Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

ونحن نعترف الدكتور لودوفيك ريتشرت لمساعدته القيمة على الحصول على البيانات FLIM وللصيانة التقنية وتطوير الإعداد FLIM. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منح من مؤسسة من أجل إعادة التشيرش (https://icfrc.fr/). يتم تمويل VN من قبل مؤسسة من أجل Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). تعرب جمعية الشبان المسيحية عن امتنانها لـ Institut Universitaire de France (IUF) لدعمه وتوفيره وقتًا إضافيًا للأبحاث. 41- ويعترف معهد الخدمات العامة وشركة جي جي بالمعهد المعني بتسليم المخدرات في ستراسبورغ لدعمه المالي.

1- بناء بلاسميد
<ol><li>تضخيمها من قبل اثنين PCR (PCR1 و 3) تسلسل الحمض النووي (استخدام الحمض النووي الجينومي P. aeruginosa PAO1) من 700 أزواج قاعدة المنبع والمصب من المناطق المقابلة لموقع الإدراج في P. aeruginosa الجينوم مع البوليميراز الحمض النووي عالية الدقة. إضافة مواقع تقييد التمهيديات باللونين ال?...

FLIM-FRET يقدم بعض المزايا الرئيسية على كثافة القائم على التصوير فريت. عمر الفلوريسنس هو معلمة جوهرية من الفلوروفور. ونتيجة لذلك، فإنه لا يعتمد على تركيزات محلية من الفلوروفهور لا على شدة الإثارة الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك ، يتأثر عمر الفلوريسنس أيضًا بشكل سيئ بتبييض الصور. ومن المثير للاهتمام...

