Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

Vi erkänner Dr Ludovic Richert för hans värdefulla stöd på FLIM datainsamling och för tekniskt underhåll och utveckling av FLIM setup. Detta arbete finansierades genom bidrag från Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN finansieras av Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM är tacksam mot Institut Universitaire de France (IUF) för stöd och ge ytterligare tid att ägnas åt forskning. IJS och JG erkänner institutet för narkotikaleveranser i Strasbourg för dess ekonomiska stöd.

1. Plasmid konstruktion
<ol><li>Förstärka genom två PCR (PCR1 och 3) DNA-sekvenserna (använd genomiskt DNA av P. aeruginosa PAO1) av de 700 basparen uppströms och nedströms av de regioner som motsvarar insättningsstället i P. aeruginosa genom med high-fidelity DNA-polymeras. Lägg till begränsningsplatser till primers i blått och grönt och lägg till en överlappande sekvens med mCherry till grundställen i rött (Bild 2).<ol>
<li>För PvdA märkt vid C-ändsta...

FLIM-FRET erbjuder några viktiga fördelar jämfört med intensitetsbaserad FRET-avbildning. Fluorescens livstid är en inneboende parameter av fluorophore. Som en följd är det inte beroende av lokala koncentrationer av fluoroforer varken på intensiteten av ljuset excitation. Fluorescenslivslängden påverkas dessutom också dåligt av foto-blekning. Det är särskilt intressant att bevisa protonpumpshämtton i celler där lokala proteiner koncentrationer kan vara mycket heterogena i hela de subcellulära fack eller ...

