Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China med tilskud på 21425519, 91853105 og 21621003.

1. Cellekultur
<ol><li>Forbered komplet medium til U87 MG-celler ved at tilsætte føtalt kvægserum (endelig koncentration 10%) og penicillin-streptomycin (endelig koncentration 1%) til det essentielle minimumsmedium (MEM). Brug plast cellekultur parabol for celler subkultur.</li>
	<li>Passage celler 2 til 3 gange om ugen.<ol>
<li>Fjern dyrkningsmediet, og skyl cellelaget med Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS) 2~3 gange, når det er sammenflydende (80%~90%).</li>
		<li>Der tilsættes 1,0 til 2,0 ml Trypsin-EDT...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Den præsenterede protokol bruges til at studere dynamikken i AuNR'er på cellemembran. Protokollen består af fire dele, herunder mikroskopisk billeddannelse, dataudtræk, dynamisk parameterberegning og dataanalysemetoder, og hver del er fleksibel og universel. Derfor er der mange mulige fremtidige anvendelser, for eksempel at studere flytning af NP-forbundne membranmolekyler på membran, endokytosedynamik af NP-mærkede receptorer, dynamisk analyse af intracellulære NPs og vesikelbelagte NPs transport langs mikrotubul...

Dynamikken i nanopartikler (NPs) på membranen er tæt forbundet med den cellulære optagelsesproces, hvilket er afgørende for forståelsen af cellefunktioner, virale eller bakterielle infektioner og udviklingen af kunstige nanomedicinske leveringssystemer1,2. SPT-teknik (Single Particle Tracking) er et robust værktøj til at karakterisere NPs3,4' heterogene adfærd. Generelt er cellemembran flydende, hvilket betyder, at komponenterne som proteiner og lipider kan bevæge sig sideværts i plasmamembranplanet5,6,7. Den spatiotemporale kompleksitet af membran organisation og struktur kan føre til spatiotemporal heterogenitet af samspillet mellem NPs og membran. Derfor kræver direkte visualisering af NPs bevægelse på membranen både høj rumlig og tidsmæssig opløsning.
Enkelt partikelsporing mikroskopi, der overvåger lokaliseringen af individuelle partikler i levende celler med en rumlig opløsning af snesevis af nanometer og en tidsopløsning på millisekunder er blevet veludviklet til at studere NPs eller membranmolekyler dynamik8,9. Fluorescensbaserede mikroskopiske billeddannelsesteknikker er blevet værdifulde værktøjer til observation af NPs/molekyler i levende cellemiljø9,10,11,12. For eksempel, total intern refleksion fluorescens mikroskopi, som billeder tynde lag (~ 100 nm) af prøven på substratet / opløsning interface med en høj spatiotemporal opløsning har været meget udbredt i undersøgelser af membran molekyler dynamik13,14. De iboende ulemper ved enkelte fluorophorer, såsom lav intensitet og hurtig irreversibel fotobleaching, reducerer imidlertid nøjagtigheden og varigheden af sporing13. Derfor har ikke-fluorescerende plasmoniske NPs, som erstatter fluorescerende sonder, tiltrukket mere og mere opmærksomhed i langsigtede billeddiagnostiske undersøgelser på grund af deres unikke optiske egenskaber15. Baseret på spredningssignaler fra plasmoniske NP-sonder er der anvendt flere former for optisk mikroskopiske billeddannelsesteknologier til at studere mekanismen for biologiske processer, såsom mikroskopi i mørke felter (DFM)16, interferometrisk spredning (iSCAT) mikroskopi17 og differentialinterferenskonsekvensmikroskopi (DICM)18. Derudover kan bevægelses- og rotationsdynamikken i AuNR'er opnås ved hjælp af DFM og DICM18,19,20,21,22. I et SPT-eksperiment registreres objektets bevægelse typisk af det optiske mikroskop og analyseres derefter ved SPT-analysemetoder3. De tidsløste baner og orienteringsvinkler, der genereres af individuelle NPs, er normalt stokastiske og heterogene, så det er nødvendigt at præsentere rigelige dynamiske oplysninger med forskellige analysemetoder.
Her leverer vi en integreret protokol, der overvåger dynamikken i AuNR'er på cellemembran ved hjælp af DFM, udtrækker placeringen og orienteringen af AuNR'er med ImageJ og MATLAB og karakteriserer udbredelsen af AuNR'er med SPT-analysemetoder. Som en demonstration viser vi her, hvordan man bruger SPT-protokollen til at visualisere dynamikken i uændrede AuNRs (CTAB-AuNRs, syntetiseret af cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyle som beskyttelsesmiddel) på U87 MG cellemembran. Det er blevet påvist, at CTAB-AuNRs kan adsorbere proteiner i biologisk miljø, bevæge sig på cellemembran og derefter indtaste celler2,20,22. U87 MG-celle er den mest almindelige og mest ondartede tumor i centralnervesystemet, og dens membranreceptorer udtrykkes unormalt. Membranreceptorerne kan interagere med proteiner på AuNR'er, hvilket påvirker auNR'ernes dynamik. Vores protokol gælder generelt for andre SPT-eksperimenter inden for biologi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Analyse af nanopartiklers diffusionsdynamik på cellemembran spiller en væsentlig rolle i en bedre forståelse af den cellulære optagelsesproces og giver et teoretisk grundlag for det rationelle design af nanomedicinsk levering. Enkelt partikelsporing (SPT) analyse kunne sonde placeringen og orienteringen af de enkelte nanopartikler på cellemembran, og afsløre deres translationelle og roterende tilstande. Her viser vi, hvordan man bruger traditionel mørkfeltmikroskopi til at overvåge dynamikken i guld nanorods (AuNRs) på levende cellemembran. Vi viser også, hvordan man udtrækker placeringen og orienteringen af AuNR'er ved hjælp af ImageJ og MATLAB, og hvordan man karakteriserer auNR'ernes forskellige tilstande. Statistisk analyse af hundredvis af partikler viser, at enkelte AuNR'er udfører Brownian bevægelse på overfladen af U87 MG cellemembran. Men individuelle lange baneanalyser viser, at AuNR'er har to tydeligt forskellige typer bevægelsestilstande på membranen, nemlig langtrækkende transport og indespærring i begrænset område. Vores SPT-metoder kan potentielt bruges til at studere overfladen eller intracellulær partikelspredning i forskellige biologiske celler og kan blive et kraftfuldt værktøj til undersøgelser af komplekse cellulære mekanismer.