البروتين البروتين التفاعلات (PPIs) السيطرة على العمليات الرئيسية المختلفة في الخلايا1. تختلف أدوار PPIs على أساس تكوين البروتين ووظائف التقارب والمواقع في الخلايا2. يمكن التحقيق PPIs عن طريق تقنيات مختلفة3. على سبيل المثال، إن التشارك في المناعة هو تقنية بسيطة نسبياً وقوية وغير مكلفة تستخدم عادة لتحديد أو تأكيد مؤشرات أسعار المنتجين. ومع ذلك، يمكن أن تكون دراسة مؤشرات أسعار المنتجين صعبة عندما يكون البروتينات المتفاعلة ذات مستويات تعبير منخفضة أو عندما تكون التفاعلات عابرة أو ذات صلة فقط في بيئات محددة. دراسة PPIs التي تحدث بين الإنزيمات المختلفة للمسار p. aeruginosa يتطلب أن قمع الحديد العام- شارك في عوامل قمع الفراء هو تخفيف للسماح للتعبير عن جميع البروتينات من المسار pyoverdine للتعبير عنها في الخلية4,5,6. هذا التنظيم المشترك لجميع البروتينات من المسار النتائج في الوقت المناسب التعبيرات في الخلية المتوقع أن تعزز تفاعلاتها. إن التنوع من حيث الحجم والطبيعة ومستويات التعبير وعدد البروتينات لهذا المسار الأيضي يجعل من الصعب الدراسة في النظم المعاد تشكيلها6. ولذلك فإن استكشاف مؤشرات أسعار المنتجين في بيئتها الخلوية أمر بالغ الأهمية لزيادة فهم الوظائف البيولوجية للبروتينات في سياقها الأصلي.
فقط بعض الطرق بما في ذلك fluorescence تسمح استكشاف PPIs في الخلايا الحية7. من بين معلمات الفلوريسنس المختلفة التي يمكن قياسها ، فإن عمر الفلوريسنس (أي متوسط الوقت الذي يبقى فيه الفلوروفور في حالته المتحمسة قبل انبعاث فوتون) هو على الأرجح أحد أكثر المعلمات إثارة للاهتمام لاستكشافها في الخلايا الحية. عمر الفلوروفور الفلوري حساس جداً لبيونته، وبالتالي يمكن لـ FLIM توفير معلومات كيميائية أو فيزيائية فيما يتعلق بمحيط الفلوروفور8. وهذا يشمل وجود Förster نقل الطاقة الرنين (فريت) التي يمكن أن تحدث في وجود "مقبول" من الفلوريس تقع على مسافة قصيرة من "المانحة" fluorescence. نقل الطاقة النتائج في تقصير كبير من فلورية المانحة مدى الحياة (الشكل 1A)، مما يجعل الفلوريسنس التصوير المجهرية مدى الحياة (FLIM) نهجا قويا لاستكشاف البروتين البروتين التفاعلات مباشرة في الخلايا الحية. يمكن لـ FLIM بالإضافة إلى ذلك توفير معلومات مكانية حول مكان حدوث التفاعلات في الخلايا7و8. وهذا النهج قوي للغاية في التحقيق في مؤشرات أسعار المنتجين في الحالات التي يكون فيها وضع العلامات مع الفلوروفوريس من الشريكين المتفاعلين ممكناً.
لFRET أن يحدث - الظروف الحرجة على المسافة بين اثنين من الفلوروفور مطلوب8،9. وينبغي أن لا يكون الفلوروفورين بعيدين عن بعضهما البعض بأكثر من 10 نانومتر. لذلك، يجب أخذ التحذيرات عند تصميم تجارب FLIM-FRET لضمان أن المانح ومقبل الفلوريسنس لديهم فرصة ليكونوا قريبين من بعضهم البعض في المجمع المتفاعل. وفي حين أن هذا قد يبدو مقيداً، فإنه في الواقع ميزة حقيقية لأن الاعتماد على المسافة من فريت يضمن أن اثنين من البروتينات الموسومة التي تخضع لفريت يجب أن تتفاعل جسدياً(الشكل 1A). ولذلك فإن الصعوبات في الحصول على إجابات واضحة عن مؤشر أسعار المنتجين في تجارب الميكالوك (قد لا يتفاعل بالضرورة بروتينان مُقَدَّمان) ليست مشكلة باستخدام FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> الشكل 1: مبدأ التحليل FLIM-FRET. كل بكسل من FLIM-FRET صورة متعددة الأبعاد يحتوي على معلومات حول تسوس الفلوريس سجلت في هذا الموقع المحدد (#counts = عدد الفوتونات المكتشفة في قناة t). (A) التمثيل الكلاسيكي لصورة FLIM هو عادةً صورة 2D مشفرة بالألوان الخاطئة (يسار). ويمكن ملاحظة انخفاض متوسط عمر المفلورة للمتبرع - كما يتضح من تغير في مقياس اللون - في وجود فريت، وهو مفيد بشأن وجود مؤشرات أسعار المنتجين في هذه المنطقة المكانية. (B) التداخل بين طيف الانبعاثات من المتبرع وطيف امتصاص المتقبل ضروري لحدوث فريت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وثمة شرط ثان لفريت هو أن الطيف انبعاث من المانح وأطياف امتصاص من المتقبل ينبغي أن تتداخل8 (الشكل 1B). وينبغي أن يكون استثارة المفلورة من المانح في أطوال موجية التي تسهم قليلا جدا في الإثارة المفلورة المباشرة للمقبل. ليس كل تركيبات من الفلوروفورات ممكنة، ونحن نوصي بالإضافة إلى ذلك لاستخدام الجهات المانحة بشكل تفضيلي مع تحلل الفلورين أحادية النطاق لتسهيل تفسيرات FLIM-FRET10. العديد من الأزواج من البروتينات fluorescence تلبية هذه المتطلبات، بما في ذلك زوجين eGFP-mCherry شعبية11 (لاستعراض على لوحة من البروتين الفلوري المتاحة FRET أزواج انظر12،13).
