Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

Vi anerkender Dr. Ludovic Richert for hans værdifulde hjælp til FLIM dataindsamling og for den tekniske vedligeholdelse og udvikling af FLIM setup. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN finansieres af Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). YM er taknemmelig for Institut Universitaire de France (IUF) for støtte og give ekstra tid til at være dedikeret til forskning. IJS og JG anerkender Instituttet for Levering af Narkotika i Strasbourg for dets finansielle støtte.

1. Plasmid konstruktion
<ol><li>Forstærkes af to PCR (PCR1 og 3) DNA-sekvenserne (brug genomisk DNA af P. aeruginosa PAO1) af de 700 basispar opstrøms og nedstrøms for de regioner, der svarer til indsætningsstedet i P. aeruginosa-genomet med high-fidelity DNA polymerase. Tilføj begrænsningswebsteder til primere i blåt og grønt, og tilføj en overlappende sekvens med mCherry til primere i rødt (Figur 2).<ol>
<li>For PvdA mærket på C-endestation med eGFP, forstæ...

FLIM-FRET giver nogle vigtige fordele i forhold til intensitetsbaseret FRET-billedbehandling. Fluorescens levetid er en iboende parameter af fluorophore. Som følge heraf er det ikke afhængig af lokale koncentrationer af fluorofre hverken af intensiteten af lys excitation. Fluorescens levetid er desuden også dårligt påvirket af foto-blegning. Det er især interessant at dokumentere PPI i celler, hvor lokale proteiner koncentrationer kan være meget heterogene i hele de subcellulære rum eller regioner. FLIM-FRET er o...