I protokollen blev de uændrede 40 x 85 nm CTAB-AuNR'er brugt. Som det fremgår af figur 2B, er dets højde for plasmonisk længde på ~650 nm (rød region), og den tværgående resonans er på 520 nm (grøn region). Tidligere litteratur har afsløret, at de optiske egenskaber (såsom LSPR intensitet) af plasmoniske AuNRs vil ændre sig betydeligt med deres diameter20,22. I figur 2Cviste spredningsintens...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Her viser vi brugen af traditionel mørkfeltmikroskopi til at overvåge dynamikken i guld nanorods (AuNRs) på cellemembran. Placeringen og retningen af enkelte AuNR'er registreres ved hjælp af ImageJ og MATLAB, og auNR'ernes diffusive tilstande er kendetegnet ved enkelt partikelsporingsanalyse.

Visualisering af Diffusional Dynamics of Gold Nanorods på cellemembran ved hjælp af Single Nanoparticle Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Vores protokol bruger enkelt partikelkontrolanalyse til at overvåge dynamikken placering og orientering og karakteriserer udbredelsen af gyldne nanorods på cellemembraner. Ved hjælp af denne metode kan både translationel og rotationsdynamik af gyldne nanorods opnås, og dynamikken kan analyseres grundigt og præsenteres. Denne protokol har potentiale til at blive brugt til undersøgelse af andre typer komplekse biologiske systemer.Begynd med at brænde en ethanol dyppet glas coverlip på flammen og placere coverslip i en 35 af 10 millimeter cellekultur parabol indeholder to milliliter cellekultur medium uden phenol rød. Tilsæt 50 mikroliter af celleaffjedringen af interesse på coverlip og ryst forsigtigt skålen frem og tilbage og til venstre og højre for at fordele cellerne jævnt. Placer skålen i cellekulturinkubatoren i ca. 12 timer, indtil cellerne når 20 til 40%sammenløb, før der tilsættes 20 mikroliter CTAB belagt guld nanorods til skålen.Efter blid rysten for at sprede nanorods jævnt over fadet, skal du placere skålen i en befugtet atmosfære i fem minutter. I slutningen af inkubationen overføres langsomt 100 mikroliter supernatant fra skålen til rillen på en glasrutsjebane og placerer forsigtigt coverlip-cellesiden ned på gliderillen, forsegler derefter kanten af dækslet med neglelak og lader neglelakken tørre, før du placerer diaset på darkfield mikroskopstadiet. For enkelt partikelsporing ved darkfield mikroskopi, placere en dråbe olie på olien nedsænke darkfield kondensator og drej knappen, indtil kondensatoren kontakter glasset dias.Placer en dråbe olie på toppen af dækglasset og drej fokusknappen, indtil 60X olie nedsænkning mål rører olien. Tænd lyskilden, og drej lidt på fokusknappen for at fokusere billedplanet. Klik derefter på kameraikonet i mikroskopsoftwaren for at optage en eksempelspredningslampebilledtidsserie ved hjælp af CMOS-farvekameraet og gemme billedet i et TIFF-format.Hvis du vil udtrække en enkelt langsigtet bane, skal du åbne billedet i ImageJ og klikke på billede, type og 8-bit for at konvertere billedet fra RGB-tilstand til 8-bit tilstand. Hvis du vil justere kontrasten, skal du klikke på billede, justere, lysstyrkekontrast og angive parametrene. Vælg en målpartikel, og brug Control X til at afskære baggrunden for tidsserierne.Klik på plugins, partikel tracker classic, og partikel tracker at åbne partikel detektion og partikel forbinder vinduet og indstille radius til seks, cutoff til nul, og fraktil til 0,01%Sæt linkområdet til 10 og forskydning til 10 og klik på OK for at åbne partikel tracker resultater vindue for at se resultaterne. Klik på visualiser alle baner for at inspicere de genererede baner. Hvis den software, der genereres bane og den bevægelige bane af guld nanorods matches, skal du klikke gemme fuld