Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China avec des subventions de 21425519, 91853105 et 21621003.

1. Culture cellulaire
<ol><li>Préparer un milieu complet pour les cellules U87 MG en ajoutant le sérum bovin fœtal (concentration finale 10%) et pénicilline-streptomycine (concentration finale 1%) au milieu essentiel minimum (MEM). Utilisez un plat de culture cellulaire en plastique pour la sous-culture cellulaire.</li>
	<li>Cellules de passage 2 à 3 fois par semaine.<ol>
<li>Retirez le milieu de culture et rincez la couche cellulaire avec la solution saline tamponnée de phosphate (D-PBS) de Dulbecco 2~3 fois lor...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Le protocole présenté est utilisé pour étudier la dynamique des AuNRs sur la membrane cellulaire. Le protocole se compose de quatre parties, y compris l’imagerie microscopique, l’extraction de données, le calcul des paramètres dynamiques et les méthodes d’analyse des données, et chaque partie est flexible et universelle. Par conséquent, il existe de nombreuses applications futures possibles, par exemple, l’étude du mouvement des molécules membranaires liées à la PN sur la membrane, la dynamique endoc...

La dynamique des nanoparticules (PN) sur la membrane est étroitement associée au processus d’absorption cellulaire, qui est essentiel à la compréhension des fonctions cellulaires, des infections virales ou bactériennes et au développement de systèmes artificiels de livraison nanomédicale1,2. La technique de suivi des particules simples (SPT) est un outil robuste pour caractériser les comportements hétérogènes desPN 3,4. En général, la membrane cellulaire est fluide, ce qui signifie que les composants tels que les protéines et les lipides peuvent se déplacer latéralement dans le plan de la membraneplasmatique 5,6,7. La complexité spatiotemporal de l’organisation et de la structure de membrane peut mener à l’hétérogénéité spatiotemporal de l’interaction entre NPs et membrane. Par conséquent, la visualisation directe du mouvement des PN sur la membrane nécessite à la fois une résolution spatiale et temporelle élevée.
La microscopie de suivi des particules individuelles qui surveille la localisation des particules individuelles dans les cellules vivantes avec une résolution spatiale de dizaines de nanomètres et une résolution de temps de millisecondes a été bien développée pour étudier les SNP ou la dynamique des molécules membranaires8,9. Les techniques d’imagerie microscopique à base de fluorescence sont devenues des outils précieux pour l’observation des PN/molécules dans le milieu cellulairevivant 9,10,11,12. Par exemple, la microscopie totale de fluorescence de réflexion interne, qui images couches minces (~100 nm) de l’échantillon à l’interface substrat/solution avec une résolution spatiotemporal élevée a été employée couramment dans des études de la dynamique de molécules de membrane13,14. Cependant, les inconvénients inhérents des fluorophores simples, tels que la faible intensité et le photobleaching irréversible rapide réduisent la précision et la durée du suivi13. Par conséquent, les PN plasmoniques non fluorescents, qui remplacent les sondes fluorescentes, ont attiré de plus en plus l’attention dans les études d’imagerie à long terme en raison de leurs caractéristiques optiques uniques15. Sur la base des signaux de diffusion des sondes plasmoniques de PN, plusieurs types de technologies optiques d’imagerie microscopique ont été utilisés pour étudier le mécanisme des processus biologiques, tels que la microscopie des champs sombres (DFM)16,la microscopie interférométrique de diffusion (iSCAT)17 et la microscopie différentielle de contraste d’interférence (DICM)18. En outre, la dynamique de mouvement et de rotation des AuNRs peut être obtenue à l’aide de DFM et DICM18,19,20,21,22. En règle générale, dans une expérience SPT, le mouvement de l’objet est enregistré par le microscope optique, puis analysé par les méthodes d’analyse SPT3. Les trajectoires et les angles d’orientation résolus dans le temps générés par les PN individuels sont normalement stochastiques et hétérogènes, il est donc nécessaire de présenter des informations dynamiques abondantes avec diverses méthodes d’analyse.
Ici, nous fournissons un protocole intégré qui surveille la dynamique des aunrs sur la membrane cellulaire à l’aide de DFM, extrait l’emplacement et l’orientation des AuNRs avec ImageJ et MATLAB et caractérise la diffusion des AuNRs avec des méthodes d’analyse SPT. En démonstration, nous montrons ici comment utiliser le protocole SPT pour visualiser la dynamique des AuNRs non modifiés (CTAB-AuNRs, synthétisés par la molécule de bromure d’ammonium de cetyltriméthylammonium comme agent protecteur) sur la membrane cellulaire U87 MG. Il a été démontré que les CTAB-AuNRs peuvent adsorb protéines dans l’environnement biologique, se déplacer sur la membrane cellulaire, puis entrer dansles cellules 2,20,22. La cellule U87 MG est la tumeur la plus commune et la plus maligne du système nerveux central, et ses récepteurs membranaires sont anormalement exprimés. Les récepteurs membranaires peuvent interagir avec les protéines des AuNR, qui influencent la dynamique des AuNRs. Notre protocole s’applique généralement à d’autres expériences SPT dans le domaine de la biologie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

