טכניקה זו מאפשרת לתת מבט מקרוב על תאים בודדים ברקמה חיה. על ידי מעקב ותמרון תאים בודדים, אנו יכולים להבין טוב יותר היווצרות רקמות במהלך הפיתוח. הדגמה חזותית של שיטה זו מאפשרת למשתמשים פוטנציאליים להחליט אם טכניקה זו יכולה להועיל לעבודתם.
בנוסף, זה מאפשר למשתמשים לראות איך היישום פועל, אשר יהיה קשה לתפוס את הטקסט לבד. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל רקמה עם משטח ניתן להערכה. אנחנו כבר מיקוד תאים שונים באותן רקמות, רקמות שונות באותו המין, וגם מינים שונים.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב להישאר ממוקד ולעבוד במהירות. כל הציוד צריך להיות מוכן לפני תחילת הניתוח. התחל בהתקנת תוכנת המזרק האוטומטי ומושך את פיפטים microinjection של נימי זכוכית borosilicate עם מושך micropipette.
אחסן את הפיפסים עד שלושה ימים מוגנים מפני אבק. ממיסים מגוון רחב של 3% באמצעות מיקרוגל. אל תיתן לאגרוז להתגבש על ידי שמירה על זה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
להפשיר aliquot SCM וחם 10 עד 12 מיליליטר SIM ו 20 מיליליטר של הפתרון של טירודה ל 37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים. מערבבים את עוקב הפלואורסצנט עם הכימיקלים האחרים להזרקה, ואז צנטריפוגה פתרון microinjection ב 16, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את העל טבעי ולהעביר אותו לתוך צינור חדש.
שמור את פתרון microinjection על קרח עד השימוש. השתמש בראשים מ E13.5 כדי E16.5 עוברי עכבר להכין פרוסות רקמה organotypic של telencephalon. הסר את העור ולפתוח את הגולגולת עם מדפים נעים לאורך קו האמצע.
לנתח את המוח העוברי מהגולגולת הפתוחה ולהסיר את קרום המוח המכסה את רקמת המוח החל מהצד הגחוני של המוח. השאירו את המוח כולו נותק בתסכולה של טירודה על בלוק חימום 37 מעלות צלזיוס. יוצקים את המגוון הרחב המומס של אגארוז לתבנית הטבעה חד פעמית.
כאשר הוא מתקרר ל 38 עד 39 מעלות צלזיוס, בזהירות להעביר עד ארבעה מוחות לתוך agarose באמצעות פיפטה פסטר. מערבבים את ההתעוררות סביב הרקמה עם מרית או זוג מדפים מספר אחת של דומונט מבלי לגעת ברקמה. תן לתעורר להתגבש בטמפרטורת החדר.
ברגע שהתעוררות התגבשה, לקצץ את עודף סביב הרקמה. מלא את מגש המאגר ב- PBS. לכוון את המוח עם הציר caudal rostral של הרקמה בניצב למגש לחתוך 250 פרוסות מיקרומטר באמצעות רטט.
ממלאים צלחת פטרי ב-3.5 ס"מ עם שני מיליליטר של מדיה מחוממת מראש, ואז משתמשים בפיפטת פסטר מפלסטיק כדי להעביר 10 עד 15 פרוסות לתבשיל זה. בסיום, מעבירים את צלחת פטרי עם הפרוסות לתוך החממה לתרבות הפרוסות. שומרים על הפרוסות ב-37 מעלות באווירה לחה.
הפעל את המחשב, מיקרוסקופ, מצלמת מיקרוסקופ, מניפולטורים, אסדת לחץ, חיישן לחץ. טען את היישום על-ידי לחיצה על הקובץ.py הפעל את האפליקציה בתיקיה הראשית שהורדו מ- GitHub וציין את הגדרות ההתקן במסך המוקפץ.
כדי למנוע סתימת לא רצויים, צור לחץ כלפי חוץ לפני שקוע פיפטה לתוך הפתרון. החלק את סרגל לחץ הפיצוי ל- 24 עד 45% ולחץ על הגדר ערכים. לאחר מכן, לכוון את הלחץ על ידי הפיכת ידית שסתום לחץ מכני אחד עד שני PSI כפי שצוין על ידי חיישן הלחץ.
מעבירים את הפרוסות למרכז צלחת פטרי באורך 3.5 ס"מ המכילה שני מיליליטר של סים שחומם מראש, ואז מניחים את צלחת פטרי על שלב המיקרו-ג'ינג'י שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס. לטעון את פיפטה microinjection עם 1.4 כדי 1.6 microliters של פתרון microinjection באמצעות פיפטה פלסטיק קצה ארוך ולהכניס את פיפטה microinjection לתוך מחזיק פיפטה. באמצעות ההגדלה הנמוכה ביותר במיקרוסקופ, להביא את הפרוסה לפוקוס ולהנחות את micropipette לשדה זה של תצוגה, כך שהוא מתמקד באותו מישור כמו יעד הפרוסה.
העבר את הפלט של המיקרוסקופ למצלמה כדי לראות את FOV ואת היישום. לחץ על לחצן ההגדלה בחלק הימני העליון של הממשק כדי ליזום כיול התקן. כאשר חלון מבקש לבחור את ההגדלה, בחר את ה- 10X ולחץ על אישור. התוכנה מניחה את העדשה האובייקטיבית הפנימית היא 10X.