rapport for at gemme resultaterne.Hvis den softwaregenererede bane ikke svarer til guld nanorods bevægelige bane, skal du klikke på relinkpartikler for at forbinde de fundne partikler med forskellige linkområde og fraktilparametre. Hvis du vil finde den midterste pixelkoordinat for guld nanorod i hver ramme i henhold til XY-koordinaten, skal du bruge xykoordinationen. m funktion.Hvis du vil afgrænse en matrix på tre og tre pixel, skal du udtrække de ni spredningsintensitetsværdier for de røde eller grønne kanaler og beregne en gennemsnitlig værdi ved at bruge rgextraktionen. m funktion. Brug derefter polaranglen.m til at beregne polarvinklerne ved hjælp af differentialmetoden med to kanaler. Hvis du vil beregne dynamiske parametre ved hjælp af formlerne i tabellen, skal du køre de to analysescripts. Hvis du vil have visuel analyse af bane, skal du indstille X-koordinaten som X, Y-koordinaten som Y og klokkeslættet som Y og derefter klikke på afbildning, punktdiagram og farvekort, angive grafparametrene og tilføje farvelinjen.Hvis du vil generere gennemsnitlige timeintervaltal for firkantet forskydning, skal du angive tidsintervallet som X og den gennemsnitlige kvadratiske forskydning som Y.Click-plot, scatter, analyse, tilpasning, ikke-lineær kurvetilpasning og åben dialog og angive grafparametrene. Til statistisk analyse med flere partikler skal du angive de dynamiske parametre for interesse som Y og klikke på plot og histogram. Dobbeltklik på histogrammet for at angive divisionens størrelse eller antallet af divisioner, og klik på anvend.Tilføj derefter en kolonne, og angiv grafparametrene. I forbindelse med en tidsserieanalyse skal du angive klokkeslættet som X og tidsserieparametrene som Y.Click-afbildning, flerrude og stak. Vælg linje og OK i pop op-vinduet. Angiv derefter parametrene for grafen.Den langsgående plasmoniske maksimum på 40 af 85 nanometer CTAB belagt guld nanorods er ca 650 nanometer og tværgående resonans er 520 nanometer. Spredning intensitet CTAB belagt guld nanorods på U87 cellemembraner viser en typisk gaussisk fordeling med en smal bredde i overensstemmelse med CTAB belagt guld nanorods på glas, der angiver, at CTAB belagt guld nanorods spores i dette eksperiment er godt monodispersed. Som illustreret, mere end 500 CTAB belagt guld nanorod baner kan spores ved darkfield mikroskopi og kan opdeles i langtrækkende diffusion baner og begrænset diffusion baner.Gyrationsradius for alle 500 baner i denne repræsentative analyse viste en fordeling af små værdier med en gennemsnitlig gyrationsradius på 0,5 mikrometer, og den maksimale forskydning var mere fordelt ved små værdier. Som det fremgår af dette ensemble tid gennemsnitlige gennemsnitlige firkantede forskydning analyse, CTAB belagt guld nanorods normalt diffus med en alfa på ca en. Tæthedsfordelingen af diffusionskoefficienten og alfaen opnået fra alle baner afslører imidlertid, at dynamikken i guld nanorods udviser en heterogen fordeling med superdiffusion, Brownian og subdiffusionsbevægelser.Derudover kan enkelt partikel statistisk analyse og tidsserie parameter analyse bruges til at karakterisere to repræsentative langsigtede begrænset og bevægende baner. Det er nødvendigt at opsummere og udtrække en enkelt ny fortolkning af data fra på den enkelte partikelsporing analyse udlæsning, da der typisk er nogle vanskelige kompromiser at gøre.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposom målinger for studiet af Proton-pumpe membran enzymer ved hjælp af elektrokemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

En model membran platform for rekonstituerende Mitokondrielle Membran Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...