Protein-protein interaktioner (protonpumpsh:er) styr olika viktiga processer i cellerna1. Rollerna för protonpumpshämmmare skiljer sig åt baserat på proteinsammansättning, affinitetsfunktioner och platser icellerna 2. Protonpumpshämmmare kan undersökas via olika tekniker3. Till exempel är co-immunoprecipitation en relativt enkel, robust och billig teknik som vanligen används verktyg för att identifiera eller bekräfta protonpumpshämmningar. Att studera protonpumpshämnare kan dock vara utmanande när de interagerande proteinerna har låga uttrycksnivåer eller när interaktionerna är övergående eller endast relevanta i specifika miljöer. Studera protonpumpshämmningar som förekommer mellan de olika enzymer av pyoverdin vägen i P. aeruginosa kräver att förtrycket av den allmänna järn-co-factored förtryckande Fur är lättad att låta uttrycket av alla proteiner i pyoverdin väg som skall uttryckas icellen 4,5,6. Denna gemensamma förordning för alla proteiner i vägen resulterar i tid uttryck i cellen förväntas främja deras interaktioner. Mångfalden i term av storlek, natur, uttrycksnivåer och antalet proteiner av denna metaboliska väg gör det svårt att studera i rekonstituerade system6. Utforska protonpumpshämmmare i deras cellulära miljö är därför avgörande för att ytterligare förstå de biologiska funktionerna hos proteiner i sitt hemland sammanhang.
Endast få metoder inklusive fluorescens tillåter att utforska protonpumpshämns i levande celler7. Bland de olika fluorescens parametrar som kan mätas, fluorescens livstid (dvs. den genomsnittliga tiden en fluorophore kvar i sitt upphetsade tillstånd innan avger en foton) är sannolikt en av de mest intressanta parametrar att utforska i levande celler. Fluorescenslivslängden för en fluorofor är mycket känslig för sin miljö och FLIM kan därför ge kemisk eller fysikalisk information angående den fluorophoreomgivningen 8. Detta inkluderar förekomsten av Förster resonans energiöverföring (FRET) som kan uppstå i närvaro av en "acceptor" av fluorescens som ligger på ett kort avstånd av en fluorescens "givare". Energiöverföring resulterar i betydande förkortning av givaren fluorescens livstid (Figur 1A), vilket gör Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) en kraftfull metod för att utforska protein-protein interaktioner direkt i levande celler. FLIM kan dessutom ge rumslig information om var interaktionerna sker i cellerna7,8. Detta tillvägagångssätt är extremt kraftfullt för att undersöka protonpumpshämnare i situationer där märkning med fluoroforer hos de två samverkande partnerna är möjlig.
För FRET att inträffa - kritiska förhållanden på avståndet mellan två fluoroforer krävs8,9. De två fluoroforerna bör inte vara långt från varandra med mer än 10 nm. Därför måste försiktighetsåtgärder tas vid utformningen av FLIM-FRET-experiment för att säkerställa att givaren och accepteraren av fluorescens har en chans att vara placerade nära varandra i det samverkande komplexet. Även om detta kan tyckas begränsande, är det i själva verket en sann fördel som avstånd-beroende av FRET säkerställer att två märkta proteiner som genomgår FRET måste fysiskt interagera (Figur 1A). Svårigheterna att få tydliga svar om PPI i colocalization experiment (två colocalized proteiner kanske inte nödvändigtvis interagerar) är därför inte ett problem med hjälp av FLIM-FRET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Figur 1: FLIM-FRET-analysprincip. Varje pixel av den flerdimensionella bilden FLIM-FRET innehåller information om fluorescensförfall som spelats in på just denna plats (#counts = antal upptäckta fotoner i kanalen t). (A) Den klassiska representationen av FLIM bilden är oftast en falsk-färg livstid kodad 2D bild (vänster). En minskning av givarens genomsnittliga fluorescenslivs livstid - vilket ses av en förändring i färgskalan - kan observeras i närvaro av FRET och är informativ om förekomsten av protonpumpshämmningar i detta rumsliga område. (B) Överlappning mellan givaremissionsspektrumet och acceptorabsorspekten är nödvändig för att FRET ska kunna inträffa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Ett andra krav för FRET är att givarens emissionsspektrum och acceptorns absorptionsspektra ska överlappa8 (figur 1B). Fluorescensutexcitation av givaren bör vara på våglängder som bidrar mycket lite till direkt fluorescens excitation av acceptorn. Inte alla kombinationer av fluoroforer är möjliga och vi rekommenderar dessutom att företrädesvis använda givare med monoexponentiell fluorescens sönderfall för att underlätta FLIM-FRET tolkningar10. Flera par av fluorescens proteiner uppfyller dessa krav, inklusive den populära eGFP-mCherry par11 (för en översyn på paletten av tillgängliga fluorescerande protein FRET par se12,13).
