Name: flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

Dr. Ludovic Richert'i FLIM veri toplama ve FLIM kurulumunun teknik bakım ve geliştirmesi konusundaki değerli yardımlarından dolayı kabul ediyoruz. Bu çalışma Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/) bağışları ile finanse edilmiştir. VN Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906) tarafından finanse edilmektedir. YM, Institut Universitaire de France'a (IUF) destek ve araştırmaya yardımcı olmak için ek süre sağladığı için müteşekkirdir. IJS ve JG, Strazburg İlaç Dağıtım Enstitüsü'nü mali desteğinden ötürü kabul ediyorlar.

1. Plazmid yapımı
<ol><li>P. aeruginosa genomuna karşılık gelen bölgelerin 700 baz çiftinin iki PCR (PCR1 ve 3) DNA dizilerini (P. aeruginosa PAO1 genomik DNA'sını kullanın) yükseltin. Mavi ve yeşil astarlara kısıtlama siteleri ekleyin ve kırmızı daki astarlara mCherry ile örtüşen bir sıra ekleyin(Şekil 2).<ol>
<li>EGFP ile C-terminus etiketli PvdA için, mavi astarlar tarafından stop codon göre 700 bp bölge upstream yükseltmek, ve yeşil astaril...

FLIM-FRET, yoğunluk tabanlı FRET görüntülemeye göre bazı önemli avantajlar sunar. Floresan ömür, floroforun içsel bir parametresi. Sonuç olarak, ne ışık uyarma yoğunluğu floroforların yerel konsantrasyonları bağlı değildir. Floresan ömrü ayrıca fotoğraf beyazlatma dan da kötü etkilenir. Özellikle lokal protein konsantrasyonlarının hücre altı bölmeleri veya bölgeleri boyunca son derece heterojen olabileceği hücrelerde PPI'ların kanıt edilmesi ilginçtir. FLIM-FRET, hem proteinlerin h...