FLIM-FRET يسمح قياس تسوس عمر الفلوريسنس من المتبرع FRET في كل بكسل من صورة FLIM(الشكل 1A). هناك تقنيتان رئيسيتان لتحديد عمر الفلور الذي يختلفان في الاكتساب والتحليل: مجال التردد (FD)14 والمجال الزمني (TD). TD FLIM هو أكثر انتشارا ويتم تنفيذها باستخدام الإضاءة النبضية جنبا إلى جنب مع مختلف تكوينات الكشف المحتمل بما في ذلك طرق الغاء15، كاميرا16 خط أو وقت الفوتون واحد المترابطة العد (TCSPC) تقنيات8. وبالنسبة لكل من تقنيات FD و TD، لا يقاس عمر الفلوريسنسي بشكل مباشر ولكنه يتطلب تحليلاً للبيانات المقاسة لتقدير العمر أو مدى وجود التفاعلات. بالنسبة لتقنيات TCSPC، يعتمد التحليل الأكثر استخدامًا على تركيب التحللات مع وظائف مفردة أو متعددة الأسية باستخدام أقل تكراري تربيعي من إعادة الالتواء التي تقلل من مجموع المرجح للمخلفات.
وأخيراً، FLIM-FRET يمكن تنفيذها باستخدام الإثارة الفوتونية أو متعددة الصور على حد سواء. أحدث مزايا عدة مثل الحد من autofluorescence وphotodamage من الطائرة المحورية. الإثارة متعددة الصور تسمح أيضا عمق الإثارة أطول إذا كان يعمل في عينات سميكة 3D8. على العكس من ذلك، الإثارة الفوتون واحد عادة ما يكون أكثر كفاءة كما يتم تحديد المقاطع العرضية امتصاص اثنين فوتون من البروتينات الفلورسنت17.
هنا، نقترح بروتوكولا لقياسات FLIM-FRET من PPIs في حي P. aeruginosa في حالة معينة من اثنين من البروتينات التفاعل (PvdA وPvdL) أعرب عن ذلك مع أعداد مختلفة جدا من النسخ لإثبات جودة ومتانة تقنية في الكشف عن السمات الحرجة من PPIs. وتشارك البروتينات PvdA وPvdL في التركيب الحيوي pyoverdine. PvdA هو L-ornithine N5-oxygenase ويركب L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine من L-ornithine بواسطة الهيدروكسيل (PvdA) و formylation (PvdF)18. PvdL هو إنزيم غير الريبوسومي الببتيد (NRPS) يتكون من أربع وحدات. الوحدة الأولى تحفز الأحماض الميرية. الوحدة الثانية تحفز تفعيل L-Glu والتكثيف إلى الميرستية-coA. ثم, الوحدة الثالثة يكثف الأحماض الأمينية L-تاير التي يتم بعد ذلك isomerized في D-تاير. وأخيرا، فإن الوحدة الرابعة تربط L-Dab (حمض ديامنوبتيريك) من الأحماض الأمينية لتشكيل ثلاثية الptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. وهكذا فإن PvdL هي المسؤولة عن تخليق الأحماض الأمينية الثلاثة الأولى من السلائف pyoverdine. إن تفاعل بروتين PvdA مع PvdL يثير الدهشة حيث أن PvdL ، على العكس من PvdI و PvdJ ، لا يحمل وحدة خاصة بـ L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine. هذا التفاعل تشير إلى أن جميع الانزيمات المسؤولة عن السلائف البيوفردين يتم ترتيبها في مجمعات متعددة الأنزيمات العابرة والديناميكية19,20.
في هذا التقرير نشرح بالتفصيل كيفية بناء السلالات البكتيرية التي تعبر عن أصلين تتفاعل eGFP و mCherry وصفت البروتينات. كما أننا نُصف إعداد العينات وظروف التصوير الفعال لخلية FLIM-FRET. وأخيرا ، نقترح خطوة بخطوة تعليمي لتحليل الصور بما في ذلك أداة وضعت مؤخرا توفير إمكانيات التصور المتقدمة للتفسير المباشر للبيانات FLIM -FRET معقدة. مع هذا التقرير، نود أن نقنع ليس فقط المغامرة ولكن معظم علماء الأحياء أن فريت-FLIM هو تقنية سهلة الوصول وقوية قادرة على معالجة أسئلتهم حول PPIs مباشرة في البيئة الخلوية الأصلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