FLIM-FRET gör det möjligt att mäta fluorescens livstid förfall av en FRET givare vid varje pixel av en FLIM bild (Figur 1A). Det finns två stora tekniker för att bestämma fluorescens livstid som skiljer sig i förvärv och analys: frekvens-domän (FD)14 och time-domän (TD). TD FLIM är mer utbredd och utförs med hjälp av en pulsad belysning i kombination med olika möjliga detekteringskonfigurationer inklusive gating methods15, streak camera16 eller time-correlated single photon counting (TCSPC)techniques 8. För både FD- och TD-tekniker mäts inte fluorescenslivslängden direkt utan kräver en analys av de uppmätta data för att uppskatta livstid(arna) eller förekomsten av interaktioner. För TCSPC-tekniker bygger den mest använda analysen på att försära sönderfallen med enstaka eller multi exponentiella funktioner med hjälp av minst kvadratiska iterativa återkonvolutioner som minimerar den viktade summan av rester.
Slutligen kan FLIM-FRET utföras både med hjälp av enstaka foton- eller multifotonexciteringar. Den senaste har flera fördelar som att minska autofluorescens och photodamage ur fokalplanet. Multiphoton excitations tillåt också en längre excitation djup om arbetar i tjocka 3D-prover8. Tvärtom är enda foton excitation oftast effektivare som två-foton absorption tvärsnitt av fluorescerande proteiner är begränsade17.
Här föreslår vi ett protokoll för FLIM-FRET mätningar av protonpumpshämmningar i levande P. aeruginosa i det särskilda fallet med två interagerande proteiner (PvdA och PvdL) uttryckt med mycket olika antal kopior för att visa kvalitet och robusthet av tekniken vid avslöjande kritiska funktioner i protonpumpshämtton. PvdA och PvdL proteiner är involverade i pyoverdine biosyntes. PvdA är en L-ornitin N5-oxygenas och syntetiserar L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine från L-ornitin genom hydroxylation (PvdA) och formylation (PvdF)18. PvdL är ett icke-ribosomal peptid syntes (NRPS) enzym som består av fyra moduler. Den första modulen katalyserar acylation av myristic syra. Den andra modulen katalyserar aktiveringen av L-Glu och dess kondens till den myristiska-coA. Sedan kondenserar den tredje modulen en L-Tyr aminosyra som sedan är omeriseras i D-Tyr. Slutligen binder den fjärde modulen en L-Dab (Diaminobutyric acid) aminosyra för att bilda den acylated tripeptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL är därmed ansvarig för syntesen av de tre första aminosyrorna av pyoverdin föregångaren. Interaktionen mellan PvdA-protein med PvdL är förvånande eftersom PvdL, tvärtom mot PvdI och PvdJ, inte bär en modul som är specifik för L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine. Denna interaktion tyder på att alla enzymer som ansvarar för pyoverdin föregångaren biosyntesen är ordnade i stora övergående och dynamiska multi-enzymatiska komplex19,20.
I denna rapport förklarar vi i detalj hur man konstruerar bakteriestammarna uttrycker natively de två interagerande eGFP och mCherry märkta proteiner. Vi beskriver också provberedning och förutsättningar för effektiv FLIM-FRET-cellavbildning. Slutligen föreslår vi en steg-för-steg handledning för bildanalys inklusive ett nyligen utvecklat verktyg som ger avancerade visualiseringsmöjligheter för okomplicerad tolkning av komplexa FLIM-FRET-data. Med detta betänkande vill vi övertyga inte bara äventyrliga utan de flesta biologer att FRET-FLIM är en tillgänglig och kraftfull teknik kunna ta itu med sina frågor om protonpumpshämmmare direkt i den inhemska cellulära miljön.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

