Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China met subsidienummers van 21425519, 91853105 en 21621003.

1. Celcultuur
<ol><li>Bereid het volledige medium voor U87 MG-cellen voor door foetaal runderserum toe te voegen (eindconcentratie 10%) en penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%) tot het minimum essentiële medium (MEM). Gebruik plastic cel kweek schotel voor cellen subcultuur.</li>
	<li>Passagecellen 2 tot 3 keer per week.<ol>
<li>Verwijder het kweekmedium en spoel de cellaag af met dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) 2 ~3 keer bij samenvloeiing (80%~90%).</li>
		<li>Voeg 1,0 tot 2,0 ml Trypsine...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol wordt gebruikt om de dynamiek van AuNR's op celmembraan te bestuderen. Het protocol bestaat uit vier delen, waaronder microscopische beeldvorming, gegevensextractie, dynamische parametersberekening en data-analysemethoden, en elk onderdeel is flexibel en universeel. Daarom zijn er veel mogelijke toekomstige toepassingen, bijvoorbeeld het bestuderen van de beweging van NP-gekoppelde membraanmoleculen op membraan, endocytosedynamiek van NP-gelabelde receptoren, dynamische analyse van intracellul...

De dynamiek van nanodeeltjes (NPs) op het membraan is nauw verbonden met het cellulaire opnameproces, wat essentieel is voor het begrip van celfuncties, virale of bacteriële infecties en de ontwikkeling van kunstmatige nanomedische toedieningssystemen1,2. Single particle tracking (SPT) techniek is een robuust hulpmiddel voor het karakteriseren van het heterogene gedrag van NPs3,4. Over het algemeen is celmembraan vloeibaar, wat betekent dat de componenten zoals eiwitten en lipiden zijdelings kunnen bewegen in het plasmamembraanvlak5,6,7. De spatiotemporale complexiteit van membraanorganisatie en -structuur kan leiden tot spatiotemporale heterogeniteit van de interactie tussen NPs en membraan. Daarom vereist directe visualisatie van de beweging van NPs op het membraan zowel een hoge ruimtelijke als temporele resolutie.
Single particle tracking microscopie die de lokalisatie van individuele deeltjes in levende cellen monitort met een ruimtelijke resolutie van tientallen nanometers en een tijdsresolutie van milliseconden is goed ontwikkeld om de NPs of membraanmoleculendynamica8,9te bestuderen . Fluorescentie-gebaseerde microscopische beeldvormingstechnieken zijn waardevolle instrumenten geworden voor het observeren van NPs/moleculen in de leefomgeving9,10,11,12. Bijvoorbeeld, totale interne reflectie fluorescentie microscopie, die dunne lagen (~ 100 nm) van het monster op de substraat / oplossingsinterface met een hoge spatiotemporale resolutie in beeldbrengen,is veel gebruikt in studies naar membraanmoleculendynamiek13,14. De inherente nadelen van enkele fluorforen, zoals lage intensiteit en snelle onomkeerbare fotobleaching, verminderen echter de nauwkeurigheid en duur van tracking13. Daarom hebben niet-fluorescerende plasmonische NPs, die de fluorescerende sondes vervangen, steeds meer aandacht getrokken in langetermijnbeeldvormingsstudies vanwege hun unieke optische kenmerken15. Op basis van de verstrooiingssignalen van plasmonische NP-sondes zijn verschillende soorten optische microscopische beeldvormingstechnologieën gebruikt om het mechanisme van biologische processen te bestuderen, zoals donkerveldmicroscopie (DFM)16,interferometrische verstrooiing (iSCAT) microscopie17 en differentiële interferentiecontrastmicroscopie (DICM)18. Bovendien kan de bewegings - en rotatiedynamiek van AuNRs worden verkregen met behulp van DFM en DICM18,19,20,21,22. Meestal wordt in een SPT-experiment de beweging van het object geregistreerd door de optische microscoop en vervolgens geanalyseerd door SPT-analysemethoden3. De tijdgeopgeleerde trajecten en oriëntatiehoeken die door individuele NPs worden gegenereerd, zijn normaal stochastisch en heterogeen, dus het is noodzakelijk om overvloedige dynamische informatie te presenteren met verschillende analysemethoden.
