Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
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Riconosciamo il Dott. Ludovic Richert per la sua preziosa assistenza nell'acquisizione dei dati FLIM e per la manutenzione tecnica e lo sviluppo della configurazione FLIM. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN è finanziato dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM è grata all'Institut Universitaire de France (IUF) per il sostegno e per aver fornito ulteriore tempo per dedicarsi alla ricerca. IJS e JG riconoscono l'Istituto per la distribuzione di droga di Strasburgo per il suo sostegno finanziario.

1. Costruzione plasmide
<ol><li>Amplificare da due PCR (PCR1 e 3) le sequenze di DNA (utilizzare il DNA genomico di P. aeruginosa PAO1) delle 700 coppie di basi a monte e a valle delle regioni corrispondenti al sito di inserimento nel genoma di P. aeruginosa con DNA polimerasi ad alta fedeltà. Aggiungere siti di restrizione ai primer in blu e verde e aggiungere una sequenza sovrapposta con mCherry ai primer in rosso (Figura 2).<ol>
<li>Per il PvdA etichettato al C-termin...

FLIM-FRET offre alcuni vantaggi chiave rispetto all'imaging FRET basato sull'intensità. La durata della fluorescenza è un parametro intrinseco del fluoroforo. Di conseguenza, non dipende dalle concentrazioni locali di fluorofori né dall'intensità dell'eccitazione della luce. La durata della fluorescenza è inoltre scarsamente influenzata dallo sbiancamento fotografico. È particolarmente interessante evidenza di IPP in cellule in cui le concentrazioni di proteine locali possono essere altamente eterogenee in tutti i ...

