Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية بالأرقام التي منحتها 21425519 و91853105 و21621003.

1. خلية ثقافة
<ol><li>إعداد المتوسطة كاملة لخلايا U87 MG عن طريق إضافة مصل الأبقار الجنين (التركيز النهائي 10٪) والبينسلين-ستربتوميسين (التركيز النهائي 1٪) إلى الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM). استخدام طبق ثقافة الخلايا البلاستيكية لخلايا الثقافة الفرعية.</li>
	<li>مرور الخلايا 2 إلى 3 مرات في الأسبوع.<...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

يتم استخدام البروتوكول المقدم لدراسة ديناميات الـ AuNRs على غشاء الخلية. ويتألف البروتوكول من أربعة أجزاء، بما في ذلك التصوير المجهري، واستخراج البيانات، وحساب المعايير الديناميكية، وطرق تحليل البيانات، وكل جزء مرن وعالمي. لذلك ، هناك العديد من التطبيقات المستقبلية المحتملة ، على سبيل ال?...

ترتبط ديناميات الجسيمات النانوية (NPs) على الغشاء ارتباطًا وثيقًا بعملية الامتصاص الخلوية ، وهو أمر ضروري لفهم وظائف الخلايا والعدوى الفيروسية أو البكتيرية وتطوير أنظمة توصيل نانوميدية اصطناعية1،2. تقنية تتبع الجسيمات المفردة (SPT) هي أداة قوية لتميز السلوكيات غير المتجانسة لـ NPs3،4. بشكل عام، غشاء الخلية هو fluidic، مما يعني أن مكونات مثل البروتينات والدهون يمكن أن تتحرك أفقيا في الطائرة غشاء البلازما5،6،7. قد يؤدي التعقيد الزماني الزهيائي لتنظيم الغشاء وبنيته إلى عدم تجانس الزمانية في التفاعل بين مصادر القدرة النووية والغشاء. وبالتالي ، فإن التصور المباشر لحركة مصادر القدرة النووية على الغشاء يتطلب دقة مكانية وزمنية عالية.
تم تطوير المجهر تتبع الجسيمات واحد الذي يرصد توطين الجسيمات الفردية في الخلايا الحية مع القرار المكاني من عشرات نانومتر ودقة الوقت من ميلي ثانية لدراسة NPs أو ديناميات الجزيئات الغشاء8،9. وقد أصبحت تقنيات التصوير المجهري الفلورية المستندة إلى أدوات قيمة لمراقبة NPs / الجزيئات في بيئة الخلايا الحية9،10،11،12. على سبيل المثال ، تم استخدام المجهر الفلوري الداخلي الكلي ، الذي صور طبقات رقيقة (~ 100 نانومتر) من العينة في واجهة الركيزة / الحل مع دقة ارقائية عالية في دراسات ديناميات جزيئات الغشاء13،14. ومع ذلك ، فإن العيوب الكامنة في الفلوروفورات المفردة ، مثل الكثافة المنخفضة والضوائ السريع الذي لا رجعة فيه يقلل من دقة ومدة تتبع13. ولذلك، فإن NPs بلازمونية غير الفلورية، التي تحل محل المسابير الفلورية، جذبت المزيد والمزيد من الاهتمام في دراسات التصوير طويلة الأجل بسبب خصائصها البصرية الفريدة15. استنادا إلى إشارات تشتت تحقيقات NP plasmonic ، وقد استخدمت عدة أنواع من تقنيات التصوير المجهري البصري لدراسة آلية العمليات البيولوجية ، مثل المجهر في مجال الظلام (DFM)16، التداخل تشتت (iSCAT) المجهري17 والتداخل التفاضلي التباين المجهر (DICM)18. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على الحركة وتناوب دينامية AuNRs باستخدام سوق دبي المالي وDICM18،19،20،21،22. عادة، في تجربة SPT، يتم تسجيل حركة الجسم بواسطة المجهر البصري، ومن ثم تحليلها بواسطة أساليب التحليل SPT3. المسارات التي تم حلها في الوقت والزوايا التوجهية التي تولدها مصادر القدرة النووية الفردية عادة ما تكون عشوائية وغير متجانسة ، لذلك من الضروري تقديم معلومات ديناميكية وفيرة مع أساليب تحليل مختلفة.
هنا، نحن نقدم بروتوكول متكامل يراقب ديناميات AuNRs على غشاء الخلية باستخدام DFM، ويستخرج موقع واتجاه AuNRs مع ImageJ و MATLAB، ويميز انتشار AuNRs باستخدام أساليب التحليل SPT. وكعرض توضيحي، نعرض هنا كيفية استخدام بروتوكول SPT لتصور ديناميات أورون غير المعدلة (CTAB-AuNRs، التي يتم تصنيعها بواسطة جزيء بروميد الأمونيوم السيتيلتريلميثوم كعامل وقائي) على غشاء الخلية U87 MG. وقد ثبت أن CTAB-AuNRs يمكن أن adsorb البروتينات في البيئة البيولوجية، والانتقال على غشاء الخلية ومن ثم أدخل الخلايا2،20،22. U87 MG الخلية هو الورم الأكثر شيوعا والأكثر الخبيثة من الجهاز العصبي المركزي, ويتم التعبير عن مستقبلات الغشاء بشكل غير طبيعي. يمكن لمستقبلات الغشاء التفاعل مع البروتينات على AuNRs، والتي تؤثر على ديناميات أوارون. بروتوكولنا ينطبق بشكل عام على تجارب SPT الأخرى في مجال البيولوجيا.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