Proteinproteininteraktioner (PPI) styrer forskellige nøgleprocesser i celler1. PPI'ernes roller varierer afhængigt af proteinsammensætning, tilhørsforholdsfunktioner og placeringer i celler2. PPI kan undersøges ved hjælp af forskellige teknikker3. For eksempel er co-immunoprecipitation en forholdsvis enkel, robust og billig teknik, der almindeligvis anvendes værktøj til at identificere eller bekræfte PPI. Det kan dog være en udfordring at studere PPI, når de interagerende proteiner har lave udtryksniveauer, eller når interaktionerne kun er forbigående eller kun relevante i specifikke miljøer. Undersøgelse af PPI mellem de forskellige enzymer på pyoverdinvejen i P. aeruginosa kræver,at undertrykkelsen af den generelle jern-co-factored repressor Fur er lettet over at tillade ekspression af alle proteiner fra pyoverdinvejen, der skal udtrykkes i celle4,5,6. Denne fælles forordning for alle proteiner i vejen resulterer i rettidige udtryk i cellen forventes at fremme deres interaktioner. Mangfoldigheden med hensyn til størrelse, natur, udtryksniveauer og antallet af proteiner i denne metaboliske vej gør det vanskeligt at studere i rekonstituerede systemer6. Udforskning af PPI i deres cellulære miljø er derfor afgørende for yderligere at forstå de biologiske funktioner af proteiner i deres oprindelige sammenhæng.
Kun få metoder, herunder fluorescens, gør det muligt at udforske PPI i levende celler7. Blandt de forskellige fluorescens parametre, der kan måles, fluorescens levetid (dvs. den gennemsnitlige tid en fluorophore forbliver i sin ophidset tilstand, før udsender en foton) er sandsynligvis en af de mest interessante parametre at udforske i levende celler. Fluorescenslevetid for en fluorfil er meget følsom over for omgivelserne, og FLIM kan derfor give kemiske eller fysiske oplysninger om fluorophoreomgivelserne 8. Dette omfatter tilstedeværelsen af Förster resonans energioverførsel (FRET), der kan forekomme i nærværelse af en "acceptor" af fluorescens placeret i en kort afstand af en fluorescens "donor". Energioverførsel resulterer i en betydelig afkortning af donorfluorescenslevetid(figur 1A),hvilket gør Fluorescens Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) til en effektiv tilgang til at udforske proteinproteininteraktioner direkte i levende celler. FLIM kan desuden give rumlige oplysninger om , hvor interaktionerne finder sted icellerne 7,8. Denne tilgang er yderst stærk til at undersøge PPI i situationer, hvor mærkning med fluorophores af de to interagerende partnere er mulig.
For at FRET kan forekomme - skal der være kritiske forhold på afstanden mellem to fluorophores8,9. De to fluorophores bør ikke være fjernt fra hinanden med mere end 10 nm. Derfor skal der udvises forsigtighed ved udformningen af FLIM-FRET-forsøg for at sikre, at donoren og acceptoren af fluorescens har en chance for at blive placeret tæt på hinanden i det interagerende kompleks. Selv om dette kan synes begrænsende, er det faktisk en sand fordel, da frets afstande sikrer, at to mærkede proteiner, der gennemgår FRET, skal interagere fysisk (figur 1A). Vanskelighederne med at få klare svar om PPI i colocalization eksperimenter (to colocalized proteiner kan ikke nødvendigvis interagere) er derfor ikke et problem ved hjælp af FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Figur 1: FLIM-FRET-analyseprincip . Hver pixel i det flerdimensionale FLIM-FRET-billede indeholder oplysninger om fluorescens henfald registreret på dette bestemte sted (#counts = antal registrerede fotoner i kanalen t). (A)Den klassiske repræsentation af FLIM billedet er normalt en falsk farve levetid kodet 2D-billede (venstre). Et fald i donorens gennemsnitlige fluorescenslevetid - som det ses af en ændring i farveskalaen - kan observeres i nærværelse af FRET og er informativ om tilstedeværelsen af PPI i dette rumlige område. B)Overlapningmellem donoremissionsspektret og acceptorabsorptionsspektret er nødvendig for, at FRET kan forekomme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Et andet krav til FRET er, at donorens emissionsspektrum og acceptorens absorptionsspektre skal overlappe8 (figur 1B). Den fluorescens excitation af donor bør være på bølgelængder, der bidrager meget lidt til den direkte fluorescens excitation af acceptoren. Ikke alle kombinationer af fluorophores er mulige, og vi anbefaler desuden at fortrinsvis bruge donorer med monoexponential fluorescens henfalder for at lette FLIM-FRET fortolkninger10. Flere par fluorescens proteiner opfylder disse krav, herunder den populære eGFP-mCherry par11 (for en gennemgang af paletten af tilgængelige fluorescerende protein FRET par se12,13).