Protein-protein etkileşimleri (PPI) hücrelerde çeşitli anahtar süreçleri kontrol1. PPI rolleri protein bileşimi, yakınlık fonksiyonları vehücrelerdekonumları 2 dayalı farklıdır. PPI'lar farklı teknikler ile araştırılabilir3. Örneğin, co-immünopresid, ppis tanımlamak veya onaylamak için yaygın olarak kullanılan nispeten basit, sağlam ve ucuz bir tekniktir. Ancak, etkileşimhalinde olan proteinlerin ifade düzeyleri düşük olduğunda veya etkileşimler geçici veya yalnızca belirli ortamlarda ilgili olduğunda PPI'ların incelenmesi zor olabilir. P. aeruginosa pyoverdine yolunun farklı enzimler arasında meydana gelen PPIs incelenmesi genel demir ko-faktörlü baskı fur baskı hücre4ifade edilecek pyoverdine yolunun tüm proteinlerin ifade sağlamak için rahatlamış olduğunu gerektirir4 ,5,6. Yolun tüm proteinleri için bu ortak düzenleme hücrede zamanında ifadeler onların etkileşimlerini teşvik etmesi bekleniyor sonuçları. Boyut, doğa, ifade düzeyleri ve bu metabolik yolun protein sayısı açısından çeşitlilik, yeniden yapılı sistemlerde çalışmayı zorlaştırır6. Bu nedenle hücresel ortamlarında PPI'ları keşfetmek, proteinlerin biyolojik işlevlerini kendi yerel bağlamlarında daha iyi anlamak için çok önemlidir.
Floresan dahil olmak üzere sadece birkaç yöntem canlı hücrelerde PPI keşfetmek sağlar7. Ölçülebilen farklı floresan parametreleri arasında, floresan ömrü (yani, bir florofor bir foton yaymadan önce heyecanlı durumda kalır ortalama süre) muhtemelen canlı hücrelerde keşfetmek için en ilginç parametrelerden biridir. Bir florofor floresan ömrü çevresine son derece duyarlıdır ve FLIM bu nedenle florofor çevresi ile ilgili kimyasal veya fiziksel bilgi sağlayabilir8. Bu förster rezonans enerji transferi varlığı içerir (FRET) bir floresan kısa bir mesafede bulunan floresan bir "kabul" varlığında oluşabilir "donör". Enerji transferi, donör floresan süresinin(Şekil 1A)önemli ölçüde kısalmasıyla sonuçlanır ve floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Mikroskobu'nu (FLIM) canlı hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerini doğrudan araştırmak için güçlü bir yaklaşım haline getirir. FLIM ayrıca etkileşimlerin7,8hücrelerinde nerede gerçekleştiği hakkında uzamsal bilgi sağlayabilir. Bu yaklaşım, etkileşen iki ortağın floroforlarıyla etiketlemenin mümkün olduğu durumlarda PPI'ları araştırmak için son derece güçlüdür.
FRET gerçekleşmesi için - iki floroforlar arasındaki mesafe kritik koşullar8gereklidir ,9. İki florofor 10 nm'den fazla birbirlerinden uzak olmamalıdır. Bu nedenle, flim-FRET deneyleri tasarlarken, vericinin ve floresan kabul edenin etkileşim kompleksinde birbirine yakın bir konuma sahip olmasını sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Bu kısıtlayıcı gibi görünse de, FRET'in uzaklık bağımlılığı, FRET geçiren iki etiketli proteinin fiziksel olarak etkileşime girmesini sağladığından gerçek bir avantajdır(Şekil 1A). Kolocalizasyon deneylerinde ÜFE hakkında net cevaplar almadaki güçlükler (iki kolokalize protein mutlaka etkileşime girmeyebilir) bu nedenle FLIM-FRET kullanılarak bir sorun değildir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg"> Şekil 1: FLIM-FRET analiz prensibi. FLIM-FRET çok boyutlu görüntünün her pikseli, bu belirli konumda kaydedilen floresan bozunma hakkında bilgi içerir (#counts = t kanalında algılanan fotonların sayısı). (A) FLIM görüntünün klasik gösterimi genellikle sahte renkli bir yaşam boyu kodlanmış 2B görüntüdür (solda). Donörün ortalama floresan ömründe bir azalma - renk skalasında ki bir değişiklikten de görüldüğü gibi - FRET'nin varlığında görülebilir ve bu mekansal alanda PPI varlığı hakkında bilgilendiricidir. (B) FRET'in oluşabilmesi için donör emisyon spektrumu ile kabul eden emilim spektrumu arasında çakışma gereklidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
FRET için ikinci bir gereklilik donörün emisyon spektrumu ve kabul edenin emilim spektrumunun8 ile çakışmasıdır (Şekil 1B). Donörün floresan uyarma kabul edenin doğrudan floresan uyarma çok az katkıda dalga boylarında olmalıdır. Tüm florofor kombinasyonları mümkün değildir ve ayrıca FLIM-FRET yorumlarını kolaylaştırmak için monokonsenyel floresan bozunan donörleri tercihen kullanmanızı tavsiye ediyoruz10. Floresan proteinlerin birkaç çift popüler eGFP-mCherry çift11 de dahil olmak üzere bu gereksinimleri karşılamak (mevcut floresan protein FRET çiftleri paletüzerinde bir inceleme içinbkz 12,13).
FLIM-FRET, Bir FLIM görüntüsünün her pikselinde bir FRET donörünün floresan ömür boyu çürümesini ölçmeye olanak sağlar (Şekil 1A). Floresan yaşam süresini belirlemek için, kazanım ve analizde farklılık gösteren iki temel teknik vardır: frekans-etki alanı (FD)14 ve zaman-etki alanı (TD). TD FLIM daha yaygındır ve gating yöntemleri 15 dahil olmak üzere farklı olası algılama yapılandırmaları ile birlikte darbeli bir aydınlatma kullanılarak gerçekleştirilir15, çizgi kamera16 veya zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC) teknikleri8. Hem FD hem de TD teknikleri için floresan ömrü doğrudan ölçülmez, ancak yaşam sürelerini veya etkileşimlerin varlığını tahmin etmek için ölçülen verilerin analizini gerektirir. TCSPC teknikleri için, en yaygın olarak kullanılan analiz, artıkların ağırlıklı toplamını en aza indiren en az kare yinelemeli yeniden kıvrımlar kullanarak bozunmaların tek veya çok üstel fonksiyonlarla donatılmasına dayanır.
