Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

Vi anerkjenner Dr Ludovic Richert for hans verdifulle hjelp til FLIM datainnsamling og for teknisk vedlikehold og utvikling av FLIM-oppsettet. Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN er finansiert av Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM er takknemlig til Institut Universitaire de France (IUF) for støtte og gi ekstra tid til å være dedikert til forskning. IJS og JG anerkjenner Institute on Drug Delivery of Strasbourg for sin økonomiske støtte.

1. Plasmid konstruksjon
<ol><li>Forsterke med to PCR (PCR1 og 3) DNA-sekvenser (bruk genomisk DNA av P. aeruginosa PAO1) av 700 basepar oppstrøms og nedstrøms av regionene som tilsvarer innsettingsstedet i P. aeruginosa genom med high-fidelity DNA polymerase. Legg til begrensningsområder i primere i blått og grønt, og legg til en overlappende sekvens med mCherry til primere i rødt (figur 2).<ol>
<li>For PvdA merket ved C-endestasjonen med eGFP, forsterk 700 bp-regio...

FLIM-FRET gir noen viktige fordeler fremfor intensitetsbasert FRET-bildebehandling. Fluorescens levetid er en iboende parameter av fluorofor. Som en konsekvens er det ikke avhengig av lokale konsentrasjoner av fluoroforer heller ikke på intensiteten av lysutseelse. Fluorescensens levetid påvirkes også dårlig av fotobleking. Det er spesielt interessant å vise PPI-er i celler der lokale proteinkonsentrasjoner kan være svært heterogene i de subcellulære rommene eller regionene. FLIM-FRET er også interessant i alle ...

