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January 21st, 2021
DOI :
January 21st, 2021
•0:05
Introduction
1:02
Tissue Slice Preparation
4:04
Microinjection
7:05
Tissue Culture and Tissue Slice Processing for Immunofluorescence
9:39
Results: Robotic Microinjection into Apical Progenitors and Neurons
10:57
Conclusion
Transcript
इस तकनीक से जीवित ऊतकों में एकल कोशिकाओं को करीब से देखना संभव हो जाता है। ट्रैकिंग और एकल कोशिकाओं में हेरफेर करके, हम बेहतर विकास के दौरान ऊतक गठन को समझ सकते हैं । इस विधि का दृश्य प्रदर्शन संभावित उपयोगकर्ताओं को यह तय करने में सक्षम बनाता है कि यह तकनीक उनके काम के लिए मददगार हो सकती है या नहीं।
इसके अतिरिक्त, यह उपयोगकर्ताओं के लिए यह देखना संभव बनाता है कि एप्लिकेशन कैसे चलाया जाता है, जिसे अकेले पाठ से समझना मुश्किल होगा। यह प्रोटोकॉल एक आकपिक सतह के साथ हर ऊतक पर लागू किया जा सकता है। हम एक ही ऊतकों में विभिन्न कोशिकाओं, एक ही प्रजाति में विभिन्न ऊतकों, और विभिन्न प्रजातियों को भी लक्षित कर रहे हैं।
इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ध्यान केंद्रित रहना और जल्दी से काम करना महत्वपूर्ण है। विच्छेदन शुरू करने से पहले सभी उपकरण तैयार किए जाने चाहिए। ऑटो-इंजेक्टर सॉफ्टवेयर स्थापित करके शुरू करें और माइक्रोपिपेट खींचने के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं से माइक्रोइंजेक्शन पिपेट खींचें।
धूल से सुरक्षित तीन दिनों तक पिपेट स्टोर करें। माइक्रोवेव ओवन का उपयोग करके 3% विस्तृत रेंज को पिघलाएं। एगरे को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखकर जमना न दें।
एक aliquot एक सीएम और गर्म 10 से 12 मिलीलीटर सिम और 20 मिलीलीटर है Tyrode समाधान के ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी स्नान का उपयोग कर गल । फ्लोरोसेंट ट्रेसर को इंजेक्शन लगाने के लिए अन्य रसायनों के साथ मिलाएं, फिर माइक्रोइंजेक्शन समाधान को चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 16, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को इकट्ठा करें और इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
उपयोग होने तक बर्फ पर माइक्रोइंजेक्शन समाधान रखें। टेलेंसेफेलॉन के ऑर्गेनोटिपिक ऊतक स्लाइस तैयार करने के लिए E13.5 से E16.5 माउस भ्रूण तक सिर का उपयोग करें। त्वचा को हटा दें और मिडलाइन के साथ चलने वाले संदंश के साथ खोपड़ी खोलें।
भ्रूण मस्तिष्क को खुली खोपड़ी से बाहर निकालें और मस्तिष्क के वेंट्रल साइड से शुरू होने वाले मस्तिष्क के ऊतकों को कवर करने वाले मेनिंग्स को हटा दें। 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक पर टायरोड के समाधान में विच्छेदित पूरे मस्तिष्क को छोड़ दें। एक डिस्पोजेबल एम्बेडिंग मोल्ड में विस्तृत श्रृंखला पिघला एगर उठी डालो।
जब यह 38 से 39 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है, तो ध्यान से एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके एगर में चार दिमाग तक स्थानांतरित करें। एक स्पैटुला या ड्यूमोंट नंबर एक संदंश की एक जोड़ी के साथ ऊतक के चारों ओर agarose हिलाओ ऊतक को छूने के बिना । अगेन कमरे के तापमान पर जमना करते हैं।
एक बार एगर उठे जम जाने के बाद, ऊतक के आसपास के अतिरिक्त को ट्रिम करें। पीबीएस के साथ बफर ट्रे भरें। ऊतक लंबवत की रोस्ट्रल कौडल धुरी के साथ मस्तिष्क को ट्रे में उन्मुख करें और वाइब्रेटोम का उपयोग करके 250 माइक्रोमीटर स्लाइस काटें।