تحليل ديناميات الانتشار من الجسيمات النانوية على غشاء الخلية يلعب دورا هاما في فهم أفضل لعملية امتصاص الخلوية ويوفر أساسا نظريا للتصميم العقلاني لتقديم الأدوية نانو. يمكن أن يسبر تحليل تتبع الجسيمات المفردة (SPT) موضع وتوجه الجسيمات النانوية الفردية على غشاء الخلية، ويكشف عن حالاتها الترجمية والدورانية. هنا، نعرض كيفية استخدام المجهر التقليدي في الحقل المظلم لمراقبة ديناميكيات نانورود الذهب (AuNRs) على غشاء الخلية الحية. كما نعرض كيفية استخراج موقع وتوجه AuNRs باستخدام ImageJ و MATLAB ، وكيفية توصيف الحالات المنتشرة في AuNRs. التحليل الإحصائي لمئات من الجسيمات تبين أن AuNRs واحد أداء حركة براونيان على سطح غشاء الخلية U87 MG. ومع ذلك، يظهر تحليل المسار الطويل الفردي أن لدى وحدات الـ "أو إن آر" نوعان مختلفان بشكل واضح من حالات الحركة على الغشاء، وهما النقل بعيد المدى والحبس المحدود المساحة. يمكن استخدام طرق SPT لدينا لدراسة انتشار الجسيمات داخل الخلايا أو السطح في الخلايا البيولوجية المختلفة ويمكن أن تصبح أداة قوية للتحقيقات في الآليات الخلوية المعقدة.

في البروتوكول، تم استخدام 40 × 85 نانومتر غير معدلة CTAB-AuNRs. كما هو مبين في الشكل 2B، الحد الأقصى لـ plasmonic الطولي هو 650 نانومتر (المنطقة الحمراء) والرنين العرضي هو في 520 نانومتر (المنطقة الخضراء). وقد كشفت الآداب السابقة أن الخصائص البصرية (مثل كثافة LSPR) من Plasmonic AuNRs سوف تتغير بشكل كب...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

هنا، نعرض استخدام المجهر التقليدي في مجال الظلام لمراقبة ديناميات نانورود الذهب (AuNRs) على غشاء الخلية. يتم الكشف عن موقع واتجاه AuNRs واحد باستخدام ImageJ MATLAB، وتتميز الدول الانتشارية من AuNRs بتحليل تتبع الجسيمات واحدة.