Protein-protein interaksjoner (PPI) kontrollere ulike viktige prosesser i cellene1. Rollene til PPIer varierer basert på proteinsammensetning, affinitetsfunksjoner og steder i cellene2. PPIer kan undersøkes via ulike teknikker3. For eksempel er co-immunoprecipitation en relativt enkel, robust og billig teknikk som vanligvis brukes verktøy for å identifisere eller bekrefte PPIer. Det kan imidlertid være utfordrende å studere PPIer når de interagerende proteinene har lave uttrykksnivåer eller når interaksjonene er forbigående eller relevante bare i bestemte miljøer. Studere PPI forekommer mellom de forskjellige enzymer av pyoverdin banen i P. aeruginosa krever at undertrykkelse av den generelle jern-co-factored repressor Fur er lettet for å tillate uttrykk for alle proteiner av pyoverdin banen som skal uttrykkes i cellen4,5,6. Denne felles reguleringen for alle proteinene i banen resulterer i be stunduttrykk i cellen som forventes å fremme deres interaksjoner. Mangfoldet i størrelse, natur, uttrykksnivåer og antall proteiner av denne metabolske veien gjør det vanskelig for studier i rekonstituerte systemer6. Å utforske PPIer i deres cellulære miljø er derfor avgjørende for å forstå proteinenes biologiske funksjoner i sin opprinnelige sammenheng.
Bare få metoder, inkludert fluorescens tillater å utforske PPIer i levende celler7. Blant de forskjellige fluorescensparametrene som kan måles, er fluorescensens levetid (det vil si den gjennomsnittlige tiden en fluorofor forblir i sin opphissede tilstand før du sender ut et foton) sannsynligvis en av de mest interessante parametrene å utforske i levende celler. Fluorescensens levetid for en fluorofor er svært følsom for miljøet, og FLIM kan derfor gi kjemisk eller fysisk informasjon om fluoroforomgivelsene8. Dette inkluderer tilstedeværelsen av Förster resonans energioverføring (FRET) som kan oppstå i nærvær av en "acceptor" av fluorescens som ligger i kort avstand av en fluorescens "donor". Energioverføring resulterer i betydelig forkortelse av donorfluorescens levetid (figur 1A), noe som gjør Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) til en kraftig tilnærming til å utforske protein-proteininteraksjoner direkte i levende celler. FLIM kan i tillegg gi romlig informasjon om hvor interaksjonene finner sted i cellene7,8. Denne tilnærmingen er ekstremt kraftig for å undersøke PPIer i situasjoner der merking med fluoroforer av de to samhandlende partnerne er mulig.
For fret å skje - kritiske forhold på avstanden mellom to fluoroforer er nødvendig8,9. De to fluoroforene bør ikke være fjernt fra hverandre med mer enn 10 nm. Derfor må det tas advarsler når du utformer FLIM-FRET-eksperimenter for å sikre at donoren og akseptoren av fluorescens har en sjanse til å bli plassert nær hverandre i det interagerende komplekset. Selv om dette kan virke begrensende, er det faktisk en sann fordel som avstandsavhengighet av FRET sikrer at to merkede proteiner som gjennomgår FRET må fysisk samhandle (Figur 1A). Vanskelighetene med å få klare svar om PPI i colocalization eksperimenter (to colocalized proteiner kan ikke nødvendigvis samhandle) er derfor ikke et problem ved hjelp av FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Figur 1: FLIM-FRET analyse prinsipp. Hver piksel av FLIM-FRET flerdimensjonalt bilde inneholder informasjon om fluorescensforfall registrert på dette stedet (#counts = antall oppdagede fotoner i kanalen t). (A)Den klassiske representasjonen av FLIM-bildet er vanligvis en falsk fargelevetid kodet 2D-bilde (venstre). En reduksjon i donorens gjennomsnittlige fluorescens levetid - sett av en endring i fargeskalaen - kan observeres i nærvær av FRET og er informativ om tilstedeværelsen av PPI-er i dette romlige området. (B)Overlapping mellom donorutslippsspekteret og akseptorabsorpsjonsspekteret er nødvendig for at FRET skal forekomme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Et annet krav til FRET er at donorens utslippsspektrum og absorpsjonsspektraet til akseptoren skal overlappe8 (figur 1B). Fluorescens eksitasjon av donor bør være på bølgelengder som bidrar svært lite til direkte fluorescens eksitasjon av acceptor. Ikke alle kombinasjoner av fluoroforer er mulige, og vi anbefaler i tillegg å fortrinnsvis bruke donorer med monoexponential fluorescens forfall for å lette FLIM-FRETtolkninger 10. Flere par fluorescensproteiner oppfyller disse kravene, inkludert det populære eGFP-mCherry-paret11 (for en gjennomgang av paletten av tilgjengelig fluorescerende protein FRET-par se12,13).