Son olarak, FLIM-FRET hem tek foton hem de multifoton uyarma kullanılarak gerçekleştirilebilir. En son odak düzleminin dışında otomatik floresan ve fotohasarı azaltmak gibi çeşitli avantajları vardır. Kalın 3Dnumunelerde8 çalışıyorsa multifoton uyarmalar da daha uzun bir uyarma derinliği sağlar. Aksine, floresan proteinlerin iki foton emilimi kesitleri sınırlı olarak tek foton uyarma genellikle daha verimli17.
Burada, ppis kritik özelliklerini ortaya çıkarmada tekniğin kalitesini ve sağlamlığını göstermek için kopyaların çok farklı sayıda ifade iki etkileşim protein (PvdA ve PvdL) belirli bir durumda canlı P. aeruginosa PPIs FLIM-FRET ölçümleri için bir protokol öneriyoruz. PvdA ve PvdL proteinleri pyoverdine biyosentezinde rol oynarlar. PvdA bir L-ornitin N5-oxygenaz ve hidroksilasyon (PvdA) ve formilasyon (PvdF) tarafından L-ornithine L-N5-formyl-N5-hidroksiincenin sentezler18. PvdL, dört modülden oluşan ribozomal olmayan bir peptit sentezi (NRPS) enzimidir. İlk modül mistik asit inyaklasını katalizler. İkinci modül, L-Glu'nun aktivasyonunu ve yoğunlaşmasını mistik-coA'ya katalizler. Daha sonra, üçüncü modül daha sonra D-Tyr izomerize bir L-Tyr amino asit yoğunlaştırır. Son olarak, dördüncü modül bir L-Dab (Diaminobutyric asit) amino asit bağlar acylated tripeptid L-Glu/D-Tyr/L-Dab6oluşturmak için . PvdL böylece pyoverdine öncülüüç ilk amino asitlerin sentezinden sorumludur. PvdL ile PvdA protein etkileşimi şaşırtıcı, PvdL aksine, L-N5-formyl-N5-hidroksyorltin için özel bir modül taşımaz. Bu etkileşim, piradenin öncüsentezinden sorumlu tüm enzimlerin büyük geçici ve dinamik çok enzimli komplekslerde düzenlendiğini göstermektedir19,20.
Bu raporda, etkileşen iki eGFP ve mCherry etiketli proteinleri doğal olarak ifade eden bakteri suşlarının nasıl inşa edilebildiğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ayrıca, etkili FLIM-FRET hücre görüntülemesi için numune hazırlama ve koşulları da açıklıyoruz. Son olarak, karmaşık FLIM-FRET verilerinin basit yorumu için gelişmiş görselleştirme olanakları sağlayan yeni geliştirilen bir araç da dahil olmak üzere görüntü analizi için adım adım öğretici öneriyoruz. Bu raporla, sadece maceracı değil, çoğu biyologu FRET-FLIM'in yerel hücresel ortamda ppis'lerle ilgili sorularını doğrudan ele alabilecek erişilebilir ve güçlü bir teknik olduğuna ikna etmek istiyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="900">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">525/50 nm band-pass filter</td>
			<td style="width:251px;">F37-516, AHF, Germany</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:186px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">680 nm short pass filter</td>
			<td>F75-680, AHF, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate (NH4)2SO4</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DreamTaq DNA polymerase 5U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EP0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli TOP10</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber-coupled avalanche photo-diode</td>
			<td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20&#215;20mm</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny broth (LB)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.10285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10034-99-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides (25&#215;75mm)</td>
			<td style="width:251px;">Knitel glass</td>
			<td>MS0057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucleoSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740588.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES20765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Succinate (Disodium)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>14160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPCImage, SPCM software</td>
			<td>Becker &#38; Hickl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile inoculating loop</td>
			<td style="width:251px;">Nunc</td>
			<td>7648-1PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T4 DNA ligase 1U/&#956;L</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15224017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCSPC module</td>
			<td>SPC830, Becker &#38; Hickl, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire laser</td>
			<td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubes 50mL</td>
			<td style="width:251px;">Falcon</td>
			<td style="width:139px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flim-fret measurements of protein-protein interactions in live bacteria.