FLIM-FRET gør det muligt at måle fluorescenslevetids henfaldet for en FRET-donor ved hver pixel i et FLIM-billede (Figur 1A). Der er to vigtige teknikker til at bestemme fluorescens levetid, der adskiller sig i erhvervelse og analyse: frekvens-domæne (FD)14 og tid-domæne (TD). TD FLIM er mere udbredt og udføres ved hjælp af en pulserende belysning kombineret med forskellige mulige detektionskonfigurationer, herunder gating metoder15, streak kamera16 eller tid-korreleret enkelt foton tælling (TCSPC) teknikker8. For både FD- og TD-teknikker måles fluorescenslevetid ikke direkte, men kræver en analyse af de målte data for at vurdere levetiden eller resultaterne af interaktioner. For TCSPC-teknikker er den mest udbredte analyse afhængig af at montere henfald med enkelte eller multiponentielle funktioner ved hjælp af mindst firkantede iterative re-convolutions, der minimerer den vægtede sum af resterne.
Endelig kan FLIM-FRET udføres både ved hjælp af enkelt foton eller multiphoton excitationer. Den seneste har flere fordele som at reducere autofluorescens og fotoskader ud af brændplanet. Multiphoton excitationer tillader også en længere excitation dybde, hvis der arbejdes i tykke 3D-prøver8. Tværtimod, enkelt foton excitation er normalt mere effektiv som de to-foton absorption tværsnit af fluorescerende proteiner er begrænset17.
Her foreslår vi en protokol for FLIM-FRET-målinger af PPI i levende P. aeruginosa i det særlige tilfælde af to interagerende proteiner (PvdA og PvdL) udtrykt med meget forskellige antal kopier for at demonstrere kvaliteten og robustheden af teknikken til at afsløre kritiske egenskaber ved PPI. PvdA og PvdL proteiner er involveret i pyoverdine biosyntese. PvdA er en L-ornithin N5-oxygenase og syntetiserer L-N5-formyl-N5-hydroxyornithin fra L-ornithin ved hydroxyylation (PvdA) og formylation (PvdF)18. PvdL er et ikke-ribosomal peptidsyntese (NRPS) enzym, der består af fire moduler. Det første modul katalyserer acylation af myristisk syre. Det andet modul katalyser aktivering af L-Glu og dens kondens til myristiske-coA. Derefter kondenserer det tredje modul en L-Tyr aminosyre, der derefter isomerized i D-Tyr. Endelig det fjerde modul binder en L-Dab (Diaminobutyric syre) aminosyre til at danne acylated tripeptid L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL er således ansvarlig for syntesen af de tre første aminosyrer i pyoverdinprækursoren. Samspillet mellem PvdA-protein og PvdL er overraskende, da PvdL, i modsætning til PvdI og PvdJ, ikke har et modul, der er specifikt for L-N5-formyl-N5-hydroxyornithin. Denne interaktion tyder på , at alle de enzymer , der er ansvarlige for pyoverdine-prækursorbiosyntesen , er arrangeret i store forbigående og dynamiske multienzymatiskekomplekser 19,20.
I denne rapport forklarer vi i detaljer, hvordan man konstruerer de bakteriestammer, der udtrykker de to interagerende eGFP og mCherry mærkede proteiner. Vi beskriver også prøveforberedelse og betingelser for effektiv FLIM-FRET cellebilleddannelse. Endelig foreslår vi en trin-for-trin tutorial til billedanalyse, herunder et nyligt udviklet værktøj, der giver avancerede visualiseringsmuligheder for enkel fortolkning af komplekse FLIM-FRET data. Med denne betænkning vil vi gerne overbevise ikke blot eventyrlystne, men de fleste biologer om, at FRET-FLIM er en tilgængelig og kraftfuld teknik, der er i stand til at behandle deres spørgsmål om PPI direkte i det oprindelige cellemiljø.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