تتحكم التفاعلات البروتينية البروتينية (PPIs) في العمليات الرئيسية المختلفة في الخلايا. يوفر التحليل المجهري للتصوير الشعاعي للتصوير الشعاعي (FLIM) المُدمج مع نقل طاقة الرنين بالرنين الفلوري (FRET) معلومات دقيقة حول مؤشرات أسعار المنتجين في الخلايا الحية. FLIM-FRET يعتمد على قياس اضمحلال الفلوريسنس مدى الحياة من المتبرع FRET في كل بكسل من الصورة FLIM، وتوفير معلومات كمية ودقيقة حول PPIs ومنظماتها الخلوية المكانية. نقترح هنا بروتوكول مفصل لقياسات FLIM-FRET التي طبقناها لمراقبة PPIs في Live Pseudomonas aeruginosa في حالة معينة من اثنين من البروتينات المتفاعلة التي أعرب عنها بأرقام نسخ مختلفة للغاية لإثبات جودة وقوة التقنية في الكشف عن الميزات الحرجة لـ PPIs. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوصيف مؤشر أسعار المنتجين - بدءا من المنشآت البكتيرية المتحولة حتى التحليل النهائي باستخدام أدوات وضعت مؤخرا توفير إمكانيات التصور المتقدمة لتفسير مباشر للبيانات FLIM-FRET المعقدة.