Protein-protein etkileşimleri (PPI) hücrelerdeki çeşitli önemli süreçleri kontrol eder. Förster rezonans enerji transferi (FRET) ile birlikte floresan yaşam boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) canlı hücrelerde PPI'lar hakkında doğru bilgi sağlar. FLIM-FRET, FLIM görüntüsünün her pikselinde bir FRET donörünün floresan ömür boyu çürümesini ölçmeye ve PPI'lar ve bunların uzamsal hücresel organizasyonları hakkında nicel ve doğru bilgi sağlamaya dayanır. Burada, PPI'lerin kritik özelliklerini ortaya çıkarırken tekniğin kalitesini ve sağlamlığını göstermek için son derece farklı kopya numaralarıyla ifade edilen iki etkileşim proteinin in canlı Pseudomonas aeruginosa'da PPI'ları izlemek için uyguladığımız FLIM-FRET ölçümleri için ayrıntılı bir protokol öneriyoruz. Bu protokol, ÜFE karakterizasyonu için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak açıklar - karmaşık FLIM-FRET verilerinin basit bir yorumu için gelişmiş görselleştirme olanakları sağlayan son geliştirilen araçları kullanarak son analize kadar bakteriyel mutant yapılardan başlayarak.

Farklı bakteriyel suşlar için ölçülen floresan ömürlerinin ampirik kümülatif dağılım fonksiyonları (ecdf) Şekil 8'degösterilmiştir. FRET oluşursa, ekdfler daha kısa ömürlü yaşam sürelerine doğru kaydırılır(Şekil 8A,8B). İki proteinin etkileşimi iki floroforarasında uzun bir mesafeyle sonuçlandığında, HIÇBIR FRET oluşabilir(Şekil 8C). Bu durum, FLIM'deki iki ortak arasındaki et...

Watch this Scientific Journal Video about FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. at JoVE.com