Hier bieden we een geïntegreerd protocol dat de dynamiek van AuNR's op celmembraan bewaakt met behulp van DFM, de locatie en oriëntatie van AuNR's extraheert met ImageJ en MATLAB en de verspreiding van AuNR's karakteriseert met SPT-analysemethoden. Als demonstratie laten we hier zien hoe we het SPT-protocol kunnen gebruiken om de dynamiek van ongewijzigde AuNR's (CTAB-AuNRs, gesynthetiseerd door cetyltrimethylammonium ammoniumbromidemolecuul als beschermend middel) op U87 MG-celmembraan te visualiseren. Er is aangetoond dat CTAB-AuNRs eiwitten in biologische omgeving kunnen adsorberen, op celmembraan kunnen bewegen en vervolgens cellen2,20,22kunnen binnendringen . U87 MG-cel is de meest voorkomende en meest kwaadaardige tumor van het centrale zenuwstelsel en de membraanreceptoren worden abnormaal uitgedrukt. De membraanreceptoren kunnen interageren met eiwitten op AuNR's, die de dynamiek van AuNR's beïnvloeden. Ons protocol is algemeen toepasbaar op andere SPT experimenten op het gebied van biologie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Het analyseren van de diffusionele dynamiek van nanodeeltjes op het celmembraan speelt een belangrijke rol bij een beter begrip van het cellulaire opnameproces en biedt een theoretische basis voor het rationele ontwerp van de levering van nanogeneeskunde. Single particle tracking (SPT) analyse kan de positie en oriëntatie van individuele nanodeeltjes op celmembraan onderzoeken en hun translationele en rotatietoestanden onthullen. Hier laten we zien hoe we traditionele donkerveldmicroscopie kunnen gebruiken om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op levend celmembraan te monitoren. We laten ook zien hoe u de locatie en oriëntatie van AuNRs extraheren met Behulp van ImageJ en MATLAB, en hoe u de diffusieve statussen van AuNRs karakteriseren. Statistische analyse van honderden deeltjes toont aan dat enkele AuNRs Browniaanse beweging uitvoeren op het oppervlak van U87 MG celmembraan. Individuele longtrajectanalyses tonen echter aan dat AuNR's twee duidelijk verschillende soorten bewegingstoestanden op het membraan hebben, namelijk langeafstandstransport en opsluiting met een beperkt oppervlak. Onze SPT-methoden kunnen mogelijk worden gebruikt om de oppervlakte- of intracellulaire deeltjesdiffusie in verschillende biologische cellen te bestuderen en kunnen een krachtig hulpmiddel worden voor onderzoek naar complexe cellulaire mechanismen.

In het protocol werden de ongewijzigde 40 x 85 nm CTAB-AuNRs gebruikt. Zoals weergegeven in figuur 2B, is het longitudinale plasmonische maximum op ~650 nm (rood gebied) en transversale resonantie op 520 nm (groen gebied). Eerdere literatuur heeft aangetoond dat de optische eigenschappen (zoals LSPR-intensiteit) van plasmonische AuNRs aanzienlijk zullen veranderen met hun diameter20,22. In figuur 2Ctoond...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Hier tonen we het gebruik van traditionele donkerveldmicroscopie om de dynamiek van gouden nanorods (AuNRs) op celmembraan te monitoren. De locatie en oriëntatie van enkele AuNR's worden gedetecteerd met behulp van ImageJ en MATLAB, en de diffusieve toestanden van AuNR's worden gekenmerkt door analyse van het volgen van afzonderlijke deeltjes.

Diffusional Dynamics of Gold Nanorods visualiseren op celmembraan met behulp van Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Ons protocol maakt gebruik van analyse van één deeltjescontrole om de dynamiek van de locatie en de oriëntatie te controleren en karakteriseert de diffusie van gouden nanorods op celmembranen. Met behulp van deze methode kunnen zowel de translationele als de rotatiedynamiek van gouden nanorods worden verkregen en kan de dynamiek volledig worden geanalyseerd en gepresenteerd. Dit protocol kan worden gebruikt voor de studie van andere soorten complexe biologische systemen.Begin met het verbranden van een ethanol gedimde glazen coverslip op de vlam en het plaatsen van de coverslip in een celkweekschaal van 35 bij 10 millimeter met twee milliliter celkweekmedium zonder fenolrood. Voeg 50 microliters van de celsuspensie van belang toe aan de coverslip en schud de schaal voorzichtig heen en weer en links en rechts om de cellen gelijkmatig te verdelen. Plaats de schaal ongeveer 12 uur in de celkweekincubator totdat de cellen 20 tot 40% samenvloeiing bereiken voordat u 20 microliters met CTAB-gecoate gouden nanorods aan de schaal toevoegt.Na zacht schudden om de nanorods gelijkmatig over de schaal te verspreiden, plaatst u de schaal vijf minuten in een bevochtigde atmosfeer. Breng aan het einde van de incubatie langzaam 100 microliters supernatant van de schaal over in de groef van een glazen glijbaan en plaats de coverlipcelzijde voorzichtig naar beneden op de schuifgroef, sluit vervolgens de rand van de afdeklip af met nagellak en laat de nagellak drogen voordat u de dia op de darkfieldmicroscoopfase plaatst. Voor het volgen van enkele deeltjes door middel van darkfield microscopie, plaats een druppel olie op de olie-dompel darkfield condensor en draai aan de knop totdat de condensor contact maakt met de glazen dia.Plaats een druppel olie op de bovenkant