पूर्व गर्म मीडिया के दो मिलीलीटर के साथ एक 3.5 सेंटीमीटर पेट्री डिश भरें, फिर इस डिश में 10 से 15 स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। समाप्त होने पर, स्लाइस के साथ पेट्री डिश को स्लाइस कल्चर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। एक आर्द्र वातावरण में स्लाइस को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप, माइक्रोस्कोप कैमरा, जोड़तोड़, दबाव रिग, और दबाव सेंसर चालू करें। फाइल पर क्लिक करके एप्लिकेशन लोड करें, गिटहब से डाउनलोड किए गए मुख्य फ़ोल्डर में ऐप.py लॉन्च करें और पॉपअप स्क्रीन में डिवाइस सेटिंग्स निर्दिष्ट करें।
अवांछित क्लोजिंग को रोकने के लिए, समाधान में पिपेट को जलमग्न करने से पहले एक बाहरी दबाव बनाएं। 24 से 45% तक मुआवजा दबाव बार स्लाइड करें और सेट मान पर क्लिक करें। इसके बाद, दबाव सेंसर द्वारा इंगित यांत्रिक दबाव वाल्व घुंडी को एक से दो साई में बदलकर दबाव को ट्यून करें।
स्लाइस को 3.5 सेंटीमीटर पेट्री डिश के केंद्र में स्थानांतरित करें जिसमें दो मिलीलीटर पूर्व-गर्म सिम होते हैं, फिर पेट्री डिश को माइक्रोइंजेक्शन चरण पर रखें जिसे 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीटेड किया गया है। माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को 1.4 से 1.6 माइक्रोलीटर माइक्रोजेक्शन सॉल्यूशन के साथ लोड करें, एक लंबी टिप प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को पिपेट धारक में डालें। माइक्रोस्कोप पर सबसे कम आवर्धन का उपयोग करना, स्लाइस को ध्यान में लाएं और माइक्रोपिपेट को इस क्षेत्र में मार्गदर्शन करें ताकि यह स्लाइस लक्ष्य के समान विमान पर केंद्रित हो।
एफओवी और एप्लिकेशन को देखने के लिए माइक्रोस्कोप के आउटपुट को कैमरे में स्विच करें। डिवाइस अंशांकन शुरू करने के लिए इंटरफ़ेस के शीर्ष बाईं ओर आवर्धन बटन पर क्लिक करें। जब कोई विंडो आवर्धन का चयन करने का संकेत देती है, तो 10X का चयन करें और ओके दबाएं। सॉफ्टवेयर मानता है कि आंतरिक उद्देश्य लेंस 10X है।
माइक्रोस्कोप के माइक्रोमेट्रिक व्हील का इस्तेमाल करते हुए पिपेट टिप को फिर से फोकस करें और कर्सर के साथ पिपेट टिप पर क्लिक करें। इसके बाद, स्टेप 1.1 बटन दबाएं और पॉपअप विंडो में ओके दबाएं। पिपेट वाई-डायरेक्शन में मूव करेगा।
पिपेट की नोक पर क्लिक करें और स्टेप 1.2 बटन दबाएं। अंत में, पिपेट एंगल बॉक्स में 45 दर्ज करें और सेट कोण दबाएं। स्वचालित माइक्रोइंजेक्शन कंट्रोल पैनल में वांछित पैरामीटर दर्ज करें और समाप्त होने पर गति को 100% तक सेट करें, सेट मानों पर क्लिक करें।
ड्रॉ एज बटन पर क्लिक करें और इंजेक्शन के प्रक्षेपवक्र को परिभाषित करने के लिए पॉपअप विंडो में वांछित प्रक्षेपवक्र के साथ कर्सर खींचें। माइक्रोइंजेक्टिंग न्यूरॉन्स के लिए, टेलेंसेफेलॉन के बेसल साइड को निशाना बनाता है। पिपेट को लाइन की शुरुआत में लाएं और उसके टिप पर क्लिक करें, फिर माइक्रोइंजेक्टिंग शुरू करने के लिए रन प्रक्षेपवक्र पर क्लिक करें।
लक्षित इंजेक्शन के हर विमान के लिए इस कदम को दोहराएं। स्लाइस को कोलेजन मिश्रण में विसर्जित करें, फिर स्लाइस को कोलेजन के 200 से 300 माइक्रोलीटर के साथ 35 मिलीमीटर ग्लास बॉटम डिश के 14 मिलीमीटर कुएं में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि स्लाइस कोलेजन संभव है, जो पोषक तत्वों और ऑक्सीजन तेज के लिए इष्टतम स्थिति है की कम से कम मात्रा में कवर कर रहे हैं।
दो जोड़ी संदंश का उपयोग करके स्लाइस को उन्मुख करें और पेट्री डिश को एक हीटिंग ब्लॉक पर 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि कोलेजन को जमना जा सके। पेट्री डिश को अतिरिक्त 40 मिनट के लिए स्लाइस कल्चर इनक्यूबेटर में वापस ले जाएं, फिर पूर्व-गर्म एससीएम के दो मिलीलीटर जोड़ें। संस्कृति के अंत में स्लाइस कल्चर इनक्यूबेटर से स्लाइस लें और सीएम को एस्पिरेट करें ।
पीबीएस के साथ कोलेजन-एम्बेडेड स्लाइस धोएं, फिर 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड जोड़ें और ऊतक को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए छोड़ दें। रात भर निर्धारण के लिए इसे चार डिग्री सेल्सियस तक ले जाएं। अगले दिन, पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान को एस्पिरेट करें और स्लाइस को पीबीएस से धो लें।
एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत संदंश के दो जोड़े का उपयोग कर कोलेजन से स्लाइस निकालें। 3% कम पिघलने वाले बिंदु को पिघलाने के लिए माइक्रोवेव का उपयोग करें, फिर इसे डिस्पोजेबल एम्बेडिंग मोल्ड में डालें और इसे लगभग 38 या 39 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। ऊतक स्लाइस को इस मोल्ड में स्थानांतरित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्लाइस का छील पक्ष ऊपर आ रहा है, फिर एगर उठे को कमरे के तापमान को ठंडा करने और जमना की अनुमति दें।
स्लाइस के आसपास अतिरिक्त agarose ट्रिम करें। ओरिएंट एगर उठे ब्लॉक यह सुनिश्चित करने के लिए कि कट सतह वाइब्रेटम के कटिंग ब्लेड के समानांतर है और 50 माइक्रोमीटर मोटी धाराओं को काटती है। पीबीएस के साथ 24-अच्छी डिश भरें और एक ठीक टिप तूलिका का उपयोग करके इस डिश में वर्गों को स्थानांतरित करें, फिर मानक प्रोटोकॉल के अनुसार इम्यूनोफ्लोरेसेंस करें।
सफलतापूर्वक इंजेक्शन जनक कोशिकाओं और नवजात न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि छवियों यहां दिखाया गया है । जब डेक्सट्रान एलेक्सा 488 के साथ इंजेक्शन दिया जाता है, तो कोशिकाएं पूरी तरह से डाई से भरी दिखाई देती हैं। स्वचालित माइक्रोइंजेक्शन मैनुअल माइक्रोइंजेक्शन की तुलना में काफी अधिक थ्रूपुट प्रदान कर सकता है।
इसके अलावा, ईडीयू लेबलिंग इस बात की पुष्टि करता है कि सेल व्यवहार्यता स्वचालन से प्रभावित नहीं होती है। संस्कृति में ऑर्गेनोटिपिक स्लाइस रखने से माइक्रोइंजेक्टेड कोशिकाओं की वंश प्रगति का पालन करना संभव हो जाता है। एकल तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में माइक्रोइंजेक्शन उत्कृष्ट एकल कोशिका संकल्प प्रदान करता है।
इसलिए, इसका उपयोग तंत्रिका स्टेम सेल प्रगति और भाग्य संक्रमण के सेल जीव विज्ञान को विच्छेदन करने के लिए किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग डेक्सट्रान A555 के साथ लूसिफ़ेर पीले इंजेक्शन द्वारा नवजात न्यूरॉन्स में जंक्शनल युग्मन का अध्ययन करने के लिए किया गया था। नवजात पिरामिड न्यूरॉन्स का एक अनुपात पड़ोसी न्यूरॉन्स के लिए गैप जंक्शनों के माध्यम से युग्मित किया गया था, जो इस विचार के अनुरूप है कि अपरिपक्व न्यूरॉन्स गैप जंक्शन के माध्यम से संवाद करते हैं।
हमने मस्तिष्क के विकास और मस्तिष्क विकास के सेल जीव विज्ञान की जांच करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया है। हमने कई उम्मीदवार जीन का अध्ययन किया जो तंत्रिका स्टेम सेल व्यवहार को प्रभावित कर रहे थे और हम यह जानने और समझने में सक्षम थे कि वे कैसे काम करते हैं, वे तंत्रिका स्टेम सेल वंश प्रगति को कैसे प्रभावित करते हैं, और मस्तिष्क के विकास के दौरान न्यूरॉन उत्पादन।
यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क स्लाइस में एकल तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक रोबोट मंच के उपयोग को दर्शाता है। यह तकनीक बहुमुखी है और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ ऊतक में कोशिकाओं को ट्रैक करने की एक विधि प्रदान करती है।
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