تصور ديناميات الانتشار من نانورود الذهب على غشاء الخلية باستخدام جسيمات نانوية واحدة Darkfield المجهرية

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

يستخدم بروتوكولنا تحليل تدقيق الجسيمات الواحدة لمراقبة الديناميكيات في الموقع والاتجاه، كما أنه يميز انتشار نانورود ذهبية على أغشية الخلايا. باستخدام هذه الطريقة، يمكن الحصول على كل من ديناميات الترجمة والدوران من نانورودس الذهبي ويمكن تحليلها بشكل شامل ودينامية. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أنواع أخرى من النظم البيولوجية المعقدة.تبدأ عن طريق حرق الايثانول انخفض الزجاج الأغطية على اللهب ووضع غطاء في 35 في 10 ملليمتر طبق ثقافة الخلية التي تحتوي على ملليلتر اثنين من خلية ثقافة المتوسطة دون الفينول الأحمر. إضافة 50 microliters من تعليق الخلية من الفائدة على غطاء يهز بلطف الطبق ذهابا وإيابا واليسار واليمين لتوزيع الخلايا بالتساوي. ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 12 ساعة تقريبًا حتى تصل الخلايا إلى 20 إلى 40٪ قبل إضافة 20 ميكرولترات من نانورود الذهب المغلفة بـ CTAB إلى الطبق.بعد اهتزاز لطيف لتفريق نانورودس بالتساوي عبر الطبق، وضع الطبق في جو مرطب لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة، ببطء نقل 100 ميكرولترات من السوبر من الطبق في الأخدود من شريحة زجاجية ووضع بعناية الجانب خلية coverlip أسفل على الأخدود الشريحة، ثم ختم حافة الغطاء مع طلاء الأظافر والسماح لطلاء الأظافر الجافة قبل وضع الشريحة على مرحلة المجهر darkfieldfield. لتتبع الجسيمات واحدة عن طريق المجهر darkfieldfield، ضع قطرة من الزيت على النفط يغمر مكثف الحقول المظلمة وتحويل مقبض الباب حتى المكثف اتصالات الشريحة الزجاجية.ضع قطرة من الزيت على الجزء العلوي من الزجاج الغطاء، وبدوره مقبض التركيز حتى 60X النفط الغمر الهدف يمس النفط. بدوره على مصدر الضوء وتحويل قليلا مقبض التركيز على التركيز على الطائرة التصوير. ثم انقر فوق رمز الكاميرا في برنامج المجهر لتسجيل عينة تشتت ضوء سلسلة الوقت باستخدام كاميرا CMOS اللون وحفظ الصورة في تنسيق TIFF.لاستخراج مسار واحد طويل المدى، افتح الصورة في ImageJ وانقر على الصورة، واكتب، و8 بت لتحويل الصورة من وضع RGB إلى وضع 8 بت. لضبط التباين، انقر فوق الصورة، وضبط، وتباين السطوع، وتعيين المعلمات. حدد الجسيمات الهدف واستخدام التحكم العاشر لقطع الخلفية سلسلة الوقت.انقر فوق الإضافات ، وتعقب الجسيمات الكلاسيكية ، وتعقب الجسيمات لفتح كشف الجسيمات والجسيمات التي تربط النافذة وتعيين دائرة نصف قطرها إلى ستة ، وقطع إلى الصفر ، والمئين إلى 0.01 ٪ تعيين نطاق الارتباط إلى 10 والتشريد إلى 10 وانقر فوق موافق لفتح نافذة نتائج تعقب الجسيمات لرؤية النتائج. انقر على تصور جميع المسارات لفحص المسارات التي تم إنشاؤها. إذا كان البرنامج ولدت مسار والمسار المتحرك من نانورود الذهب مطابقة، انقر فوق حفظ التقرير الكامل لحفظ النتائج.إذا كان المسار البرمجي الذي تم إنشاؤه لا يطابق المسار المتحرك لل nanorods الذهبية، فانقر فوق جزيئات إعادة الربط لإعادة ربط الجسيمات المكتشفة بنطاق وصلة مختلفة ومعلمات المئين. للعثور على تنسيق بكسل الوسط من نانورود الذهب في كل إطار وفقا لإحداثيات س ص، استخدم xycoordination. m الدالة.