FLIM-FRET gjør det mulig å måle fluorescensens levetidsforfall av en FRET-donor ved hver piksel av et FLIM-bilde (figur 1A). Det finnes to hovedteknikker for å bestemme fluorescensens levetid som varierer i oppkjøp og analyse: frekvensdomene (FD)14 og tidsdomenet (TD). TD FLIM er mer utbredt og utføres ved hjelp av en pulserende belysning kombinert med ulike mulige deteksjonskonfigurasjoner, inkludert gating metoder15,strekkamera16 eller tidsrelrelert enkelt foton telling (TCSPC)teknikker 8. For både FD- og TD-teknikker måles ikke fluorescenslevetid direkte, men krever en analyse av de målte dataene for å estimere levetiden(e) eller tilstedeværelsen av interaksjoner. For TCSPC-teknikker er den mest brukte analysen avhengig av å montere forfallene med enkle eller multi eksponentielle funksjoner ved hjelp av minst firkantede iterative re-convolutions som minimerer den vektede summen av rester.
Til slutt kan FLIM-FRET utføres både ved hjelp av enkelt foton eller multiphoton eksitater. Den siste har flere fordeler som å redusere autofluorescence og fotoskader ut av fokalplanet. Multiphoton excitations tillater også en lengre eksitasjonsdybde hvis du arbeider i tykke 3D-prøver8. Tvert imot er enkelt foton eksitasjon vanligvis mer effektiv som to-foton absorpsjon tverrsnitt av fluorescerende proteiner er begrenset17.
Her foreslår vi en protokoll for FLIM-FRET målinger av PPI-er i live P. aeruginosa i det spesielle tilfellet av to interagerende proteiner (PvdA og PvdL) uttrykt med svært forskjellige antall kopier for å demonstrere kvaliteten og robustheten til teknikken ved å avsløre kritiske egenskaper ved PPIer. PvdA- og PvdL-proteiner er involvert i pyoverdinbiosyntese. PvdA er en L-ornitin N5-oksygenase og syntetiserer L-N5-formyl-N5-hydroksyornithine fra L-ornitin ved hydroksylering (PvdA) og formylering (PvdF)18. PvdL er et ikke-ribosomalt peptidsyntese (NRPS) enzym bestående av fire moduler. Den første modulen katalyserer akylering av myristisk syre. Den andre modulen katalyserer aktiveringen av L-Glu og dens kondens til myristic-coA. Deretter kondenserer den tredje modulen en L-Tyr aminosyre som deretter isomerized i D-Tyr. Til slutt binder den fjerde modulen en L-Dab (Diaminobutyric acid) aminosyre for å danne den acylaterte tripeptidE L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL er dermed ansvarlig for syntesen av de tre første aminosyrene i pyoverdinforløperen. Samspillet mellom PvdA-protein med PvdL er overraskende da PvdL, tvert imot PvdI og PvdJ, ikke har en modul som er spesifikk for L-N5-formyl-N5-hydroksyornithine. Denne interaksjonen tyder på at alle enzymene som er ansvarlige for pyoverdinforløperbiosyntesen, er ordnet i store forbigående og dynamiske multi-enzymatiske komplekser19,20.
I denne rapporten forklarer vi i detalj hvordan man konstruerer bakteriestammene som uttrykker opprinnelig de to interagerende eGFP- og mCherry-merkede proteinene. Vi beskriver også prøveforberedelse og betingelser for effektiv FLIM-FRET-celleavbildning. Til slutt foreslår vi en trinnvis veiledning for bildeanalyse, inkludert et nylig utviklet verktøy som gir avanserte visualiseringsmuligheter for enkel tolkning av komplekse FLIM-FRET-data. Med denne rapporten ønsker vi å overbevise ikke bare eventyrlystne, men de fleste biologer om at FRET-FLIM er en tilgjengelig og kraftig teknikk som kan løse sine spørsmål om PPI direkte i det innfødte mobilmiljøet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