L’analyse de la dynamique de diffusion des nanoparticules sur la membrane cellulaire joue un rôle important dans une meilleure compréhension du processus d’absorption cellulaire et fournit une base théorique pour la conception rationnelle de la livraison de nanomédication. L’analyse du suivi unique des particules (SPT) pourrait sonder la position et l’orientation des nanoparticules individuelles sur la membrane cellulaire et révéler leurs états translationnels et de rotation. Ici, nous montrons comment utiliser la microscopie traditionnelle en champ sombre pour surveiller la dynamique des nanorods d’or (AuNRs) sur la membrane cellulaire vivante. Nous montrons également comment extraire l’emplacement et l’orientation des AuNR à l’aide d’ImageJ et matlab, et comment caractériser les états diffusifs des AuNRs. L’analyse statistique de centaines de particules montre qu’un seul AuNRs effectue le mouvement brownien à la surface de la membrane cellulaire U87 MG. Toutefois, l’analyse individuelle à longue trajectoire montre que les AuNR ont deux types d’états de mouvement distinctement différents sur la membrane, à savoir le transport à longue portée et l’enfermement à zone limitée. Nos méthodes de SPT peuvent être potentiellement utilisées pour étudier la diffusion des particules de surface ou intracellulaires dans différentes cellules biologiques et peuvent devenir un outil puissant pour l’étude de mécanismes cellulaires complexes.

Dans le protocole, les 40 x 85 nm CTAB-AuNRs non modifiés ont été utilisés. Comme le montre la figure 2B,son maximum plasmonique longitudinal est d’environ 650 nm (région rouge) et la résonance transversale est de 520 nm (région verte). Les littératures précédentes ont indiqué que les propriétés optiques (telles que l’intensité de LSPR) des AuNRs plasmoniques changeront sensiblement avec leurdiamètre 20,22. Dans <s...

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Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Ici, nous montrons l’utilisation de la microscopie traditionnelle en champ sombre pour surveiller la dynamique des nanorods d’or (AuNRs) sur la membrane cellulaire. L’emplacement et l’orientation des aunrs simples sont détectés à l’aide d’ImageJ et de MATLAB, et les états diffusifs des AuNRs sont caractérisés par une analyse unique du suivi des particules.

Visualisation de la dynamique diffusionnelle des nanorods d’or sur la membrane cellulaire à l’aide d’une microscopie darkfield nanoparticule unique

