletal fibers are crucial indicators of overall muscle health, function, and performance. Human skeletal muscle ...

Bienvenidos a la Universidad Ruhr Bochum, Facultad de Ciencias del Deporte. Hoy, vamos a demostrar la colección de biopsias de músculo esquelético desde el compartimiento superior del musculus humano tibialis anterior. Mientras que las técnicas de biopsia son eficaces para recolectar tejido muscular, las fibras a menudo se dañan estructuralmente de tal manera que la evaluación de la mecánica de la fibra es difícil.Presentamos una variación de una técnica modificada de Bergstrom que limita el daño de la fibra y maximiza la longitud de la fibra para que se pueda llevar a cabo la evaluación mecánica de las fibras humanas. La demostración será llevada a cabo por el médico del equipo, el Dr. Markus de Marees y los científicos de investigación, el Dr. Daniel Hahn y Anthony Hessel. El participante y el médico primero se reúnen para revisar y discutir el procedimiento.Si se cumple, el participante firma el contrato de consentimiento informado voluntario. Instruya al sujeto a poner supino y mantener su extremidad lo más relajada posible. Dorsiflex el pie del participante para que el tibialis anterior sea flojo.Utilice una sonda de ultrasonido para visualizar el plano transversal del compartimento superficial dentro del vientre muscular anterior tibialis, identificar un área de biopsia sin arterias o nervios principales. Por último, registre la profundidad de la aponeurosis central para que la aguja de recolección nunca se condure más allá de este punto. Gire la sonda de ultrasonido para acceder al plano sagital del área objetivo identificada.Guarde una imagen del volumen muscular con fascículos visibles. Las herramientas de cirugía se esterilizan y preparan antes del procedimiento y se describen completamente dentro del protocolo escrito. La aguja Bergstrom tiene una ventana cerca de la punta.Dentro de esta aguja hay un trocar hueco más pequeño, que se mueve hacia arriba y hacia abajo en el eje y corta el músculo al pasar por encima de la ventana de la aguja. Dentro del trocar hay una varilla más pequeña que se utiliza para empujar la biopsia fuera del trocar. Para tirar del músculo dentro de la ventana de la aguja, se une una manguera de succión a la parte superior de la aguja que succiona el aire de la aguja y tira del músculo a través de la ventana de la aguja por presión negativa.Indique al participante que se acueste sobre la mesa del procedimiento y relaje los músculos de las piernas. Replicar la ligera dorsiflexión del tobillo utilizada durante la ecografía, y luego fijar la articulación del tobillo para minimizar la rotación durante el procedimiento. Afeitar y desinfectar el área de incisión objetivo.A continuación, administrar una inyección superficial de 1,5 CC de 2%xilocitina con epinefrina. Esto funciona como un anestésico local y constrictor de vasos. El tiempo de afectación es de 20 a 30 minutos.Lleve la línea de visión del paciente a la ubicación de la biopsia con una pantalla. En el sitio de la biopsia previamente marcado hacer una incisión proximal a distal de un centímetro con un bisturí estéril que corta a través de la piel y la fascia, exponiendo el tejido muscular subyacente. Coloque la aguja de la biopsia sobre la incisión y orientarlo perpendicular a la piel.Empuje la aguja de la biopsia de medio a un centímetro en el músculo. Puede haber cierta resistencia a la luz al movimiento de la aguja, pero cualquier resistencia adicional es anormal y a menudo indica una inabra inapt. A continuación, orientar la aguja a una posición distal a proximal, empujar la aguja de otro a dos centímetros en el músculo.La orientación exacta y la profundidad de desplazamiento de la aguja serán específicas del participante. Y por lo tanto basado en el examen de ultrasonido. Conecte la manguera de la jeringa a la aguja de la biopsia y cree presión negativa en la aguja.Esto extraerá el tejido muscular a través de la ventana de la aguja. Empuje con fuerza el trocar sobre la ventana de la aguja para extirpar el músculo. Retire la aguja de la pierna y pase a un técnico para el procesamiento de tejidos.Utilice cinta adhesiva o cinta adhesiva para cerrar principalmente la herida y aplicar vendajes para proteger la herida de una infección o abrasión mecánica. Indique al participante que se ponga de pie y camine. Estarán doloridos, pero podrán caminar inmediatamente.Para extraer el tejido de la ventana de la biopsia, primero exponga el tejido, luego sumerja la punta de la aguja en una vil llena de tampón fisiológico y mueva vigorosamente la aguja hasta que el músculo flote fuera de la aguja hacia la solución. Procesar el tejido muscular para la evaluación mecánica utilizando métodos estándar. Recientemente recolectamos 22 biopsias de los participantes usando este protocolo.El rendimiento medio de la colección fue de 100 a 200 miligramos de tejido muscular utilizable. Cada biopsia produjo de 150 a 300 fibras intactas de tres a cinco milímetros de longitud. Los haces de fibra se despellejaron químicamente con glicerol y luego se activaron en una solución de calcio alta con una longitud media de sarcomere de 2,7 micras.Las biopsias que se almacenan correctamente son viables para las pruebas mecánicas durante varios meses. Este procedimiento de biopsia toma una hora. Las complicaciones de las biopsias son muy raras, pero lo más probable es que sea una infección del sitio de la incisión.Un desafío importante en la fisiología muscular humana y la biomecánica es distinguir entre las diversas adaptaciones del rendimiento muscular al ejercicio y la enfermedad. Para identificar adecuadamente las adaptaciones a nivel de fibra al ejercicio o a la enfermedad, las biopsias son una técnica adecuada. Sin embargo, se debe tener cuidado para proteger contra el daño muscular durante la extracción de tejido.El protocolo demostrado aquí proporciona un alto rendimiento de tejido muscular para estos fines.

Research

JoVE Journal

Biology

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Investigación

Biología

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Evaluación de la función muscular del músculo extensor largo digitorum<em&gt; Ex vivo</em&gt; Y tibial anterior del músculo<em&gt; In situ</em&gt; En ratones

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Evaluación de calcio en Sparks intactas las fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Triage de tejidos y de congelación para los modelos de la enfermedad del músculo esquelético

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias