Name: manipulation of single neural stem cells and neurons in brain slices using robotic microinjection
Uploaded: 2021-01-21T12:30:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Фонд Номиса (ET). СБК признает средства департамента машиностроения, Колледж науки и техники, MnDRIVE RSAM инициативе Университета Миннесоты, Миннесота департамент высшего образования, Национальные институты здравоохранения (NIH) 1R21NS103098-01, 1R01NS111028, 1R34NS11654, 1R21NS112886 и 1R21 NS111196. GS была поддержана Национальным научным фондом Высшей научно-исследовательской стипендии и NSF IGERT учебный грант.

<ol>
	<li>Taverna, E., G&#246;tz, M., Huttner, W. B. The Cell Biology of Neurogenesis: Toward an Understanding of the Development and Evolution of the Neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 465-502 (2014).</li>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (10), 777-788 (2005).</li>
	<li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesisin a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).</li>
	<li>Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling Development and the Stem Cell Niche in a Dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).</li>
	<li>Pepperkok, R. et al. Automatic microinjection system facilitates detection of growth inhibitory mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (18), 6748-6752 (1988).</li>
	<li>Pepperkok, R., Lowe, M., Burke, B., Kreis, T. E. Three distinct steps in transport of vesicular stomatitis virus glycoprotein from the ER to the cell surface in vivo with differential sensitivities to GTP&#947;S. Journal of Cell Science. 111 (13), 1877-1888 (1998).</li>
	<li>Pepperkok, R. et al. &#946;-COP is essential for biosynthetic membrane transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex in vivo. Cell. 74 (1), 71-82 (1993).</li>
	<li>Ansorge, W., Pepperkok, R. Performance of an automated system for capillary microinjection into living cells. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 16 (4), 283-292 (1988).</li>
	<li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neuroscience. 15 (2), 329-337 (2012).</li>
	<li>Wong, F. K., Haffner, C., Huttner, W. B., Taverna, E. Microinjection of membrane-impermeable molecules into single neural stem cells in brain tissue. Nature Protocols. 9 (5), 1170-1182 (2014).</li>
	<li>Shull, G., Haffner, C., Huttner, W. B., Kodandaramaiah, S. B., Taverna, E. Robotic platform for microinjection into single cells in brain tissue. EMBO Reports. 20 (10), e47880 (2019).</li>
	<li>Jabeen, S., Thirumalai, V. The interplay between electrical and chemical synaptogenesis. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1914-1922 (2018).</li>
	<li>Nagy, J. I., Pereda, A. E., Rash, J. E. Electrical synapses in mammalian CNS: Past eras, present focus and future directions. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (1), 102-123 (2018).</li>
	<li>Suk, H.J. et al. Closed-loop real-time imaging enables fully automated cell-targeted patch-clamp neural recording in vivo. Neuron. 95 (5), 1037-1047 (2017).</li>
	<li>Annecchino, L. A. et al. Robotic automation of in vivo two-photon targeted whole-cell patch-clamp electrophysiology. Neuron. 95 (5), 1048-1055 (2017).</li>
	<li>Kolb, I. et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Scientific Reports. 6, 35001 (2016).</li>
	<li>Holst, G. L. et al. Autonomous patch-clamp robot for functional characterization of neurons in vivo: development and application to mouse visual cortex. Journal of Neurophysiology. 121 (6), 2341-2357 (2019).</li>
	<li>Kodandaramaiah, S. B. et al. Multi-neuron intracellular recording 1 in vivo via interacting autopatching 2 robots. ELife. 7, 24656 (2018).</li>
	<li>Lubbert, H. et al. cDNA cloning of a serotonin 5-HT1c receptor by electrophysiological assays of mRNA-injected Xenopus oocytes (RNA fractionation/hybrid depletion/hybrid selection/choroid plexus/voltage clamp). Neurobiology. 84 (2) 4332-4336 (1987).</li>
	<li>Florio, M. et al. Human-specific gene ARHGAP11B promotes basal progenitor amplification and neocortex expansion. Science. 347 (6229), 1465-1470 (2015).</li>
	<li>Kalebic, N. et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).</li>
</ol>

Авторов нечего раскрывать.

Микроинъекция в одиночные нервные стволовые клетки в ткани обеспечивает превосходное разрешение одиночных клеток и по этой причине она была использована для вскрытия клеточной биологии прогрессии нервных стволовыхклеток и перехода судьбы (рисунок 2;см. также 10,11,12). Автоматизированная процедура микроинъекции может быть выполнена на других типах клеток как у эмбриональных мышей, так и у тканей мозга человека. Репрезентативные результаты микроинъекции новорожденных нейронов путем ориентации на базальную поверхность теленцефалона показаны на рисунке 3.
Принцип, установленный здесь, может быть применен к целевой несколько различных типов клеток в эмбриональных мозгах мыши и человеческого мозга. Мы ранее показали, что микроинъекции робот также может быть использован для целевой одиночных клеток-предшественников в мышиного заднего мозга и теленцефалона и новорожденных нейронов в мыши и человека развивающихся neocortex12. Чтобы получить наилучшие результаты процедуры инъекции, следует оптимизировать все шаги перед началом инъекции. Важно тщательно продумать и оптимизировать подготовку жизнеспособных и хорошо сохранившихся органотипических ломтиков тканей из тканей мозга(рисунок 1). Очень важно быть быстрым в процедуре вскрытия и нарезки, иллюстрированной на рисунке 1. Для апической инъекции ориентации APs, следует выбрать ломтики, показывающие идеальную ориентацию апической поверхности. Для инъекций АП идеальной ориентацией является апическая поверхность перпендикулярно нижней части чашки Петри. Любая другая ориентация будет вседозволенной, однако, апическая поверхность перпендикулярно чашке Петри обеспечивает более широкую площадь поверхности для инъекций, тем самым увеличивая успех инъекций. Для инъекций в нейроны, ориентация ломтик играет практически никакого эффекта.
После того, как ломтики для инъекций выбраны, процедура инъекции на срез занимает около 5 минут. Учитывая, что человек работает с живой тканью, настоятельно рекомендуется ускорить процедуру инъекций. С этой целью мы рекомендуем установить все параметры для инъекций через графический интерфейс(рисунок 1D) до того, как ткань будет готова, чтобы уменьшить ненужное время ожидания. Для устранения неполадок, пожалуйста, обратитесь к дополнительному файлу.
В случае долгосрочной культуры ломтика, шаги после автоматизированной процедуры микроинъекции могут повлиять на здоровье клеток и, таким образом, эксперимент. Поэтому настоятельно рекомендуется продать тест на контроль качества и оптимизировать условия культуры среза. Для оценки жизнеспособности клеток после нарезки и инъекции процедуры, мы выполнили EdU маркировки во время культуры, и мы количественно количество пикнотических ядер (прокси для апоптотических клеток) в культурах и вводилиткани 12. Эти количественные оценки не выявили какого-либо существенного влияния микроинъекции на жизнеспособность тканей(рисунок 2C). Мы рекомендуем проводить аналогичные контроль качества при установлении органотипической нарезки тканей и микроинъекции трубопровода в лаборатории.
По сравнению с ручной микроинъекции, микроинъекции робот обеспечивает ряд преимуществ. Во-первых, кривая обучения для пользователя менее крутой по сравнению с ручной инъекции: новый пользователь достигнет высокого уровня знаний после ограниченного числа сессий, как правило, 1 или 2. Во-вторых, в случае ручного микроинъекции сопоставимый уровень знаний требует месяцев обучения. Процедура инъекций быстрее и эффективнее(рисунок 2B). Мы количественно эти параметры и обнаружили, что микроинъекции робот превзошел квалифицированного ручного пользователя по отношению к успеху инъекции (% от успешной инъекции / общее количество инъекций) и в общее количество инъекций наединицу времени 12. Это приводит к общему 300% повышению эффективности инъекций (% от успешной инъекции/мин) для микроинъекции робота по сравнению с квалифицированным пользователем. Повышение эффективности было еще более выраженным при сравнении микроинъекции робота с начинающим пользователем и достигло 700%. И последнее, но не менее последнее, робот микроинъекции может быть легко запрограммирован на систематическое изучение всех пространственных параметров. Это особенно выгодно при адаптации микроинъекции робота к новым клеткам или тканям, или при использовании микроинъекции робота для целей, требующих различного пространственного разрешения.
Создание микроинъекции робота требует минимальных изменений в существующий эпифлуоресцентный микроскоп12. Ранее мы предоставили инструкции по этой адаптации в https://github.com/bsbrl/Autoinjector. После установки оборудования этот протокол предоставляет ключевые методологические детали для успешного проведения автоматизированных микроинъекций. В целом, микроинъекция робот имеет успешную скорость впрыска 15,52 и 2,48 инъекций / мин, что в 15 раз больше, чем неопытный пользователь (1,09 ± 0,67 инъекции / мин), и в 3 раз больше, чем опытный пользователь (4,95 ± 1,05 инъекций / мин)12. Это улучшение успешной скорости инъекций дает возможность как начинающим, так и экспертным пользователям вводить больше клеток в более короткое количество времени, которое имеет важное значение для сохранения жизнеспособности тканей. Кроме того, микроинъекции робот настраивается и траектории, глубина инъекции, количество инъекций, интервал между инъекциями все могут быть настроены с помощью графического интерфейса. Эти функции позволяют использовать микроинъекции робота в качестве инструмента для оптимизации ранее трудоемких экспериментов, а также для изучения принципиально новых экспериментов, которые требуют более высокой урожайности, чем это было возможно ранее.
Основные ограничения процедуры микроинъекции, описанной здесь, связаны с подготовкой ломтиков тканей, что является важным шагом, который требует обширной оптимизации. Кроме того, микроинъекция зависит от наличия поверхности, к ней можно подойти стеклянной пипеткой. Эта функция ограничивает тип тканей и тканей местах, которые могут быть направлены через микроинъекции с помощью нынешней установки.
Микроинъекции робот в настоящее время использует яркие изображения поля и был использован в пробирке мозга ломтик подготовки. В будущем робот микроинъекции может быть объединен с 2-фотонной визуализацией, чтобы увеличить специфичность одноклеточного таргетинга in vivo для молекулярной или красителной маркировки. Такие усилия уже были предприняты для одноклеточной электрофизиологии15,16. Текущее устройство требует ручного наблюдения за процедурой микроинъекции. Будущие версии могут включать в себя стратегии для очистки забиты микроинъекциипипетки 17 или интеграциижидкости обработки роботов 18 для мультиплексных, полностью автономных микроинъекций. Эти устройства могут увеличить масштаб микроинъекции на порядок. Адаптация алгоритмов параллельного контроля нескольких микроинъекциипипеток 19 может позволить мультиплексированную доставку десятков красителей и молекулярных реагентов в те же клетки в рамках тех же экспериментов. Это может открыть новые возможности для молекулярного скрининга в тканях.
Робот микроинъекции может быть использован для метки функционально идентифицированных клеток с помощью ДНК или РНК штрих-кодов. Это, в свою очередь, может быть объединено с другими методами анализа одноклеточных клеток, такими как одноклеточное секвенирование РНК (scRNAseq) и электронная микроскопия. Наши предварительные результаты показывают, что микроинъекции клеток и их потомство могут быть восстановлены и изолированы с помощью диссоциации тканей следуют FACS сортировки (Таверна, неопубликованные результаты). Отсортированные ячейки FACS могут быть использованы для scRNAseq. Кроме того, предварительные результаты показывают, что возможности разрешения одной клетки робота микроинъекции могут быть использованы в сочетании с электронным микроскопическим анализом для изучения клеточной биологии нервных стволовых клеток в тканях с высоким пространственным разрешением (Taverna и Wilsch-Br'uninger, неопубликованные результаты). Эти данные свидетельствуют о том, что микроинъекции робот может быть использован в качестве инструмента для коррелятивного света и электронной микроскопии в тканях и в более широком смысле, для мультимодального анализа идентичности клеток и поведения в тканях.
Микроинъекция опирается на использование давления, и можно позволить себе инъекционные растворы с высокой молекулярной сложностью (например, весь транскриптом). Эта особенность микроинъекции была использована в прошлом для изоляции и клонирования лиганд-закрытых рецепторов20. Вдоль этой линии, микроинъекции робот может быть использован для моделирования и изучения мультигенных черт на клеточном уровне. В сочетании со стратегией суб-пулирования робот микроинъекции также может использоваться в качестве платформы для определения минимального набора генов, вождения определенной черты/клеточного поведения. До сих пор робот микроинъекции использовался для манипулирования биохимией клетки с помощью доставки мРНК, ДНК или рекомбинантныхбелков 10,21,22. Мы предвидим применение микроинъекционного робота для зондирования биофизики внутриклеточного пространства, например, путем доставки наноматериалов или наномашин, позволяющих зондировать и/или манипулировать биофизическими свойствами внутриклеточного пространства.

Этот протокол описывает использование робота для таргетинга и манипулирования одиночными клетками в срезах тканей мозга, сосредоточив внимание, в частности, на одиночных нервных стволовых клетках и нейронах. Робот был разработан для решения центрального вопроса в развитии нейробиологии, то есть как нервные стволовые клетки и клетки-предшественникиспособствуют морфогенезу мозга 1,2,3,4,5. Чтобы ответить на этот вопрос, нужно маркировать и отслеживать одиночные нервные стволовые клетки и следовать их прогрессии линии с течением времени, чтобы соотнести поведение одной клетки с морфогенезом тканей. Это может быть достигнуто по-разному, например, путем электропорации ткани мозга в утробе матери или путем маркировки одной клетки с помощью липофильных умирает. Хотя эти методы являются мощными, они не имеют точного разрешения одной клетки (электропорация) и/или возможности манипулировать внутриклеточным пространством (липофилинический краситель). Микроинъекция в одиночные клетки была разработана, чтобы преодолетьэту проблему 6,7,8. Во время микроинъекции, пипетка кратко вставляется в одну клетку в нетронутой ткани под давлением микроинъекции фемтолитера объемовреагентов 9. Ранее мы описали ручную процедуру микроинъекта одиночных нервных стволовых клеток в органотипическойткани (рисунок 1A)10,11. Микроинъекция в нервные стволовые клетки опирается на использование микропипюты, которая вставляется в одиночные нервные стволовые клетки для введения раствора, содержащего флуоресцентный краситель, наряду с другими молекулами, представляющими интерес. Селективное ориентации нервных стволовых клеток достигается путем приближения развивающихся теленцефалона через желудочковой поверхности (или желудочка, см. мультфильм на рисунке 1A), который формируется апической плазменной мембраны апических прародителей (мультфильм на рисунке 1A). Этот процесс должен быть повторен для каждой клетки, что экспериментатор желает ввести. Кроме того, успех микроинъекции зависит от точного контроля глубины и продолжительности инъекций микропипюты в ткани. Таким образом, несмотря на уникальные преимущества, ручная микроинъекция крайне утомительна и требует значительной практики для выполнения при разумной пропускной способности и урожайности, что затрудняет использование этой техники в масштабируемой форме. Чтобы преодолеть это ограничение, мы недавно разработали изображение управляемого робота, Autoinjector12 (или микроинъекции робота), который может автоматически выполнять микроинъекции в одиночные клетки.
Робот микроинъекции использует микроскопические алгоритмы визуализации и компьютерного зрения, чтобы точно ориентироваться на конкретные места в 3-D пространстве в ткани для микроинъекции(рисунок 1B). Робот микроинъекции может быть построен путем внесения относительно простых изменений в существующую установку микроинъекции. Общая схема микроинъекции робота показана на рисунке 1C. Пипетка устанавливается в держатель пипетки, прикрепленный к трехосевому манипулятору. Микроскоп камера используется для получения изображений ткани и микроинъекции иглы. Для контроля давления внутри пипетки используется система регулирования пользовательского давления, а для контроля положения микроинъекторной пипетки используется программируемый микроманипулятор. Изображения камеры ткани и микроинъекции пипетки используются для определения пространственного расположения микроинъекции пипетки кончика и места, в которых микроинъекции должны быть выполнены. Программное обеспечение затем вычисляет траектории, необходимые для перемещения пипетки в ткани. Все оборудование контролируется программным обеспечением, которое мы ранее разработали. Все программное обеспечение написано на языке кодирования (например, Python и Arduino) и может быть загружено https://github.com/bsbrl/Autoinjector с инструкциями. Графический пользовательский интерфейс (GUI) позволяет пользователю изображение ткани и микропипюты, а также настроить траекторию микроинъекции. Наша система может быть создана с использованием относительно простых модификаций перевернутого микроскопа, оснащенного фильтрами яркого поля и эпифлуоресценции.
Во-первых, мы предоставляем инструкции по подготовке ломтиков органотипической ткани мозга для микроинъекции. Затем протокол иллюстрирует запуск микроинъекции робота с последующими подготовительными шагами, такими как калибровка движения пипетки, которые должны быть сделаны до микроинъекции. За этим следует определение параметров впрыска. После этого пользователь может определить траекторию, используемую роботом микроинъекции, и начать процедуру впрыска. Микроинъектируемые ткани (в данном случае ломтики органотипической ткани мозга) могут храниться в культуре в течение разных периодов времени взависимости от экспериментального дизайна 10,11. Ткань может быть обработана, чтобы следить и изучать идентичность и судьбу инъекционных клеток и их потомства. Кроме того, за микроинъектными клетками можно следить с помощью живой визуализации. В рамках этого протокола мы демонстрируем использование робота для автоматического микроинъекции нейронных клеток-предшественников в органотипических ломтиках мыши E14.5 спинного теленцефалона. Робот также способен микроинъекции в новорожденных нейронов в мыши теленцефалона, а также в теленцефалонеплода человека 12.
Таким образом, мы описываем роботизированную платформу, которая может быть использована для следовать и манипулировать одиночными клетками в тканях. Платформа использует давление и, следовательно, чрезвычайно универсальна в отношении химического характера соединения для инъекций. Кроме того, он может быть адаптирован к клеткам-мишеням, кроме стволовых клеток. Мы ожидаем, что наша система будет легко адаптирована к другим модельным системам.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Low Melt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Cat# 6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Wild Range</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# A2790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Best-CA 221 Glue</td>
			<td>Best Klebstoffe GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>Cat# CA221-10ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellmatrix Type-IA (Collagen, Type !)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals</td>
			<td>Cat# 637-00653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled Water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12, CO2 independent (w/o Phenol red)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# D2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12, CO2 independent (with Phenol red)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# D8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-NAOH, pH 7.2, 1M (HEPES buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Cat# 9105.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine, 200 mM</td>
			<td>Thermo Fisher Sientific</td>
			<td>Cat# 25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# 81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 (40%), CO2 (5%), N2 (55%) Mix, 50 liters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# 818715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# 106323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# 106482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#8217;s salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Cat# T2145-10x1L)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries, 1.2 mm outer diameter x 0.94 mm inner diameter</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Cat# BF-120-94-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top filter system, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer PC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom pressure rig</td>
			<td></td>
			<td>Custom pressure rig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pressure regulator</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>Cat# 990-005101-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 50 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat# 430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/ Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Cat# P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont no. 3</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Cat# 11231-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont no. 5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Cat# 11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont no. 55</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Cat# 11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>Cat # Dri block Digi2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Cat# Axiovert 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Cat# Highlight 3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual pressure regulator</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>Cat# 0-60 PSI 41795K3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat# 5242956.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>Cat# Arduino Due</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage XY for microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plate, 24 wells</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>Cat# 142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, plastic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 60 x 15 mm</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>Cat# 628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 x 10 mm</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>Cat# 153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 34 x 14 mm, including Microwell no. 1.5 cover glass</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>Cat# P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>Cat# 64-2354 MP-s12u</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette and tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller filament, 3.0-mm square box filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Cat# FB330B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice culture incubation box</td>
			<td>MPI-CBG</td>
			<td>Cat# custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solenoid valve</td>
			<td>Cat# LHDA053321H-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Cat# SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Cat# 5431622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-axis Manipulator</td>
			<td>Sensapex Inc</td>
			<td>Cat# tree-axis uMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Cat# VT1000s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole-embryo-culture-system incubator</td>
			<td>Ikemoto Company</td>
			<td>Cat# RKI-10-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino</td>
			<td>Arduino</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>RRID: SCR_002285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software foundation</td>
			<td>Python 2.7.12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN</td>
			<td></td>
			<td>RRID: SCR_013672</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulation of single neural stem cells and neurons in brain slices using robotic microinjection

Центральным вопросом в нейробиологии развития является то, как нервные стволовые клетки и клетки-предшественники образуют мозг. Чтобы ответить на этот вопрос, нужно маркировать, манипулировать и следовать одиночные клетки в ткани мозга с высоким разрешением с течением времени. Эта задача является чрезвычайно сложной из-за сложности тканей в головном мозге. Недавно мы разработали робота, который направляет микроинъекцию иглы в ткани мозга при использовании изображений, полученных из микроскопа для доставки фемтолитера объемы раствора в одиночные клетки. Роботизированная операция увеличивается в результате общей урожайности, которая на порядок больше, чем ручной микроинъекции и позволяет для точной маркировки и гибкой манипуляции одиночных клеток в живой ткани. При этом можно микроинъектность сотни клеток в рамках одного органотипического ломтика. Эта статья демонстрирует использование микроинъекции робота для автоматизированной микроинъекции нейронных клеток-предшественников и нейронов в срезах тканей мозга. В более широком смысле, он может быть использован на любой эпителиальной ткани с изображением поверхности, которые могут быть достигнуты пипеткой. После настройки робот микроинъекции может выполнять 15 или более микроинъекций в минуту. Микроинъекционный робот из-за своей пропускной способности и обратности сделает микроинъекцию широко простой высокой производительности метод манипуляции клеток, которые будут использоваться в биоинженерии, биотехнологии и биофизики для выполнения одноклеточного анализа в органотипических ломтиков мозга.