Le interazioni proteina-proteina (IPP) controllano vari processi chiave nellecellule 1. I ruoli degli IPP differiscono in base alla composizione proteica, alle funzioni di affinità e alle posizioni nellecellule 2. Gli IPP possono essere studiati attraverso diverse tecniche3. Ad esempio, la co-immunoprecipitazione è una tecnica relativamente semplice, robusta ed economica comunemente utilizzata per identificare o confermare gli IPP. Tuttavia, studiare gli IPP può essere impegnativo quando le proteine interagenti hanno bassi livelli di espressione o quando le interazioni sono transitori o rilevanti solo in ambienti specifici. Lo studio degli IPP che si verificano tra i diversi enzimi della via della pioverdina in P. aeruginosa richiede che la repressione del repressore generale del ferro-co-fattorizzato Fur sia alleviata per consentire l'espressione di tutte le proteine della via della pioverdina da esprimere nellacella 4,5,6. Questa regolazione comune per tutte le proteine del percorso si traduce in espressioni tempestive nella cellula che dovrebbero promuovere le loro interazioni. La diversità in termini di dimensioni, natura, livelli di espressione e il numero di proteine di questa via metabolica rendono difficile lo studio nei sistemi ricostituiti6. Esplorare gli IPP nel loro ambiente cellulare è quindi fondamentale per comprendere ulteriormente le funzioni biologiche delle proteine nel loro contesto nativo.
Solo pochi metodi, tra cui la fluorescenza, consentono di esplorare gli IPP nelle celluleviventi 7. Tra i diversi parametri di fluorescenza che possono essere misurati, la durata della fluorescenza (cioè il tempo medio in cui un fluorofore rimane nel suo stato eccitato prima di emettere un fotone) è probabilmente uno dei parametri più interessanti da esplorare nelle cellule viventi. La durata della fluorescenza di un fluorofo è altamente sensibile al suo ambiente e FLIM può quindi fornire informazioni chimiche o fisiche sull'ambiente del fluoroforo8. Ciò include la presenza di trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) che può verificarsi in presenza di un "accettore" di fluorescenza situato a breve distanza da un "donatore" di fluorescenza. Il trasferimento di energia si traduce in un significativo accorciamento della durata della fluorescenza del donatore (Figura 1A), rendendo la microscopia a vita a fluorescenza (FLIM) un potente approccio per esplorare le interazioni proteina-proteina direttamente nelle cellule vive. FLIM può inoltre fornire informazioni spaziali su dove si svolgono le interazioni nelle celle7,8. Questo approccio è estremamente potente per indagare gli IPP in situazioni in cui è possibile l'etichettatura con fluorofori dei due partner interagenti.
Affinché fret si verifichi - sono necessarie condizioni critiche sulla distanza tra due fluorofori8,9. I due fluorofori non dovrebbero essere distanti l'uno dall'altro di oltre 10 nm. Pertanto, è necessario prestare attenzione quando si progettano esperimenti FLIM-FRET per garantire che il donatore e l'accettore di fluorescenza abbiano la possibilità di trovarsi uno vicino all'altro nel complesso interagente. Anche se questo può sembrare vincolante, è in realtà un vero vantaggio in quanto la dipendenza dalla distanza del FRET garantisce che due proteine marcate sottoposte a FRET mentono interagiscano fisicamente (Figura 1A). Le difficoltà di ottenere risposte chiare sul PPI negli esperimenti di colocalizzazione (due proteine colocalizzate potrebbero non interagire necessariamente) non sono quindi un problema usando FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Figura 1: Principio di analisi FLIM-FRET. Ogni pixel dell'immagine multidimensionale FLIM-FRET contiene informazioni sul decadimento della fluorescenza registrato in questa particolare posizione (#counts = numero di fotoni rilevati nel canale t). (A) La rappresentazione classica dell'immagine FLIM è in genere un'immagine 2D codificata a vita di falsi colori (a sinistra). Una diminuzione della durata media della fluorescenza del donatore - come visto da un cambiamento nella scala dei colori - può essere osservata in presenza di FRET ed è informativa sulla presenza di IPP in quest'area spaziale. (B) La sovrapposizione tra lo spettro di emissione del donatore e lo spettro di assorbimento dell'accettore è necessaria affinché il FRET si verifichi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Un secondo requisito per il FRET è che lo spettro di emissione del