פוקוס מחדש את קצה פיפטה באמצעות הגלגל המיקרומטרי של המיקרוסקופ ולחץ על קצה פיפטה עם הסמן. לאחר מכן, לחץ על לחצן שלב 1.1 ולחץ על אישור בחלון המוקפץ. הפיפיט יזוז בכיוון ה-y.
לחץ על קצה הפיפיאט ולחץ על לחצן שלב 1.2. לבסוף, הזינו 45 בתיבת הזווית של pipette ולחץ על הזווית שנקבעה. הזינו את הפרמטרים הרצויים בחלונית 'פקדי מיקרו-ג'ינג'י אוטומטיים והגדירו את המהירות ל- 100%בסיום, לחצו על 'קבע ערכים'.
לחץ על לחצן צייר קצה וגרור את הסמן לאורך המסלול הרצוי בחלון המוקפץ כדי להגדיר את מסלול ההזרקה. עבור נוירונים microinjecting, למקד את הצד הבסיסי של telencephalon. להביא את פיפטה לתחילת הקו ולחץ על הקצה שלה, ולאחר מכן לחץ על מסלול ריצה כדי להתחיל microinjecting.
חזור על שלב זה עבור כל מישור של הזרקה ממוקדת. לטבול את הפרוסות לתוך תערובת הקולגן, ולאחר מכן להעביר את הפרוסות יחד עם 200 כדי 300 microliters של הקולגן לתוך 14 מילימטר גם של צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר. ודא כי הפרוסות מכוסות בכמות קטנה ביותר של קולגן אפשרי, וזה המצב האופטימלי עבור חומרים מזינים ספיגת חמצן.
לכוון את הפרוסות באמצעות שני זוגות של מטחנות להדק את צלחת פטרי במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס על בלוק חימום כדי לאפשר קולגן להתגבש. מעבירים את צלחת פטרי בחזרה לחממה לתרבות הפרוסות במשך 40 דקות נוספות, ואז מוסיפים שני מיליליטר של SCM מחומם מראש. בסוף התרבות, להוציא את הפרוסות מתוך החממה תרבות פרוסה לשאוף את SCM.
לשטוף את הפרוסות משובצות קולגן עם PBS, ולאחר מכן להוסיף 4% paraformaldehyde ולהשאיר את הרקמה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. להעביר אותו לארבע מעלות צלזיוס עבור קיבעון לילה. למחרת, שאפו את תספור הפרפורמלדהיד ושטפו את הפרוסות עם PBS.
מוציאים את הפרוסות מהקולאגן באמצעות שני זוגות מדפים תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש במיקרוגל כדי להמיס את 3% נקודת ההיתוך הנמוכה agarose, ולאחר מכן לשפוך אותו לתוך תבנית הטבעה חד פעמית ולתת לו להתקרר כ 38 או 39 מעלות צלזיוס. מעבירים את פרוסות הרקמה לתבנית זו ומוודאים שהצד הקליפה של הפרוסה פונה כלפי מעלה, ואז מאפשרים לאגרוז להתקרר לטמפרטורת החדר ולהתחזק.
חותכים את ההתעוררות הנוספת המקיפה את הפרוסות. כוון את בלוק ההתעוררות כדי להבטיח כי פני השטח החתוכים מקבילים ללהב החיתוך של הרטט וחותכים חלקים בעובי 50 מיקרומטר. ממלאים צלחת 24 באר עם PBS ולהעביר את החלקים לתוך המנה הזאת באמצעות מברשת צבע קצה דק, ולאחר מכן לבצע immunofluorescence על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
תמונות מייצגות של תאי צאצא שהוזרקו בהצלחה ותאי עצב שזה עתה נולדו מוצגים כאן. כאשר מוזרק עם Dextran Alexa 488, תאים מופיעים מלאים לחלוטין עם הצבע. microinjection אוטומטי יכול לספק תפוקה גבוהה משמעותית בהשוואה microinjection ידני.
יתר על כן, תיוג EDU מאשר כי הכדאיות התא אינו מושפע אוטומציה. שמירה על פרוסת האורגנוטיפיק בתרבות מאפשרת לעקוב אחר התקדמות שושלת היוחסין של התאים microinjected. מיקרו-ג'ינג'י לתאי גזע עצביים בודדים מספק רזולוציה מצוינת של תא יחיד.
לכן, הוא שימש לנתח את הביולוגיה התאית של התקדמות תאי גזע עצביים ומעבר גורל. פרוטוקול זה שימש לחקר צימוד צומת בנוירונים שזה עתה נולדו על ידי הזרקת צהוב לוציפר יחד עם Dextran A555. חלק מהנוירונים הפירמידליים שזה עתה נולדו היו יחד דרך צמתים פער לנוירונים שכנים, אשר עולה בקנה אחד עם הרעיון כי נוירונים לא בוגרים לתקשר באמצעות צומת פער.
השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור את הביולוגיה התאית של התפתחות המוח והתפתחות המוח. חקרנו מספר גנים מועמדים שהשפיעו על התנהגות תאי גזע עצביים והצלנו לגלות ולהבין כיצד הם פועלים, כיצד הם משפיעים על התקדמות שושלת תאי הגזע העצביים וייצור הנוירונים במהלך התפתחות המוח.