Микроинъекция служит цели отслеживания и манипулирования одиночными нервными стволовыми клетками и их потомством в живой ткани и следовать их прогрессии линии в физиологической среде. В этой статье мы продемонстрировали использование микроинъекции робота для таргетинга и автоматического микроинъекции органотипических ломтиков телецефалона мыши. Рисунок 2 иллюстрирует репрезентативные изображения успешно введенных клеток-предшественников, а рисунок 3 иллюстрирует инъекционные новорожденные нейроны. При введении с Dextran Alexa-488 (или Alexa-A555) красителя, клетки появляются полностью заполнены красителем. Что касается апических прародителей(рисунок 2) конфокальной визуализации позволяет реконструировать с высоким пространственным разрешением морфологии клеток, наличие - или отсутствие- апической и базальной привязанности, а также объединить морфологический запрос с маркером выражения. Объединив эти критерии, пользователь может назначить конкретную судьбу клеток микроинъектумированным клеткам и их потомствам. Что касается инъекций нейронов, пользователь может реконструировать нейрональной морфологии, в том числе структуры и особенности апического дендрита и аксона. Автоматизированная микроинъекция может обеспечить значительно более высокую пропускную способность по сравнению с ручной микроинъекции(рисунок 2B). Кроме того, маркировка EdU подтверждает, что жизнеспособность клеток не зависит от автоматизации(рисунок 2C). Сохранение органотипического ломтика в культуре позволяет после линии прогрессии микроинъектных клеток (мы показали 4 - 24h на рисунке 2D). Если раствор микроинъекции содержит генетический материал (ДНК, мРНК, руководства CRISPR-Cas9) или рекомбинантные белки, то это позволяет изучить, влияет ли манипуляция на прогрессирование линии и как на нее.
Микроинъекция в одиночные нервные стволовые клетки в ткани обеспечивает превосходное разрешение одиночных клеток и для этой причины она была использована для того чтобы вскрыть биологию клетки нервной прогрессии стволовой клетки и переходасудьбы (рисунок 3A). Микроинъекция позволяет доставить сложную смесь химических веществ. Ранее мы использовали эту функцию для изучения соединения в нейронных клетках-предшественниках, смешивая разрыв-соединение проницаемое с разрывом непроницаемых флуоресцентныхкрасителей 12. Мы продлили предыдущую работу, изучая соединение в новорожденных нейронов, путем введения Люцифер желтый вместе с Dextran-A555 (Рисунок 3B). Как показано на рисунке 3B, доля новорожденных пирамидальных нейронов соединены через разрыв соединений с соседними нейронами. Это наблюдение согласуется с идеей, что незрелые нейроны общаться черезразрыв-соединение 13,14. Кроме того, таргетинг нейронов показывает, что использование микроинъекции робота может быть обобщено до нескольких типов клеток в развивающемся мозге млекопитающих. Эта экспериментальная установка будет полезна для вскрытия клеточной биологии нейронов в тканях, например, путем доставки конкретных олигопептидов вмешиваться в белково-белковых взаимодействий.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61599/61599fig01.jpg"> Рисунок 1: Автоматизированная настройка микроинъекции и протокол. (A)Общий протокол для подготовки тканей и автоматизированных микроинъекций с помощью микроинъекции робота. Право вставка: Мультфильм схема мыши Telencephalon предназначены для микроинъекции в этом протоколе. (B)Flowchart автоматизированных шагов микроинъекции. (C)Схема микроинъекции робота оборудования. (D)Графический пользовательский интерфейс (GUI) программного обеспечения, используемого для управления и работы микроинъекции робота. Эта цифра адаптирована из ref.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61599/61599fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61599/61599fig02.jpg"> Рисунок 2: Роботизированная микроинъекция в апические прародители. Схематические и ожидаемые результаты при использовании микроинъекции робота для целевой апических прародителей (АП) через апикаль поверхности (апическая инъекция). (A)Верхний ряд. Слева: схема процесса. Справа: графический интерфейс с соответствующими параметрами для апической инъекции. Нижний ряд. Слева: фазовое контрастное изображение, взятое во время процедуры инъекции (V: желудочек; BL: базальная ламина). Справа: репрезентативные результаты, показывающие микроинъектные APs. Dashed линия представляет желудочек (V). Шкала бар: 10 мкм . (B) Успешные инъекции в минуту для начинающего пользователя на ручной микроинъекции системы, опытный пользователь на ручной микроинъекции системы, и микроинъекции робота. (C)Включение ЭдУ в микроинъектные клетки и в неинъектные клетки в инъекционной области. Органотипические ломтики мыши E14.5 спинного теленцефалона были либо (i) не вводили или (ii) подвергаются ручной или автоматизированной микроинъекции (инъекционный ломтик) с помощью Dextran-A488 (для ручного и автоинжектора). Фрагменты хранились в культуре в присутствии EdU в течение 24 ч, затем они были зафиксированы и окрашены для DAPI и EdU. Инъекционные и не введенные клетки в инъекционной области были забиты за положительность ЭдУ. (D)Использование микроинъекции робота Lineage трассировки. Флуоресцентный краситель (Dx3-A555, пурпурный) вводится в одну нейронную стволовую клетку (т 0 ч). Флуоресцентный краситель перепеется на клетки дочери (d1, d2) во время митоза. Это позволяет следить за потомством инъекционной клетки (т 4 ч и 24 ч) и выявление прогрессии линии с течением времени. Для t q 24 h, мы показываем несколько примеров потомства одно надеется найти. Шкала баров: 10 мкм. Графики в B и C взяты из ref.12 Пожалуйста, нажмите<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61599/61599fig02large.jpg" target="_blank">здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61599/61599fig03v2.jpg"> Рисунок 3: Роботизированная микроинъекция в нейроны. Схематические и ожидаемые результаты при использовании микроинъекции робота для целевой пирамидальных нейронов (N) через базальную поверхность (базальная инъекция). (A)Верхний ряд. Слева: схема процесса. Справа: графический интерфейс с соответствующими параметрами для базальной инъекции. Нижний ряд. Слева: фазовое контрастное изображение, взятое во время процедуры инъекции (V: желудочек; BL: базальная ламина). Справа: репрезентативные результаты, показывающие микроинъектированную линию N. Dashed, представляющую базальную ламину (BL). Шкала бар: 10 мкм . (B) Использование автоинъектора для изучения разрыва связи в тканях. Пирамидальные нейроны были введены с раствором, содержащим два красителя: разрыв соединения непроницаемой Dx-A555 (не показано) и разрыв-соединение проницаемый Люцифер желтый (зеленый). Dx-A555 ограничивается целевой ячейкой (звездочками), в то время как LY рассеивается на ячейки, которые соединены через разрыв соединения с целевой ячейкой (разбитые линии). Левая панель: Низкая экспозиция, видны только микроинъектуальные клетки. Правая панель: Высокая экспозиция позволяет визуализировать инъекционные клетки, а также соединенные клетки (разбитые линии). Шкала бар: 10 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61599/61599fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительный файл: Устранение нескольких распространенных ошибок, возникающих при микроинъекции. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61599/Troubleshooting_ver02.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection at JoVE.com