donatore e gli spettri di assorbimento dell'accettore si sovrapponganoa 8 (figura 1B). L'eccitazione a fluorescenza del donatore dovrebbe essere a lunghezze d'onda che contribuiscono molto poco all'eccitazione diretta della fluorescenza dell'accettore. Non tutte le combinazioni di fluorofori sono possibili e si consiglia inoltre di utilizzare preferenzialmente donatori con decadimenti di fluorescenza monoesonziali per facilitare le interpretazioni FLIM-FRET10. Diverse coppie di proteine a fluorescenza soddisfano questi requisiti, tra cui la popolare coppia eGFP-mCherry11 (per una recensione sulla tavolozza delle coppie fret proteiche fluorescenti disponibilivedi 12,13).
FLIM-FRET consente di misurare il decadimento a vita della fluorescenza di un donatore FRET ad ogni pixel di un'immagine FLIM (Figura 1A). Esistono due tecniche principali per determinare la durata della fluorescenza che differiscono nell'acquisizione e nell'analisi: il dominio della frequenza (FD)14 e il dominio del tempo (TD). TD FLIM è più diffuso e viene eseguito utilizzando un'illuminazione pulsata combinata con diverse possibili configurazioni di rilevamento tra cui i metodi di gating15,la fotocamera astrisce 16 o le tecniche di conteggio dei fotoni singoli correlate al tempo (TCSPC)8. Sia per le tecniche FD che TD, la durata della fluorescenza non viene misurata direttamente, ma richiede un'analisi dei dati misurati per stimare la durata o la presenza di interazioni. Per le tecniche TCSPC, l'analisi più utilizzata si basa sull'adattamento dei decadimenti con funzioni singole o multie esponenziali utilizzando ri-convoluzioni iterativi meno quadrate che riducono al minimo la somma ponderata dei residui.
Infine, FLIM-FRET può essere eseguito sia utilizzando singole eccitazioni fotone o multifotoni. Gli ultimi hanno diversi vantaggi come ridurre l'autofluorescenza e il danno fotografico dal piano focale. Le eccitazioni multifotono consentono anche una maggiore profondità di eccitazione se si lavora in campioni 3D spessi8. Al contrario, l'eccitazione di fotoni singoli è solitamente più efficiente in quanto le sezioni trasversali di assorbimento dei due fotoni delle proteine fluorescentisono limitate 17.
Qui proponiamo un protocollo per le misurazioni FLIM-FRET degli IPP in P. aeruginosa vivo nel caso particolare di due proteine interagenti (PvdA e PvdL) espresse con un numero molto diverso di copie per dimostrare la qualità e la robustezza della tecnica nel rivelare le caratteristiche critiche degli IPP. Le proteine PvdA e PvdL sono coinvolte nella biosintesi della pioverdina. La PvdA è una L-ornitina N5-ossigenasi e sintetizza l'L-N5-formil-N5-idrossiornitina da L-ornitina per idrossilazione (PvdA) e formilazione (PvdF)18. Il PvdL è un enzima di sintesi peptidica non ribosomiale (NRPS) composto da quattro moduli. Il primo modulo catalizza l'acilazione dell'acido mirmistico. Il secondo modulo catalizza l'attivazione di L-Glu e la sua condensa alla myristic-coA. Quindi, il terzo modulo condensa un amminoacido L-Tyr che viene poi isomerizzato in D-Tyr. Infine, il quarto modulo lega un amminoacido L-Dab (acido diaminobutirrico) per formare il tripeptide acilato L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL è quindi responsabile della sintesi dei tre primi amminoacidi del precursore della pioverdina. L'interazione della proteina PvdA con PvdL è sorprendente in quanto PvdL, al contrario di PvdI e PvdJ, non porta un modulo specifico per l'L-N5-formil-N5-idrossiornitina. Questa interazione suggerisce che tutti gli enzimi responsabili della biosintesi precursore della pioverdina sono disposti in grandi complessi multienzimatici transitori e dinamici19,20.
In questa relazione spieghiamo in dettaglio come costruire i ceppi batterici esprimendo nativamente le due proteine interagenti etichettate eGFP e mCherry. Descriviamo anche la preparazione del campione e le condizioni per un'efficiente imaging cellulare FLIM-FRET. Infine, proponiamo un tutorial passo-passo per l'analisi delle immagini, incluso uno strumento sviluppato di recente che offre possibilità di visualizzazione avanzate per un'interpretazione diretta di dati FLIM-FRET complessi. Con questa relazione, vorremmo convincere non solo i più avventurosi, ma anche la maggior parte dei biologi che FRET-FLIM è una tecnica accessibile e potente in grado di affrontare le loro domande sugli IPP direttamente nell'ambiente cellulare nativo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