Protein-protein interaksjoner (PPI) kontrollere ulike viktige prosesser i celler. Fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) kombinert med Förster resonans energioverføring (FRET) gir nøyaktig informasjon om PPIer i levende celler. FLIM-FRET er avhengig av å måle fluorescensens levetidsforfall av en FRET-donor ved hver piksel av FLIM-bildet, og gir kvantitativ og nøyaktig informasjon om PPIer og deres romlige cellulære organisasjoner. Vi foreslår her en detaljert protokoll for FLIM-FRET målinger som vi brukte til å overvåke PPIer i live Pseudomonas aeruginosa i det spesielle tilfellet av to interagerende proteiner uttrykt med svært forskjellige kopinumre for å demonstrere kvaliteten og robustheten til teknikken ved å avsløre kritiske trekk ved PPIer. Denne protokollen beskriver i detalj alle nødvendige trinn for PPI-karakterisering - fra bakterielle mutantkonstruksjoner opp til den endelige analysen ved hjelp av nylig utviklede verktøy som gir avanserte visualiseringsmuligheter for en enkel tolkning av komplekse FLIM-FRET-data.

Empiriske kumulative fordelingsfunksjoner (ecdf) av fluorescenslevetid målt for de forskjellige bakteriestammene er vist i figur 8. Hvis FRET oppstår, flyttes ecdfs mot kortere levetid (figur 8A,8B). Legg merke til at når samspillet mellom de to proteinene resulterer i lang avstand mellom de to fluoroforene, kan det ikke oppstå fret (figur 8C). Denne situasjonen kan ikke skilles fra fraværet av samhandling mell...

Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Vi beskriver her en protokoll for å karakterisere protein-protein interaksjoner mellom to svært forskjellige uttrykte proteiner i live Pseudomonas aeruginosa ved hjelp av FLIM-FRET målinger. Protokollen omfatter bakterier stammer konstruksjoner, bakterier immobilisering, imaging og post-imaging dataanalyse rutiner.

FLIM-FRET Målinger av protein-protein interaksjoner i levende bakterier.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET er en kraftig teknikk som gjør det mulig å bekrefte mistenkte eller spådde protein-protein interaksjoner. I denne protokollen presenterer vi en måte å analysere data på i spesielle tilfeller av ubalansert donor og akseptormengder. FILM-FRET er i stand til å gi informasjon om protein-protein interaksjoner direkte i levende celler.Det er viktig å undersøke personlig-protein interaksjoner i innfødtcellulært miljø, spesielt når fluorescerende protein uttrykkes i endogene nivå. Begynn med å dyrke P.aeruginosa, E.coli TOP10 og E.coli hjelper bakterier hver i fem milliliter lb uten antibiotika på 30 grader Celsius mens risting over natten. På neste dag måler du kulturenes optiske tetthet og blander like mange P.aeruginosa, E.coli TOP10 og E.coli-hjelper i et 1,5 milliliter mikrorør.Sentrifuger røret i fem minutter ved 9, 300 ganger G for å pellet bakteriene, og kast deretter supernatanten og resuspend pellet i 50 mikroliter lb. Plate en flekk av blandingen på forvarmet LB agar og inkubere den i fem timer ved 37 grader Celsius. Etter inkubasjonen skraper du flekken med en steril inokulasjonssløyfe og bruker det på nytt i ett milliliter LB. Plate 100 mikroliter av denne bakterielle suspensjonen på LB agar som inneholder 10 mikrogram per milliliter kloramfenikol og 30 mikrogram per milliliter gentamycin og inkubere to dager ved 37 grader Celsius for å eliminere E.coli TOP10 og E.coli-hjelpebakterier. Resuspend en koloni i en milliliter LB og inkubere den ved 37 grader Celsius med orbital risting i fire timer, og sentrifuger røret i tre minutter ved 9, 300 ganger G og kast 950 mikroliter overnatur.Resuspend pellet i 50 mikroliter lb og isolere blandingen på LB agar som inneholder sukrose og ingen natriumklorid. Inkuber platen over natten ved 30 grader Celsius. Spot isolerte kolonier på LB agar og LB agar som inneholder 15 milligram per milliliter gentamycin for å se etter gentamycin følsomhet.Plasser et mikroskopglasssklie på en flat horisontal overflate og ordne to glasssklier toppet med to lag med tape rundt den. Pipette en 70 mikroliter dråpe på 1% smeltet oppsto på glasssklien og plasser et fjerde lysbilde på toppen for å flate agarosedråpen. Trykk forsiktig ned i omtrent et minutt.Ta av det øvre lysbildet og slipp omtrent tre mikroliter bakterier på tre til fire steder på forskjellige steder på agaroseputen. Dekk agarose pad med en mikroskopi glass coverlip og fest den med smeltet parafin for å forsegle den på glasssklie starter med de fire hjørnene. Plasser mikroskopisklien på scenen med dekkglasset vendt mot målet.Vri filterkuertårnet for å velge eGFP-kuben og åpne lysrørslukkeren, og send deretter fluorescenslyset mot mikroskopets okular. Fokuser målet på bakteriene ved hjelp av mikroskopknappen. Velg et interesseområde i prøven ved hjelp av joysticken som styrer det motoriserte stadiet.Send fluorescensutslippsbanen tilbake mot detektoren, og skru deretter filterkuertårnet tilbake for å velge den dichroic kuben for 930 nanometer laser og sett laserkraften til 20 milliwatt. Sett størrelsen på interesseområdet til 30 mikrometer som justerer spenningen som opererer galvo speil og definerer omfanget av sine bevegelser. Slå på detektoren og begynn å skanne prøven.Velg synsfeltet for bildebehandling ved å flytte fasen fint fra datagrensesnittet. Dette kan gjøres på oppsettet ved å flytte korset på bildet i mikroskopkontrollprogramvaren som vil definere det nye midten av bildet og trykke flyttestadiet. Et godt synsfelt for oppkjøp bør inneholde 10 til 30 immobile bakterier i fokus.Hvis du er interessert i å trekke ut enkeltceller FILM-FRET-data, må du sørge for at bakteriene er godt individualisert. Åpne bildeprogramvaren og kontroller at antallet foton ikke er for høy for å unngå en haugeeffekt som kan påvirke livstidsmålinger. Senk om nødvendig laserintensiteten for å holde fotontallet lav.Juster anskaffelsesparametere, inkludert anskaffelsesinnsamlingstiden. Trykk på startknappen og vent til oppkjøpet er fullført. Hvis du vil analysere dataene, åpner du RStudio og oppretter et nytt prosjekt.Opprett en ny mappe i hovedprosjektmappen og gi dem navn til data, og flytt deretter alle analyse spør filer til denne mappen. Åpne en ny skriptfil eller tilleggsskriptet flim_analysis.r. Installer den dedikerte FlimDiagRam-pakken for filmdataanalyse og ring pakken i arbeidsområdet.Empiriske kumulative fordelingsfunksjoner av fluorescenslevetid målt for de forskjellige bakteriestammene er vist her. Hvis FRET oppstår, flyttes funksjonene mot kortere levetid. Det er viktig å merke seg at FRET ikke kan oppstå når samspillet mellom de to proteinene resulterer i lang avstand mellom de to flurophorene, som ikke kan skilles fra fravær av interaksjon.Derfor kan det være nødvendig å merke proteinene i forskjellige posisjoner for å maksimere sjansene for å sondere samspillet. På grunn av den store forskjellen i proteinuttrykk mellom PvdA og PvdL, resulterer det samme komplekset ikke i lignende FILM-FRET-data. Ubalanserte stoichiometrier fører til forskjeller i bidraget til det frie sammenlignet med de bundne donormerkede proteinene i den registrerte fluorescensens levetidsfordeling.Diagramplottet kan brukes til å gi kritisk informasjon om stoichiometry. I PvdA-eGFP mCherry-PvdL-mutanten er mengden donormerket PvdA mye høyere enn mengden mCherry-PvdL. Blant alle givere til stede i prøven, er bare noen få av dem i samspill med PvdL.Den enkle tau en verdi sentrert på ca 2,3 nanosekunder tyder på at hver PvdA-eGFP donor kan bare overføre med en mCherry-PvdL acceptor. Når merkingen reverseres, forventes de fleste eGFP-PvdL-proteinene å samhandle med PvdA-mCherry som bekreftes av de høyere alfa en-verdiene. Tau en verdier ble mer distribuert tyder på at flere PvdA proteiner kan binde seg til en enkelt PvdL protein.FLIM-oppsettet blir tilgjengelig i et økende antall bildebehandlingsfasiliteter. Bildeprøver i en FILM-FRET er ikke mer komplisert enn avbildning i videomikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaksjoner visualisert ved bimolekylær fluorescens complementation i Tobakk Protoplaster og blader

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Gransker Protein-protein interaksjoner i levende celler ved hjelp Bioluminesens Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-Resolution Imaging av Cytokinetic Z Ring i levende bakterier Bruke Fast 3D-Strukturert Illumination Mikros (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering Høy tetthet funksjonelt protein Mikromatriser å oppdage Protein-protein interaksjoner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Real Time Målinger av Membrane Protein: Receptor Interaksjoner Bruke Surface plasmonresonans (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...