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

Этот протокол демонстрирует использование роботизированной платформы для микроинъекции в одиночные нервные стволовые клетки и нейроны в срезах мозга. Этот метод является универсальным и предлагает метод отслеживания клеток в тканях с высоким пространственным разрешением.

Манипуляция одиночными нервными стволовыми клетками и нейронами в ломтиках мозга с помощью роботизированной микроинъекции

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Этот метод позволяет присмотреться к одиночным клеткам в живой ткани. Путем отслеживать и манипулировать одиночными клетками, мы можем более лучше понять образование ткани во время развития. Визуальная демонстрация этого метода позволяет потенциальным пользователям решить, может ли этот метод быть полезным для их работы.Кроме того, это позволяет пользователям видеть, как приложение работает, что было бы трудно понять из текста в одиночку. Этот протокол может быть применен к каждой ткани с оцениваемой поверхностью. Мы ориентируемся на разные клетки в одной и той же ткани, различные ткани одного и того же вида, а также различные виды.При попытке этого протокола важно оставаться сосредоточенным и работать быстро. Все оборудование должно быть подготовлено перед началом вскрытия. Начните с установки программного обеспечения авто-инжектора и потянув микроинъекции пипетки из борозиликатных стеклянных капилляров с шкивом micropipette.Храните пипетки до трех дней, защищенные от пыли. Растопить 3%wide диапазон агароза с помощью микроволновой печи. Не позволяйте агарозы затвердеть, удерживая его в водяной бане при 37 градусах по Цельсию.Оттепель aliquot SCM и тепло от 10 до 12 миллилитров SIM и 20 миллилитров раствора Tyrode до 37 градусов по Цельсию с помощью водяной ванны. Смешайте флуоресцентный трассировщик с другими химическими веществами, которые будут введены, а затем центрифугировать раствор микроинъекции при 16 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант и перенесите его в новую трубку.Держите раствор микроинъекции на льду до его использования. Используйте головки от E13.5 до E16.5 эмбрионов мыши для подготовки органотипических ломтиков ткани теленцефалона. Удалить кожу и открыть череп с типсами движущихся вдоль средней линии.Рассекаете эмбриональный мозг из открытого черепа и удалите оковы, покрывающие ткани мозга, начиная с брюшной стороны мозга. Оставьте расчлененный весь мозг в растворе Тирода на нагревательном блоке 37 градусов по Цельсию. Налейте широкий ассортимент расплавленной агарозы в одноразовые встраивания формы.Когда он охлаждается до 38 до 39 градусов по Цельсию, тщательно перенесите до четырех мозгов в агарозу с помощью пипетки Pasteur. Перемешать агарозу вокруг ткани шпателем или парой типсов Dumont номер один, не касаясь ткани. Пусть агароза затвердевет при комнатной температуре.После того, как агароза затвердевла, обрезать избыток окружающих ткани. Заполните буферный лоток PBS. Ориентация мозга с ростральной хвостовой оси ткани перпендикулярно лоток и сократить 250 микрометров ломтиками с помощью вибромы.Заполните 3,5-сантиметровую чашку Петри двумя миллилитров предварительно разогретых средств массовой информации, а затем используйте пластиковую пипету Pasteur для передачи от 10 до 15 ломтиков этого блюда. После завершения, передача чашки Петри с ломтиками в срез культуры инкубатора. Поддерживайте ломтики при 37 градусах Цельсия во влажной атмосфере.Включите компьютер, микроскоп, микроскоп камеры, манипуляторы, давление установки, и датчик давления. Загрузите приложение, нажав на файл, запустите приложение.py в основной папке, загруженной с GitHub, и укажите настройки устройства на всплывающем экране.Чтобы предотвратить нежелательное засорение, создайте внешнее давление перед погружением пипетки в раствор. Сдвиньте планку давления компенсации до 24 до 45% и нажмите на установленные значения. Затем настройте давление, повернув ручку клапана механического давления в один-два PSI, как указано датчиком давления.Перенесите ломтики в центр 3,5-сантиметровой чашки Петри, содержащей два миллилитров предварительно разогретой SIM-карты, а затем поместите чашку Петри на стадию микроинъекции, которая была разогрета до 37 градусов по Цельсию. Загрузите микроинъекцию пипетки с 1,4 до 1,6 микролитров раствора микроинъекции с помощью длинного наконечника пластиковой пипетки и вставьте микроинъекцию пипетки в держатель пипетки. Используя наименьшее увеличение на микроскопе, довейте кусочек в фокус и направляйте микропайпетт к этому полю зрения, чтобы он был сфокусирован на той же плоскости, что и цель среза.Переключитесь выход микроскопа на камеру, чтобы увидеть FOV и приложение. Нажмите кнопку увеличения в левом верхнем слева от интерфейса, чтобы инициировать калибровку устройства. Когда окно подсказывает выбрать увеличение, выберите 10X и нажмите OK. Программное обеспечение предполагает, что внутренний объектив цели 10X.Переориентация наконечника пипетки с помощью микрометрического колеса микроскопа и нажмите на кончик пипетки курсором. Затем нажмите кнопку шага 1.1 и нажмите OK в всплывающем окне. Пипетка будет двигаться в направлении.