تظهر وظائف التوزيع التراكمي التجريبي (ecdf) لمدى عمر الفلوريسنس مقاسة لسلالات بكتيرية مختلفة في الشكل 8. إذا حدث فريت، يتم تحويل ecdfs نحو حياة أقصر عمر (الشكل 8A, 8B). لاحظ أنه عندما ينتج عن تفاعل البروتينين مسافة طويلة بين الفلوروفوريس، لا يمكن أن يحدث فر...

Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

نحن نصف هنا بروتوكولاً لتوصيف التفاعلات البروتينية بين بروتينين مختلفين للغاية في Pseudomonas aeruginosa باستخدام قياسات FLIM-FRET. ويشمل البروتوكول المنشآت سلالة البكتيريا، وشل البكتيريا، والتصوير، وما بعد التصوير الروتينية تحليل البيانات.

قياسات FLIM-FRET للتفاعلات البروتينية البروتينية في البكتيريا الحية.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET هي تقنية قوية تجعل من الممكن تأكيد التفاعلات البروتينية البروتينية المشتبه بها أو المتوقعة. في هذا البروتوكول، نقدم طريقة لتحليل البيانات في حالات معينة من الكميات غير المتوازنة من المتبرع والمقبِل. فيلم-فريت قادرة على تقديم معلومات حول التفاعلات البروتين البروتينية مباشرة في الخلايا الحية.من المهم التحقق من تفاعلات البروتينات الشخصية في البيئة الخلوية الأصلية، خاصة عندما يتم التعبير عن البروتين الفلوري في المستوى المحلي. تبدأ من قبل تزايد P.aeruginosa, E.coli TOP10, والبكتيريا مساعد الإشريكية القولونية كل في خمسة ملليلتر من LB دون مضاد حيوي في 30 درجة مئوية في حين تهتز بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وقياس الكثافة البصرية للثقافات وخلط كمية متساوية من P.aeruginosa، E.coli TOP10 ومساعد الإشريكية القولونية في 1.5 ملليلتر microtube.الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 9، 300 مرة G إلى بيليه البكتيريا، ثم التخلص من supernatant وإعادة بناء بيليه في 50 ميكرولترات من LB. لوحة بقعة من الخليط على أجار LB محمّاة مسبقاً واحتضانه لمدة خمس ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، كشط البقعة مع حلقة تطعيم عقيمة وإعادة تعليقها في ملليلتر واحد من LB. لوحة 100 ميكرولترات من هذا التعليق البكتيري على LB أجار تحتوي على 10 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول و 30 ميكروغرام لكل ملليلتر gentamycin واحتضان يومين في 37 درجة مئوية للقضاء على E.coli TOP10 و E.coli البكتيريا مساعد. resuspend مستعمرة واحدة في ملليلتر واحد من LB واحتضانها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز المداري لمدة أربع ساعات، ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة ثلاث دقائق في 9، 300 مرة G والتخلص من 950 ميكرولترات من supernatant.Resuspend بيليه في 50 ميكرولترات من LB وعزل الخليط على LB agar التي تحتوي على السكروز ولا كلوريد الصوديوم. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. بقعة المستعمرات المعزولة على LB أجار و LB أجار التي تحتوي على 15 ملليغرام لكل ملليلتر gentamycin من أجل التحقق من حساسية gentamycin.ضع شريحة زجاجية مجهرية على سطح أفقي مستو وارتب انزلاقين زجاجيين تعلوهما طبقتان من الشريط اللاصق حوله. Pipette 70 قطرات ميكرولتر من 1٪ ذاب agarose على الشريحة الزجاجية ووضع شريحة رابعة على القمة لتسطيح قطرات agarose. اضغط لأسفل بلطف لمدة دقيقة تقريبا.خلع الشريحة العليا وإسقاط حوالي ثلاثة ميكرولترات من البكتيريا في ثلاثة إلى أربعة بقع في مواقع مختلفة على وسادة agarose. تغطية لوحة agarose مع غطاء الزجاج المجهرية وإصلاحه مع البارافين الذائب لختم على الشريحة الزجاجية بدءا من الزوايا الأربع. ضع الشريحة المجهرية على المسرح مع غطاء مواجهة الهدف.بدوره برج مكعب مرشح لتحديد مكعب eGFP وفتح مصراع مصباح الفلوريس، ثم إرسال ضوء الفلوريسين نحو العدسة من المجهر. تركيز الهدف على البكتيريا باستخدام مقبض المجهر. حدد منطقة ذات أهمية في العينة باستخدام عصا التحكم التي تتحكم في المرحلة الآلية.إرسال مسار الانبعاثات fluorescence مرة أخرى نحو كاشف، ثم العودة إلى الوراء برج مكعب مرشح لتحديد مكعب dichroic ليزر 930 نانومتر وتعيين قوة الليزر إلى 20 مللي واط. تعيين حجم المنطقة ذات الأهمية إلى 30 ميكرومتر الذي يضبط الجهد تشغيل المرايا galvo ويحدد نطاق تحركاتهم. قم بتشغيل جهاز الكشف وابدأ في مسح العينة.اختر مجال الرؤية للتصوير عن طريق نقل المرحلة بدقة من واجهة الكمبيوتر. ويمكن القيام بذلك على الإعداد عن طريق تحريك الصليب على الصورة في برنامج التحكم المجهر الذي سيحدد مركز جديد للصورة والضغط على مرحلة التحرك. وينبغي أن يحتوي حقل جيد من الرؤية للحصول على 10 إلى 30 البكتيريا غير متحركة كل في التركيز.إذا كانت مهتمة في استخراج خلايا واحدة الفيلم-فريت البيانات, ضمان أن البكتيريا هي بشكل جيد فردي. افتح برنامج التصوير وتحقق من أن معدل عدد الفوتونات ليس مرتفعًا جدًا لتجنب تأثير تراكم يمكن أن يؤثر على القياسات مدى الحياة. إذا لزم الأمر، خفض كثافة الليزر للحفاظ على معدل العد الفوتون منخفضة.ضبط معلمات الامتلاك بما في ذلك وقت جمع الاكتساب. اضغط على زر البدء وانتظر حتى تكتمل عملية الاستحواذ. لتحليل البيانات، افتح RStudio ثم أنشئ مشروعًا جديدًا.إنشاء مجلد جديد في مجلد المشروع الرئيسي وتسمية البيانات، ثم نقل جميع ملفات سؤال التحليل في هذا المجلد. فتح ملف برنامج نصي جديد أو البرنامج النصي التكميلي flim_analysis.r. تثبيت حزمة FlimDiagRam مخصصة لتحليل البيانات الفيلم والدعوة إلى حزمة في مساحة العمل.تظهر هنا وظائف التوزيع التراكمي التجريبي لمدى حياة الفلوريسنس التي تم قياسها للسلالات البكتيرية المختلفة. في حالة حدوث FRET، يتم تحويل الدالات نحو عمر أقصر. من المهم أن نلاحظ أن فريت لا يمكن أن يحدث عندما يؤدي تفاعل اثنين من البروتينات في مسافة طويلة بين الفلوروورين، والتي لا يمكن تمييزها عن عدم وجود تفاعل.لذلك، قد يكون من الضروري تسمية البروتينات في مواقع مختلفة لتعظيم فرص التحقيق في التفاعل. بسبب الفرق الكبير في تعبيرات البروتين بين PvdA و PvdL ، فإن نفس المجمع لا يؤدي إلى بيانات FILM-FRET مماثلة. التراخيوميتريات غير المتوازنة تؤدي إلى اختلافات في مساهمة الحرة بالمقارنة مع البروتينات المقيدة التي تحمل علامة المتبرع في توزيع الفلوريسنس المسجلة مدى الحياة.يمكن استخدام رسم الرسم التخطيطي لتوفير معلومات هامة حول قياس الرصين. في PvdA-eGFP mCherry-PvdL متحولة، كمية PvdA المسمى المانحة هي أعلى بكثير من كمية mCherry-PvdL. بين جميع الجهات المانحة الموجودة في العينة، إلا عدد قليل منهم يتفاعل مع PvdL.واحد تاو قيمة واحدة تركزت في حوالي 2.3 نانو ثانية تشير إلى أن كل المانحين PvdA-eGFP يمكن نقل فقط مع واحد mCherry-PvdL قبول. عندما يتم عكس التسمية، من المتوقع أن تتفاعل معظم بروتينات eGFP-PvdL مع PvdA-mCherry التي تؤكدها قيم ألفا واحدة أعلى. أصبحت قيم تاو واحدة أكثر توزيعًا مما يشير إلى أن بروتينات PvdA المتعددة قد ترتبط ببروتين PvdL واحد.أصبح إعداد FLIM متاحًا في عدد متزايد من مرافق التصوير. عينات التصوير في فيلم-فريت ليست أكثر تعقيدا من التصوير في المجهر الفيديو.

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...