Le interazioni proteina-proteina (IPP) controllano vari processi chiave nelle cellule. La microscopia a vita a fluorescenza (FLIM) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) fornisce informazioni accurate sugli IPP nelle cellule vive. FLIM-FRET si basa sulla misurazione del decadimento a vita della fluorescenza di un donatore FRET ad ogni pixel dell'immagine FLIM, fornendo informazioni quantitative e accurate sugli IPP e sulle loro organizzazioni cellulari spaziali. Proponiamo qui un protocollo dettagliato per le misurazioni FLIM-FRET che abbiamo applicato per monitorare gli IPP nelle Pseudomonas aeruginosa vive nel caso particolare di due proteine interagenti espresse con numeri di copia molto diversi per dimostrare la qualità e la robustezza della tecnica nel rivelare le caratteristiche critiche degli IPP. Questo protocollo descrive in dettaglio tutti i passaggi necessari per la caratterizzazione PPI, a partire dalle costruzioni mutanti batteriche fino all'analisi finale utilizzando strumenti sviluppati di recente che forniscono possibilità di visualizzazione avanzate per un'interpretazione diretta di dati FLIM-FRET complessi.

Le funzioni di distribuzione cumulativa empirica (ecdf) delle durate di fluorescenza misurate per i diversi ceppi batterici sono mostrate nella figura 8. Se si verifica fret, gli ecdf vengono spostati verso le vite di durata più breve (Figura 8A,8B). Si noti che quando l'interazione delle due proteine si traduce in una lunga distanza tra i due fluorofori, non può verificarsi alcun FRET (Figura 8C). Questa situazio...

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FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Descriviamo qui un protocollo per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra due proteine espresse in modo molto diverso nelle Pseudomonas aeruginosa vive usando misurazioni FLIM-FRET. Il protocollo include costruzioni di ceppo batterico, immobilizzazione dei batteri, routine di analisi dei dati di imaging e post-imaging.