Protein-protein interaktioner (protonpumpshämns) styr olika viktiga processer i celler. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) kombinerat med Förster resonansenergiöverföring (FRET) ger korrekt information om protonpumpshämmningar i levande celler. FLIM-FRET bygger på att mäta fluorescens livstid förfall av en FRET givare vid varje pixel av FLIM bilden, vilket ger kvantitativ och korrekt information om protonpumpshämmmare och deras rumsliga cellulära organisationer. Vi föreslår här ett detaljerat protokoll för FLIM-FRET mätningar som vi tillämpas för att övervaka protonpumpshämma i levande Pseudomonas aeruginosa i det särskilda fallet med två interagerande proteiner uttryckt med mycket olika kopia nummer för att visa kvalitet och robusthet av tekniken vid avslöjande kritiska funktioner av protonpumpshämmare. Detta protokoll beskriver i detalj alla nödvändiga steg för PPI-karakterisering - med utgångspunkt från bakteriell mutant konstruktioner upp till den slutliga analysen med hjälp av nyligen utvecklade verktyg som ger avancerade möjligheter visualisering för en enkel tolkning av komplexa FLIM-FRET data.

Empiriska kumulativa fördelningsfunktioner (ecdf) av fluorescenslivstiderna mätt för de olika bakteriestammarna visas i figur 8. Om FRET förekommer förskjuts ecdfsna mot de kortare livslängderna (figur 8A,8B). Observera att när interaktionen mellan de två proteinerna resulterar i ett långt avstånd mellan de två fluoroforerna, kan ingen FRET förekomma (Bild 8C). Denna situation kan inte särskiljas från ...

Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Vi beskriver här ett protokoll för att karakterisera protein-protein interaktioner mellan två mycket-olika uttryckta proteiner i levande Pseudomonas aeruginosa med hjälp av FLIM-FRET mätningar. Protokollet omfattar bakteriestamkonstruktioner, bakteriemmobilisering, bildbehandling och dataanalysrutiner efter avbildning.

FLIM-FRET Mätningar av Protein-Protein interaktioner i levande bakterier.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET är en kraftfull teknik som gör det möjligt att bekräfta misstänkta eller förutsagda protein-protein interaktioner. I detta protokoll presenterar vi ett sätt att analysera data i särskilda fall av obalanserad givare och acceptor kvantiteter. FILM-FRET kan ge information om protein-protein interaktioner direkt i levande celler.Det är viktigt att undersöka personliga-protein interaktioner i infödda cellulära miljö, i synnerhet när fluorescerande protein uttrycks i den endogena nivån. Börja med att odla P.aeruginosa, E.coli TOP10, och E.coli hjälpare bakterier var och en i fem milliliter LB utan antibiotika vid 30 grader Celsius medan skakar över natten. På nästa dag, mäta den optiska densiteten av kulturerna och blanda en lika stor mängd P.aeruginosa, E.coli TOP10 och E.coli hjälpare i en 1,5 milliliter microtube.Centrifugera röret i fem minuter vid 9, 300 gånger G för att pelleta bakterierna, sedan kasta supernatant och återanvända pelleten i 50 mikroliter lb. Platta en plats av blandningen på förvärmda LB agar och inkubera den i fem timmar vid 37 grader Celsius. Efter inkubationen skrapar du platsen med en steril inokuleringsslinga och återanvänder den i en milliliter lb. Plate 100 mikroliter av denna bakteriell suspension på LB agar som innehåller 10 mikrogram per milliliter kloramfenikol och 30 mikrogram per milliliter gentamycin och inkubera två dagar vid 37 grader Celsius för att eliminera E.coli TOP10 och E.coli helper bakterier. Resuspend en koloni i en milliliter lb och inkubera den på 37 grader Celsius med omloppsbanor skakar i fyra timmar, sedan centrifugera röret i tre minuter vid 9, 300 gånger G och kasta 950 mikroliter supernatant.Resuspend pelleten i 50 mikroliter av LB och isolera blandningen på LB-agar som innehåller sackaros och ingen natriumklorid. Inkubera plattan över natten vid 30 grader Celsius. Spot isolerade kolonier på LB agar och LB agar som innehåller 15 milligram per milliliter gentamycin för att kontrollera gentamycin känslighet.Placera ett mikroskop glas bild på en plan horisontell yta och ordna två glas diabilder toppad med två lager av tejp runt den. Pipett en 70 mikroliter droppe 1%smält agaros på glaset bilden och placera en fjärde bild på toppen för att platta till agarosdropp. Tryck ner försiktigt i ungefär en minut.Ta av den övre bilden och släpp cirka tre mikroliter av bakterier i tre till fyra platser på olika platser på agarospaden. Täck agarospaden med en mikroskopiglasöverdrag och fixera den med smält paraffin för att försegla den på glasrutschbanan som börjar med de fyra hörnen. Placera mikroskopi bilden på scenen med coverslip inför målet.Vrid filtret kuben revolver för att välja eGFP kuben och öppna fluorescens lampa slutaren, sedan skicka fluorescens ljuset mot okularet i mikroskopet. Fokusera målet på bakterierna med hjälp av mikroskopvreden. Välj en region av intresse i provet med hjälp av joysticken som styr den motoriserade scenen.Skicka fluorescensutsläppsvägen tillbaka mot detektorn, vrid sedan tillbaka filtret kuben revolvern för att välja den dichroic kuben för 930 nanometer laser och ställa in lasereffekten till 20 milliwatt. Ställ in storleken på regionen av intresse till 30 mikrometer som justerar spänningen som fungerar galvo speglarna och definierar intervallet för sina rörelser. Sätt på detektorn och börja skanna provet.Välj synfält för bildtagning genom att finst flytta scenen från datorgränssnittet. Detta kan göras på setup genom att flytta korset på bilden i mikroskopet styr mjukvaran som kommer att definiera den nya mitten av bilden och trycka flytta scenen. Ett bra synfält för förvärv bör innehålla 10 till 30 orörliga bakterier alla i fokus.Om intresserad av att extrahera enstaka celler FILM-FRET data, se till att bakterierna är väl individualiserade. Öppna bildhanteringsprogrammet och kontrollera att fotonräkningshastigheten inte är för hög för att undvika en pileup-effekt som kan påverka livstidsmätningar. Om det behövs, sänka laser intensitet för att hålla fotonen räkna hastigheten låg.Justera förvärvsparametrar inklusive insamlingstiden för anskaffning. Tryck på startknappen och vänta tills förvärvet har slutförts. Om du vill analysera data öppnar du RStudio och skapar ett nytt projekt.Skapa en ny mapp i huvudprojektmappen och namnge den data, sedan flytta alla analyser be filer i den här mappen. Öppna en ny skriptfil eller den kompletterande skriptet flim_analysis.r. Installera det dedikerade FlimDiagRam-paketet för filmdataanalys och anropa paketet på arbetsytan.Här visas empiriska kumulativa fördelningsfunktioner av fluorescensens livstider som uppmätts för de olika bakteriestammarna. Om FRET inträffar, skiftas funktionerna mot de kortare levde livstiderna. Det är viktigt att notera att FRET inte kan uppstå när samspelet mellan de två proteinerna resulterar i ett långt avstånd mellan de två flurophores, som inte kan skiljas från frånvaron av interaktion.Därför kan det vara nödvändigt att märka proteinerna på olika positioner för att maximera chanserna att sondera interaktionen. På grund av den stora skillnaden i proteinuttryck mellan PvdA och PvdL resulterar inte samma komplex i liknande FILM-FRET-data. Obalanserade stökimetrier leder till skillnader i bidraget från det fria jämfört med de bundna givarmärkta proteinerna i den registrerade fluorescensens livstidsfördelning.Diagrammet tomt kan användas för att ge kritisk information om stökiometri. I PvdA-eGFP mCherry-PvdL mutant, kvantiteten av givaren-märkt PvdA är mycket högre än mängden av mCherry-PvdL. Bland alla givare som finns i urvalet, bara ett fåtal av dem interagerar med PvdL.Den enda tau ett värde centrerad på cirka 2,3 nanosekonderna tyder på att varje PvdA-eGFP givare kan bara överföra med en mCherry-PvdL acceptor. När märkningen är omvänd, de flesta av eGFP-PvdL proteiner förväntas interagera med PvdA-mCherry som bekräftas av de högre alfa ett-värden. Tau ett värden blev mer fördelade tyder på att flera PvdA proteiner kan binda till en enda PvdL protein.Den FLIM setup blir tillgänglig i ett ökande antal bildframställning anläggningar. Imaging prover i en FILM-FRET är inte mer komplicerat än bildframställning i videomikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-ubiquitin Baserat Membrane Jäst Två Hybrid (MYT) System: ett kraftfullt verktyg för att identifiera Protein-protein interaktioner

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Mikroflödessystem Co-kultur av epitelceller och bakterier för att utreda Löslig Signal-medierade interaktioner

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detektion av protein-protein interaktioner på mikro-mönstrade ytor

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein interaktioner In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-upplösning avbildning av Cytokinetic Z Ring i levande bakterier Använda Snabb 3D-Structured Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...