Нажмите на кончик пипетки и нажмите кнопку шаг 1.2. Наконец, введите 45 в поле угла пипетки и нажмите на угол набора. Введите желаемые параметры в автоматизированную панель управления микроинъекции и установите скорость до 100%После завершения, нажмите набор значений.Нажмите кнопку края притяжки и перетащите курсор по нужной траектории в всплывающем окне, чтобы определить траекторию впрыска. Для микроинъектирования нейронов, целевой базальной стороне теленцефалона. Принесите пипетку к началу линии и нажмите ее кончик, а затем нажмите траекторию запуска, чтобы начать микроинъектирование.Повторите этот шаг для каждой плоскости инъекций целевых. Погрузите ломтики в коллагеновую смесь, затем перенесите ломтики вместе с 200-300 микролитров коллагена в 14-миллиметровый колодец 35-миллиметровой стеклянной нижней тарелки. Убедитесь, что ломтики покрыты в наименьшее количество коллагена возможно, что является оптимальным условием для питательных веществ и поглощения кислорода.Ориентируйте ломтики с помощью двух пар типсов и инкубировать чашку Петри в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию на нагревательном блоке, чтобы коллаген затвердел. Переместите чашку Петри обратно в инкубатор культуры ломтиков еще на 40 минут, затем добавьте два миллилитров предварительно разогретого СКМ. В конце культуры, принять ломтики из среза культуры инкубатора и аспирировать СКМ.Вымойте коллаген-встроенные ломтики с PBS, а затем добавить 4%paraformaldehyde и оставить ткани при комнатной температуре в течение 30 минут. Перемести его до четырех градусов по Цельсию для ночной фиксации. На следующий день, аспирировать раствор параформальдегида и мыть ломтики с PBS.Удалите ломтики из коллагена с помощью двух пар типсов под стерео микроскопом. Используйте микроволновую печь, чтобы расплавить 3%low точки плавления агарозы, а затем залить его в одноразовые встраивания формы и дайте ему остыть примерно до 38 или 39 градусов по Цельсию. Передача ткани ломтиками в эту форму убедившись, что кожура стороне ломтик сталкивается вверх, а затем позволить агарозы остыть до комнатной температуры и затвердеть.Обрежьте дополнительную агарозу, окружающую ломтики. Сориентировать блок агарозы, чтобы убедиться, что срезанной поверхности параллельно вибромы резки лезвия и сократить 50 микрометров толщиной разделов. Заполните 24-хорошо блюдо с PBS и передачи разделов в это блюдо с помощью тонкой наконечником кисти, а затем выполнить иммунофторесценции в соответствии со стандартными протоколами.Здесь показаны репрезентативные изображения успешно введенных клеток-предшественников и новорожденных нейронов. При введении с Dextran Alexa 488, клетки появляются полностью заполнены красителем. Автоматизированная микроинъекция может обеспечить значительно более высокую пропускную способность по сравнению с ручной микроинъекции.Кроме того, маркировка EDU подтверждает, что на жизнеспособности клеток автоматизация не влияет. Сохранение органотипического ломтика в культуре позволяет следить за прогрессированием линии микроинъектных клеток. Микроинъекция в одиночные нервные стволовые клетки обеспечивает отличное разрешение одиночных клеток.Поэтому он был использован для вскрытия клеточной биологии прогрессирования нервных стволовых клеток и перехода судьбы. Этот протокол был использован для изучения соединения в новорожденных нейронов путем введения Люцифер желтый вместе с Dextran A555. Доля новорожденных пирамидальных нейронов были соединены через разрыв соединения с соседними нейронами, что согласуется с идеей, что незрелые нейроны общаться через разрыв соединения.Мы использовали этот метод для исследования клеточной биологии развития мозга и эволюции мозга. Мы изучили несколько генов-кандидатов, которые влияют на поведение нервных стволовых клеток, и мы смогли обнаружить и понять, как они работают, как они влияют на прогрессирование линии нервных стволовых клеток, и производство нейронов во время развития мозга.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Адаптация Haptic Робот в 3Т МРТ

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Аплизия Ганглия Подготовка к электрофизиологическому и молекулярному анализу отдельных нейронов

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun волокнистых Строительные леса поли (глицерин-dodecanedioate) инженерного нервных тканях От эмбриональных стволовых клеток мыши

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Заказ отдельных клеток и Single зародышами в 3D конфайнмента: Новое устройство для высокого содержания скрининга

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Род основе Изготовление настраиваемыми Soft роботизированных захватных Пневматические устройства для деликатной ткани манипулированию

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Роботизированная Дозирование Техника для ориентации поверхности и Bioprinting клеток

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Автоматизированных роботов жидкой обработке Ассамблеи устройств модульной ДНК

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Улучшение 3D гидрогеля культур первичных глиальных клеток In Vitro моделирования Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...