Misurazioni FLIM-FRET delle interazioni proteina-proteina nei batteri vivi.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET è una tecnica potente che consente di confermare le interazioni proteina-proteina sospette o previste. In questo protocollo, presentiamo un modo per analizzare i dati in particolari casi di quantità di donatori e accettori squilibrati. FILM-FRET è in grado di fornire informazioni sulle interazioni proteina-proteina direttamente nelle cellule vive.È importante indagare le interazioni personali-proteiche nell'ambiente cellulare nativo, in particolare quando le proteine fluorescenti sono espresse nel livello endogeno. Inizia coltivando batteri aiutanti P.aeruginosa, E.coli TOP10 ed E.coli ciascuno in cinque millilitri di LB senza antibiotico a 30 gradi Celsius mentre tremano durante la notte. Il giorno successivo, misurare la densità ottica delle colture e mescolare una quantità uguale di P.aeruginosa, E.coli TOP10 ed E.coli aiutante in un microtubo da 1,5 millilitri.Centrifugare il tubo per cinque minuti a 9,300 volte G per pellettare i batteri, quindi scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 50 microlitri di LB. Placcare un punto della miscela sull'agar LB preriscaldato e incubarlo per cinque ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, raschiare il punto con un ciclo di inoculazione sterile e rimescolarlo in un millilitro di LB. Piastra 100 microlitri di questa sospensione batterica su agar LB contenente 10 microgrammi per millilitro cloramfenicolo e 30 microgrammi per millilitro gentamicina e incubare due giorni a 37 gradi Celsius per eliminare I batteri aiutanti E.coli TOP10 ed E.coli. Rimescolare una colonia in un millilitro di LB e incubarla a 37 gradi Celsius con scuotimento orbitale per quattro ore, quindi centrifugare il tubo per tre minuti a 9,300 volte G e scartare 950 microlitri di supernatante.Resuspend il pellet in 50 microlitri di LB e isolare la miscela su agar LB contenente saccarosio e nessun cloruro di sodio. Incubare il piatto durante la notte a 30 gradi Celsius. Individuare colonie isolate su agar LB e agar LB contenenti 15 milligrammi per millilitro gentamicina al fine di verificare la sensibilità alla gentamicina.Posizionare uno scivolo di vetro al microscopio su una superficie orizzontale piatta e disporre due vetrini sormontati da due strati di nastro adesivo intorno ad esso. Pipettare una goccia da 70 microliter di agarosio fuso all'1% sullo scivolo di vetro e posizionare una quarta diapositiva sopra per appiattire la goccia di agarosio. Premere delicatamente verso il basso per circa un minuto.Togliere lo scivolo superiore e far cadere circa tre microlitri di batteri in tre o quattro punti in diverse posizioni sul tampone di agarosio. Coprire il tampone di agarosio con un coverslip in vetro al microscopio e fissarlo con paraffina fusa per sigillare sullo scivolo di vetro a partire dai quattro angoli. Posizionare la diapositiva di microscopia sul palco con la coverlip rivolta verso l'obiettivo.Ruotare la torretta del cubo del filtro per selezionare il cubo eGFP e aprire l'otturatore della lampada a fluorescenza, quindi inviare la luce di fluorescenza verso l'oculare del microscopio. Focalizzare l'obiettivo sui batteri utilizzando la manopola del microscopio. Selezionare un'area di interesse nel campione utilizzando il joystick che controlla lo stadio motorizzato.Inviare il percorso di emissione di fluorescenza verso il rivelatore, quindi tornare indietro la torretta del cubo del filtro per selezionare il cubo dicroico per il laser da 930 nanometri e impostare la potenza del laser su 20 milliwatt. Impostare la dimensione della regione di interesse su 30 micrometri che regola la tensione che opera gli specchi galvo e definisce la gamma dei loro movimenti. Accendere il rilevatore e iniziare la scansione del campione.Scegliere il campo visivo per l'imaging spostando finemente il palco dall'interfaccia del computer. Questo può essere fatto sulla configurazione spostando la croce sull'immagine nel software di controllo del microscopio che definirà il nuovo centro dell'immagine e premendo lo stadio di spostamento. Un buon campo visivo per l'acquisizione dovrebbe contenere da 10 a 30 batteri immobili tutti a fuoco.Se sei interessato all'estrazione di dati FILM-FRET a singole cellule, assicurati che i batteri siano ben individualizzati. Aprire il software di imaging e verificare che il tasso di conteggio dei fotoni non sia troppo elevato per evitare un effetto di accumulo che può influenzare le misurazioni a vita. Se necessario, abbassare l'intensità del laser per mantenere bassa la velocità di conteggio dei fotoni.Regolare i parametri di acquisizione, incluso il tempo di raccolta dell'acquisizione. Premere il pulsante start e attendere il completamento dell'acquisizione. Per analizzare i dati, aprire RStudio e creare un nuovo progetto.Creare una nuova cartella nella cartella principale del progetto e denominarla dati, quindi spostare tutti i file ask dell'analisi in questa cartella. Aprire un nuovo file script o uno script aggiuntivo flim_analysis.r. Installare il pacchetto FlimDiagRam dedicato per l'analisi dei dati del film e chiamare il pacchetto nell'area di lavoro.Qui sono mostrate le funzioni di distribuzione cumulativa empirica delle durate di fluorescenza misurate per i diversi ceppi batterici. Se si verifica FRET, le funzioni vengono spostate verso le vite più brevi. È importante notare che fret non può verificarsi quando l'interazione delle due proteine si traduce in una lunga distanza tra i due flurofori, che non può essere distinta dall'assenza di interazione.Pertanto, potrebbe essere necessario etichettare le proteine in diverse posizioni per massimizzare le possibilità di sondare l'interazione. A causa della grande differenza nelle espressioni proteiche tra PvdA e PvdL, lo stesso complesso non si traducono in dati FILM-FRET simili. Le stechiometrie sbilanciate portano a differenze nel contributo del libero rispetto alle proteine associate etichettate dal donatore nella distribuzione della durata di fluorescenza registrata.Il diagramma grafico può essere utilizzato per fornire informazioni critiche sulla stechiometria. Nel mutante PvdA-eGFP mCherry-PvdL, la quantità di PvdA etichettato come donatore è molto più alta della quantità di mCherry-PvdL. Tra tutti i donatori presenti nel campione, solo alcuni di loro interagiscono con PvdL.Il singolo valore tau uno centrato a circa 2,3 nanosecondi suggerisce che ogni donatore di PvdA-eGFP può essere trasferito solo con un accettore mCherry-PvdL. Quando l'etichettatura è invertita, si prevede che la maggior parte delle proteine eGFP-PvdL interagisca con PvdA-mCherry, il che è confermato dai valori alfa uno più alti. I valori di tau one divennero più distribuiti suggerendo che più proteine PvdA possono legarsi ad una singola proteina PvdL.La configurazione FLIM sta diventando disponibile in un numero crescente di strutture di imaging. L'imaging di campioni in un FILM-FRET non è più complicato dell'imaging in microscopia video.

Research

JoVE Journal

Biology

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