لتحديد مصفوفة ثلاثة في ثلاثة بكسل، استخراج تسعة قيم كثافة التشتت للقنوات الحمراء أو الخضراء وحساب قيمة متوسط، استخدم rgextraction. m الدالة. ثم استخدام polarangle.م الدالة لحساب الزوايا القطبية باستخدام طريقة تفاضلية قناة مزدوجة. لحساب معلمات حيوية باستخدام الصيغ في الجدول، قم بتشغيل البرامج النصية للتحليل اثنين. للتحليل المرئي للمسار، قم بتعيين تنسيق س كـ X، وإحداثيات ص كـ Y، والوقت كـ Y، ثم انقر فوق مخطط الرسم، التشتت، و خريطة اللون، قم بتعيين معلمات الرسم البياني، ثم أضف شريط الألوان.لإنشاء متوسط إزاحة مربعة الفاصل الزمني الأشكال الفاصلة، تعيين الفاصل الزمني كـ س و إزاحة مربع المتوسط كـ Y.Click رسم، مبعثر، تحليل، تركيب، منحنى غير خطي المناسب والحوار المفتوح وتعيين معلمات الرسم البياني. للتحليل الإحصائي متعدد الجسيمات، قم بتعيين المعلمات الديناميكية ذات الاهتمام كـ Y وانقر فوق الرسم والمرسم البياني. انقر نقراً مزدوجاً فوق الرسم البياني لتعيين حجم القسمة أو عدد الأقسام وانقر فوق تطبيق.ثم أضف عموداً وقم بتعيين معلمات الرسم البياني. لتحليل سلسلة زمنية، تعيين الوقت كـ X ومعلمات سلسلة الوقت كـ Y.Click رسم، متعددة الأجزاء، وكومة. في النافذة المنبثقة، حدد سطرًا و موافق. ثم قم بتعيين المعلمات للرسم البياني.الحد الأقصى البلازمي الطولي من 40 من قبل 85 نانومتر CTAB مطلية الذهب نانورودس هو ما يقرب من 650 نانومتر والرنين عرضية هو 520 نانومتر. كثافة التشتت من نانورود الذهب المغلفة CTAB على أغشية الخلايا U87 يوضح توزيع غاوسي نموذجية مع عرض ضيق يتفق مع ذلك من نانورود الذهب المغلفة CTAB على الزجاج مما يدل على أن نانورود الذهب المغلفة CTAB تتبع في هذه التجربة monodispersed بشكل جيد. وكما هو موضح، يمكن تتبع أكثر من 500 مسار من مسارات النانو ونرود الذهب المغلفة بعلامة التبويب CTAB عن طريق المجهر المظلم ويمكن تقسيمها إلى مسارات انتشار طويلة المدى ومسارات انتشار محدودة.وقد أظهر نصف قطر الـ 500 مسار في هذا التحليل التمثيلي توزيعاً صغيراً للقيمة مع نصف قطر متوسط للمقاييس الـ 0.5 وكان الحد الأقصى للنزوح أكثر توزيعاً على القيم الصغيرة. كما هو موضح في هذا المتوسط الزمني الفرقة متوسط تحليل إزاحة مربع، وCTAB المغلفة نانورود الذهب تنتشر عادة مع ألفا من واحد تقريبا. توزيع كثافة معامل الانتشار ألفا التي تم الحصول عليها من جميع المسارات، ومع ذلك، يكشف أن دينامية نانورود الذهب معارض توزيع غير متجانسة مع superdiffusion، براونيان، والحركات تحت درجة.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التحليل الإحصائي للجسيمات الواحدة وتحليل بارامترات السلسلة الزمنية لتوصيف مسارين تمثيليين محصورين ومتحركين على المدى الطويل. من الضروري تلخيص واستخراج تفسير جديد واحد للبيانات من قراءة تحليل تتبع الجسيمات الواحدة حيث توجد عادة بعض المقايضات الصعبة التي يجب القيام بها.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

قياسات الحويصلية واحد للدراسة لضخ البروتون غشاء الإنزيمات تستخدم كهربية ومجهر فلوري

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

منصة غشاء نموذج لإعادة تشكيل ديناميات غشاء الميتوكوندريا

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...