van het afdekglas en draai aan de scherpstelknop totdat de 60X olie-onderdompelingsdoelstelling de olie raakt. Schakel de lichtbron in en draai lichtjes aan de scherpstelknop om het beeldvlak scherp te stellen. Klik vervolgens op het camerapictogram in de microscoopsoftware om een voorbeeld op te nemen dat lichtbeeldtijdreeksen verstrooit met behulp van de CMOS-kleurencamera en sla de afbeelding op in een TIFF-indeling.Als u één traject voor de lange termijn wilt extraheren, opent u de afbeelding in ImageJ en klikt u op afbeelding, type en 8-bits om de afbeelding van de RGB-modus naar de 8-bits modus te converteren. Als u het contrast wilt aanpassen, klikt u op afbeelding, past u het helderheidscontrast aan, stelt u de parameters in. Selecteer een doeldeeltje en gebruik Control X om de achtergrond van de tijdreeks af te snijden.Klik op plug-ins, deeltjestracker klassiek en deeltjestracker om het deeltjesdetectie- en deeltjeskoppelingsvenster te openen en stel de straal in op zes, de cutoff op nul en het percentiel op 0,01%Stel het koppelingsbereik in op 10 en de verplaatsing op 10 en klik op OK om het resultatenvenster van de deeltjestracker te openen om de resultaten te zien. Klik op visualiseer alle trajecten om de gegenereerde trajecten te inspecteren. Als het door software gegenereerde traject en het bewegende traject van de gouden nanorods overeenkomen, klikt u op volledig rapport opslaan om de resultaten op te slaan.Als de door software gegenereerde baan niet overeenkomt met de bewegende baan van de gouden nanorods, klikt u op deeltjes opnieuw koppelen om de gedetecteerde deeltjes opnieuw te koppelen aan verschillende verbindingsbereik- en percentielparameters. Gebruik de xycördinatie om de middelste pixelcoördinaat van de gouden nanostang in elk frame volgens de XY-coördinaat te vinden. m functie.Als u een matrix van drie bij drie pixels wilt afbakenen, de negen spreidingsintensiteitswaarden van de rode of groene kanalen wilt extraheren en een gemiddelde waarde wilt berekenen, gebruikt u de rgextractie. m functie. Gebruik dan de polarangle.m functie om de polaire hoeken te berekenen met behulp van de dual channel differentiële methode. Als u dynamische parameters wilt berekenen met behulp van de formules in de tabel, voert u de twee analysescripts uit. Voor visuele analyse van het traject stelt u de X-coördinaat in als X, de Y-coördinaat als Y en de tijd als Y, klikt u vervolgens op plot-, spreidings- en kleurtoewijzing, stelt u de grafiekparameters in en voegt u de kleurbalk toe.Als u tijdsintervalcijfers voor gemiddelde vierkante verplaatsing wilt genereren, stelt u het tijdsinterval in als X en de gemiddelde vierkante verplaatsing als Y.Click plot, scatter, analysis, fitting, nonlinear curve fitting en open dialogue en stelt u de grafiekparameters in. Voor statistische analyse met meerdere deeltjes stelt u de dynamische parameters van belang in als Y en klikt u op plot en histogram. Dubbelklik op het histogram om de delingsgrootte of het aantal divisies in te stellen en klik op toepassen.Voeg vervolgens een kolom toe en stel de grafiekparameters in. Stel voor een tijdreeksanalyse de tijd in als X en de tijdreeksparameters als Y.Click plot, multi-pane en stack. Selecteer regel en OK in het pop-upvenster. Stel vervolgens de parameters voor de grafiek in.Het longitudinale plasmonische maximum van 40 bij 85 nanometer CTAB gecoate gouden nanorods is ongeveer 650 nanometer en de transversale resonantie is 520 nanometer. De strooiintensiteit van de MET CTAB gecoate gouden nanorods op U87-celmembranen toont een typische Gaussiaanse verdeling met een smalle breedte die overeenkomt met die van CTAB-gecoate gouden nanorods op glas, wat aangeeft dat CTAB-gecoate gouden nanorods die in dit experiment worden gevolgd, goed gemonodispergeerd zijn. Zoals geïllustreerd, kunnen meer dan 500 CTAB gecoate gouden nanorod trajecten worden gevolgd door darkfield microscopie en kunnen worden onderverdeeld in diffusietrajecten op lange afstand en beperkte diffusietrajecten.De straal van gyratie van alle 500 trajecten in deze representatieve analyse toonde een kleine waardeverdeling met een gemiddelde straal van gyratie van 0,5 micrometer en de maximale verplaatsing was meer verdeeld bij kleine waarden. Zoals aangetoond in deze ensembletijdgemiddelde gemiddelde vierkante verplaatsingsanalyse, diffunderen de CTAB gecoate gouden nanorods normaal gesproken met een alfa van ongeveer één. De dichtheidsverdeling van de diffusiecoëfficiënt en de alfa verkregen uit alle trajecten, onthult echter dat de dynamiek van de gouden nanorods een heterogene verdeling vertoont met superdiffusion, Brownian en subdiffusion bewegingen.Bovendien kunnen statistische analyse van één deeltje en tijdreeksparameteranalyse worden gebruikt om twee representatieve beperkte en bewegende trajecten op lange termijn te karakteriseren. Het is noodzakelijk om een enkele nieuwe interpretatie van gegevens samen te vatten en te extraheren uit de analyse-uitlezing van de analyse van één deeltje, omdat er meestal enkele moeilijke afwegingen moeten worden gemaakt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...