Proteinproteininteraktioner (PPI) styrer forskellige nøgleprocesser i celler. Fluorescens livslang billeddannelse mikroskopi (FLIM) kombineret med Förster resonans energioverførsel (FRET) giver præcise oplysninger om PPI i levende celler. FLIM-FRET er afhængig af at måle fluorescens levetid henfald af en FRET donor på hver pixel i FLIM billedet, giver kvantitative og præcise oplysninger om PPI og deres rumlige cellulære organisationer. Vi foreslår her en detaljeret protokol for FLIM-FRET målinger, som vi har anvendt til at overvåge PPI i levende Pseudomonas aeruginosa i det særlige tilfælde af to interagerende proteiner udtrykt med meget forskellige kopinumre for at demonstrere kvaliteten og robustheden af teknikken til at afsløre kritiske træk ved PPI. Denne protokol beskriver i detaljer alle de nødvendige trin til PPI karakterisering - startende fra bakteriel mutant konstruktioner op til den endelige analyse ved hjælp af nyligt udviklede værktøjer, der giver avancerede visualisering muligheder for en enkel fortolkning af komplekse FLIM-FRET data.

Empiriske kumulative fordelingsfunktioner (ecdf) af fluorescenslevetiderne målt for de forskellige bakteriestammer er vist i figur 8. Hvis FRET opstår, flyttes ecdf'erne mod de kortere levetid (figur 8A,8B). Bemærk, at når samspillet mellem de to proteiner resulterer i en lang afstand mellem de to fluorophores, ingen FRET kan forekomme (Figur 8C). Denne situation kan ikke adskilles fra den manglende interaktion ...

Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Vi beskriver her en protokol til at karakterisere protein-protein interaktioner mellem to meget forskelligt udtrykt proteiner i levende Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af FLIM-FRET målinger. Protokollen omfatter bakterier stamme konstruktioner, bakterier immobilisering, billeddannelse og post-imaging dataanalyse rutiner.

FLIM-FRET Målinger af protein-protein interaktioner i levende bakterier.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET er en kraftfuld teknik, der gør det muligt at bekræfte formodede eller forudsagte proteinproteininteraktioner. I denne protokol præsenterer vi en måde at analysere data i bestemte tilfælde af ubalanceret donor- og acceptormængder. FILM-FRET er i stand til at give oplysninger om protein-protein interaktioner direkte i levende celler.Det er vigtigt at undersøge personlige protein interaktioner i indfødte cellulære miljø, især når fluorescerende protein udtrykkes i det endogene niveau. Begynd med at dyrke P.aeruginosa, E.coli TOP10, og E.coli hjælperbakterier hver i fem milliliter LB uden antibiotika ved 30 grader Celsius, mens du ryster natten over. På den næste dag måles kulturens optiske tæthed, og der blandes en tilsvarende mængde P.aeruginosa, E.coli TOP10 og E.coli-hjælper i et 1,5 millilitermikrorør.Centrifuge røret i fem minutter ved 9, 300 gange G til pellet bakterierne, derefter kassere supernatant og resuspend pellet i 50 mikroliter lb. Plade en plet af blandingen på forvarmet LB agar og inkubere det i fem timer ved 37 grader Celsius. Efter inkubationen skrabes stedet med en steril inokuleringsløkke og opspjæles igen i en milliliter LB. Plade 100 mikroliter af denne bakterielle suspension på LB agar indeholder 10 mikrogram pr. milliliter chloramphenicol og 30 mikrogram pr. milliliter gentamycin og inkuberes to dage ved 37 grader Celsius for at eliminere E.coli TOP10 og E.coli hjælperbakterier. Resuspend en koloni i en milliliter LB og inkubere det ved 37 grader Celsius med orbital omrystning i fire timer, derefter centrifuge røret i tre minutter ved 9, 300 gange G og kassér 950 mikroliter af supernatant.Pelletsuspendrer pelletet op til 50 mikroliter LB, og blandingen på LB agar indeholdende saccharose og ingen natriumchlorid. Inkuber pladen natten over ved 30 grader Celsius. Spot isolerede kolonier på LB agar og LB agar indeholder 15 mg/ milliliter gentamycin for at kontrollere for gentamycin følsomhed.Placer et mikroskop glas dias på en flad vandret overflade og arrangere to glas dias toppet med to lag af tape omkring det. Pipette en 70 mikroliter dråbe på 1% smeltet agarose på glasset dias og placere en fjerde dias på toppen for at flade agarose dråbe. Tryk forsigtigt ned i ca. et minut.Tag den øverste slide og slip omkring tre mikroliter af bakterier i tre til fire steder på forskellige steder på agarose pad. Dæk agarosepuden med en mikroskopisk glasdæksel og fastgør den med smeltet paraffin for at forsegle den på glasrutsjebanen startende med de fire hjørner. Anbring mikroskopglasset på scenen med dækslæbet vendt mod målet.Drej filterterningen tårn for at vælge eGFP terningen og åbne fluorescenslampe lukkeren, derefter sende fluorescens lys mod okularet af mikroskopet. Fokuser målet på bakterierne ved hjælp af mikroskopknappen. Vælg et område af interesse i prøven ved hjælp af joysticket, der styrer den motoriserede fase.Send fluorescensemissionsvejen tilbage mod detektoren, og vend derefter filterterningtårnet tilbage for at vælge den dichroic terning til 930 nanometerlaseren og indstil lasereffekten til 20 milliwatt. Indstil størrelsen af den region af interesse til 30 mikrometer, der justerer spændingen opererer galvo spejle og definerer omfanget af deres bevægelser. Tænd for detektoren, og begynd at scanne prøven.Vælg synsfeltet til billedbehandling ved at flytte scenen fra computergrænsefladen fint. Dette kan gøres på opsætningen ved at flytte korset på billedet i mikroskopet kontrol software, som vil definere det nye centrum af billedet og trykke på flytte fase. Et godt synsfelt for erhvervelse bør indeholde 10 til 30 immobile bakterier alle i fokus.Hvis interesseret i at udvinde enkelt celler FILM-FRET data, sikre, at bakterierne er godt individualiseret. Åbn billedbehandlingssoftwaren, og kontroller, at antallet af fotontal ikke er for høj til at undgå en pileupeffekt, der kan påvirke levetidsmålingerne. Hvis det er nødvendigt, skal du sænke laserintensiteten for at holde fotontallet lavt.Juster anskaffelsesparametre, herunder anskaffelsesindsamlingstiden. Tryk på startknappen, og vent på, at anskaffelsen fuldføres. Hvis du vil analysere dataene, skal du åbne RStudio og oprette et nyt projekt.Opret en ny mappe i hovedprojektmappen, og navnd den om data, og flyt derefter alle analyse spørg filer til denne mappe. Åbn en ny scriptfil eller det supplerende flim_analysis.r. Installer den dedikerede FlimDiagRam-pakke til filmdataanalyse, og ring til pakken i arbejdsområdet.Empiriske kumulative fordelingsfunktioner i fluorescenslevtelev levetider målt for de forskellige bakteriestammer er vist her. Hvis FRET opstår, flyttes funktionerne mod de kortere levede levetider. Det er vigtigt at bemærke, at FRET ikke kan forekomme, når samspillet mellem de to proteiner resulterer i en lang afstand mellem de to flurophores, som ikke kan skelnes fra fraværet af interaktion.Derfor kan det være nødvendigt at mærke proteinerne på forskellige positioner for at maksimere chancerne for at undersøge interaktionen. På grund af den store forskel i proteinudtryk mellem PvdA og PvdL resulterer det samme kompleks ikke i lignende FILM-FRET-data. Ubalanceret stoichiometries fører til forskelle i bidraget fra den frie i forhold til de bundne donormærkede proteiner i den registrerede fluorescenslevefordeling.Diagramplottet kan bruges til at give kritiske oplysninger om støkiometrien. I PvdA-eGFP mCherry-PvdL-mutant er mængden af donormærket PvdA meget højere end mængden af mCherry-PvdL. Blandt alle donorer til stede i prøven, kun nogle få af dem interagerer med PvdL.Den enkelte tau en værdi centreret på ca 2,3 nanosekunder tyder på, at hver PvdA-eGFP donor kun kan overføre med en mCherry-PvdL acceptor. Når mærkningen er vendt, de fleste af de eGFP-PvdL proteiner forventes at interagere med PvdA-mCherry, som bekræftes af den højere alpha en værdier. Den tau en værdier blev mere fordelt tyder på, at flere PvdA proteiner kan binde sig til en enkelt PvdL protein.FLIM-opsætningen bliver tilgængelig i et stigende antal billedbehandlingsfaciliteter. Billedprøver i en FILM-FRET er ikke mere kompliceret end billedbehandling i videomikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaktioner visualiseret ved bimolekylær Fluorescens komplementering i tobaksprotoplaster og blade

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersøgelse af protein-protein interaktioner i levende celler Brug Bioluminescens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-opløsning Imaging af Cytokinetic Z Ring i levende bakterier Brug af Fast 3D-strukturerede Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering High-density funktionelt protein Microarrays at Detect protein-protein interaktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtidsmålinger membranprotein: Receptor Interactions Brug overfladeplasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...