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Burada FLIM-FRET ölçümleri kullanılarak canlı Pseudomonas aeruginosa'da çok farklı ifade edilmiş iki protein arasındaki protein-protein etkileşimlerini karakterize eden bir protokol uyguluyoruz. Protokol, bakteri gerinim konstrüksiyonları, bakteri immobilizasyonu, görüntüleme ve görüntüleme sonrası veri analizi rutinlerini içermektedir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin FLIM-FRET Ölçümleri.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FİlM-FRET, şüpheli veya tahmin edilen protein-protein etkileşimlerini doğrulamayı mümkün kılan güçlü bir tekniktir. Bu protokolde, belirli durumlarda dengesiz donör ve alıcı miktarları olan verileri analiz etmenin bir yolunu sıyoruz. FİlM-FRET canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri hakkında bilgi verebilir.Doğal hücresel ortamda kisisel-protein etkileşimlerini araştırmak önemlidir, özellikle floresan protein endojen düzeyde ifade edildiğinde. P.aeruginosa, E.coli TOP10 ve E.coli yardımcı bakteri her büyüyen başlayın LB beş mililitre antibiyotik olmadan 30 derece santigrat gece sallayarak. Ertesi gün, kültürlerin optik yoğunluğunu ölçün ve 1,5 mililitrelik mikrotüpte eşit miktarda P.aeruginosa, E.coli TOP10 ve E.coli yardımcısını karıştırın.Tüpü 9, 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatant'ı atın ve 50 mikrolitre LB'de peleti yeniden askıya alın. Önceden ısıtılmış LB agar üzerinde karışımın bir nokta plaka ve 37 santigrat derece beş saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, steril bir aşı lama döngüsü ile nokta kazıyın ve LB bir mililitre resuspend. Plaka 100 mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram ve mililitre gentamycin başına 30 mikrogram içeren LB agar bu bakteriyel süspansiyon mikrolitre ve e.coli TOP10 ve E.coli yardımcı bakterileri ortadan kaldırmak için 37 derece santigrat iki gün kuluçka. LB bir mililitre bir koloni resuspend ve dört saat boyunca orbital sallayarak 37 santigrat derece kuluçka, sonra 9, 300 kez G üç dakika için tüp santrifüj ve supernatant 950 mikrolitre atın.LB 50 mikrolitre pelet resuspend ve sakaroz ve sodyum klorür içeren LB agar karışımı izole. Tabağı bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın. Mililitre gentamisin başına 15 miligram içeren LB agar ve LB agar spot izole koloniler amacıyla gentamisin duyarlılığı kontrol etmek için.Düz yatay bir yüzeye bir mikroskop cam slayt yerleştirin ve etrafında yapışkan bant iki kat ile tepesinde iki cam slaytlar düzenlemek. Pipet% 1 erimiş agarose 70 mikrolitre damlacık cam slayt üzerine ve agarose damlacık düzleştirmek için üstüne dördüncü bir slayt yerleştirin. Yaklaşık bir dakika boyunca hafifçe bastırın.Üst slayt çıkarmak ve agarose ped üzerinde farklı yerlerde üç ila dört noktalar bakteri yaklaşık üç mikrolitre bırakın. Agarose pedi bir mikroskopi cam kapak lı kaplayın ve dört köşeden başlayarak cam kaydırağa yapıştırmak için erimiş parafinle düzeltin. Mikroskopi slaytını hedefe bakan kapak lı olarak sahneye yerleştirin.eGFP küpünü seçmek için filtre küptürüntürününü çevirin ve floresan lamba deklanşörünü açın, ardından floresan ışığını mikroskopun merceğine doğru gönderin. Mikroskop tonlarını kullanarak bakterilerin amacıodaklanın. Motorlu sahneyi kontrol eden joystick'i kullanarak numunenin ilgi çekici bir bölgesini seçin.Floresan emisyon yolunu dedektöre geri gönderin, ardından 930 nanometre lazer için dikroik küpü seçmek ve lazer gücünü 20 miliwatt'a ayarlamak için filtre küptürüntürüngeri dönün. Galvo aynaları çalıştıran gerilimi ayarlayan ve hareketlerinin aralığını tanımlayan 30 mikrometreye kadar ilgi alanının boyutunu ayarlayın. Dedektörü açın ve örneği taramaya başlayın.Sahneyi bilgisayar arabiriminden ince bir şekilde hareket ettirerek görüntüleme için görüş alanını seçin. Bu, görüntünün yeni merkezini tanımlayacak mikroskop kontrol yazılımındaki görüntü üzerindeki haçı hareket ettirerek ve taşıma aşamasına basarak kurulumda yapılabilir. Edinim için iyi bir görüş alanı 10 ila 30 hareketsiz bakteri tüm odak içermelidir.Tek hücre film-FRET veri ayıklama ilgileniyorsanız, bakteri iyi bireyselleştirilmiş olduğundan emin olun. Görüntüleme yazılımını açın ve foton sayımı oranının ömür boyu ölçümleri etkileyebilen bir yığın etkisinden kaçınmak için çok yüksek olmadığını kontrol edin. Gerekirse, foton sayımı oranını düşük tutmak için lazer yoğunluğunu düşürün.Edinme toplama süresi de dahil olmak üzere edinme parametrelerini ayarlayın. Başlat düğmesine basın ve satın almanın tamamlanmasını bekleyin. Verileri analiz etmek için RStudio'yu açın ve yeni bir proje oluşturun.Ana proje klasöründe yeni bir klasör oluşturun ve veri adını, sonra tüm çözümleme bu klasöre dosyaları sormak taşıyın. Yeni bir komut dosyası dosyası veya ek komut dosyası flim_analysis.r açın. Film veri analizi için özel FlimDiagRam paketini yükleyin ve paketi çalışma alanında arayın.Farklı bakteriyel suşlar için ölçülen floresan ömürlerinin ampirik kümülatif dağılım fonksiyonları burada gösterilmiştir. FRET oluşursa, işlevler daha kısa ömürlü yaşam sürelerine kaydırılır. Bu FRET iki protein etkileşimi etkileşimi etkileşim yokluğunda ayırt edilemez iki flurofors arasında uzun bir mesafe ile sonuçlandığında oluşabilir dikkat etmek önemlidir.Bu nedenle, etkileşimi sondalama şansını en üst düzeye çıkarmak için proteinleri farklı konumlarda etiketlemek gerekebilir. PvdA ve PvdL arasındaki protein ifadelerindeki büyük fark nedeniyle, aynı kompleks benzer FİLO-FRET verilerine neden olmaz. Dengesiz stoiyometries kaydedilen floresan ömür boyu dağılımında bağlı donör etiketli proteinler ile karşılaştırıldığında ücretsiz katkısı farklılıklara yol açar.Diyagram çizimi stoiyometri hakkında kritik bilgiler sağlamak için kullanılabilir. PvdA-eGFP mCherry-PvdL mutantında, donör etiketli PvdA miktarı mCherry-PvdL miktarından çok daha yüksektir. Örnekte bulunan tüm bağışçılar arasında, sadece birkaçı PvdL ile etkileşim halindedir.Yaklaşık 2,3 nanosaniye merkezli tek tau bir değer, her PvdA-eGFP donörün sadece bir mCherry-PvdL alıcısı ile transfer edilebilmeyi önerir. Etiketleme tersine çevrildiğinde, eGFP-PvdL proteinlerinin çoğunun pvda-mCherry ile etkileşime geçmesi beklenir ve bu da yüksek alfa bir değerleri ile doğrulanır. Tau bir değerleri birden fazla PvdA proteininin tek bir PvdL proteinine bağlanabileceğini düşündüren daha fazla dağıtılmış hale geldi.FLIM kurulumu giderek artan sayıda görüntüleme tesisinde kullanıma sunuluyor. FİlM-FRET'deki görüntüleme örnekleri video mikroskobundaki görüntülemeden daha karmaşık değildir.

Research

JoVE Journal

Biology

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Yüksek yoğunluklu Fonksiyonel Protein mikrodizileri Probing Protein-protein Etkileşimleri Algılama

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...