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Notre protocole utilise une seule analyse de vérification des particules pour surveiller la dynamique de l’emplacement et de l’orientation et caractérise la diffusion de nanorods dorés sur les membranes cellulaires. En utilisant cette méthode, la dynamique translationnelle et la dynamique de rotation des nanorods dorés peuvent être obtenues et la dynamique peut être analysée de manière exhaustive et présentée. Ce protocole a le potentiel d’être utilisé pour l’étude d’autres types de systèmes biologiques complexes.Commencez par brûler un couvercle en verre trempé à l’éthanol sur la flamme et placez le coverslip dans un plat de culture cellulaire de 35 x 10 millimètres contenant deux millilitres de milieu de culture cellulaire sans rouge phénol. Ajouter 50 microlitres de la suspension cellulaire d’intérêt sur le coverslip et secouer doucement le plat d’avant en arrière et à gauche et à droite pour répartir uniformément les cellules. Placer le plat dans l’incubateur de culture cellulaire pendant environ 12 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 20 à 40% de confluence avant d’ajouter 20 microlitres de nanorods d’or enduits CTAB au plat.Après avoir secoué doucement pour disperser les nanorods uniformément à travers le plat, placez le plat dans une atmosphère humidifiée pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, transférer lentement 100 microlitres de surnatant du plat dans la rainure d’une glissière de verre et placer soigneusement le côté de la cellule coverslip vers le bas sur la rainure de diapositives, puis sceller le bord de la couverture avec du vernis à ongles et laisser sécher le vernis à ongles avant de placer la diapositive sur le stade du microscope darkfield. Pour le suivi d’une seule particule par microscopie darkfield, placez une goutte d’huile sur l’huile immerger condenseur darkfield et tourner le bouton jusqu’à ce que le condenseur entre en contact avec la glissière de verre.Placer une goutte d’huile sur le dessus du verre de couverture et tourner le bouton de mise au point jusqu’à ce que l’objectif d’immersion d’huile 60X touche l’huile. Allumez la source lumineuse et tournez légèrement le bouton de mise au point pour concentrer le plan d’imagerie. Cliquez ensuite sur l’icône de l’appareil photo dans le logiciel microscope pour enregistrer un échantillon dispersant des séries de temps d’image lumineuse à l’aide de la caméra CMOS couleur et enregistrer l’image dans un format TIFF.Pour extraire une seule trajectoire à long terme, ouvrez l’image en ImageJ et cliquez sur l’image, tapez et 8 bits pour convertir l’image du mode RVB en mode 8 bits. Pour ajuster le contraste, cliquez sur l’image, ajustez, contrastez la luminosité et définissez les paramètres. Sélectionnez une particule cible et utilisez le contrôle X pour couper l’arrière-plan de la série de temps.Cliquez sur plugins, tracker de particules classique, et tracker de particules pour ouvrir la détection des particules et la fenêtre de liaison des particules et définir le rayon à six, la coupure à zéro, et le percentile à 0,01%Réglez la plage de lien à 10 et le déplacement à 10 et cliquez sur OK pour ouvrir la fenêtre de résultats tracker particules pour voir les résultats. Cliquez sur visualiser toutes les trajectoires pour inspecter les trajectoires générées. Si la trajectoire générée par le logiciel et la trajectoire mobile des nanorods d’or sont appariées, cliquez sur enregistrer le rapport complet pour enregistrer les résultats.Si la trajectoire générée par le logiciel ne correspond pas à la trajectoire mobile des nanorods d’or, cliquez sur reconnecter les particules pour reconnecter les particules détectées avec différentes plages de liaison et paramètres percentiles. Pour trouver la coordonnée du pixel central de la nanorod d’or dans chaque image selon la coordonnée XY, utilisez la xycoordination. fonction m.Pour délimiter une matrice de trois par trois pixels, extraire les neuf valeurs d’intensité de diffusion des canaux rouges ou verts et calculer une valeur moyenne, utiliser la rgextraction. fonction m. Ensuite, utilisez le polarangle.m pour calculer les angles polaires à l’aide de la méthode différentielle à double canal. Pour calculer les paramètres dynamiques à l’aide des formules de la table, exécutez les deux scripts d’analyse. Pour l’analyse visuelle de la trajectoire, définissez la coordonnée X comme X, la coordonnée Y comme Y, et l’heure comme Y, puis cliquez sur l’intrigue, la dispersion et la carte des couleurs, définissez les paramètres graphiques et ajoutez la barre de couleur.Pour générer des figures d’intervalle de temps de déplacement carré moyen, définissez l’intervalle de temps comme X et le déplacement carré moyen sous forme de diagramme Y.Click, dispersez, analysez, adaptez, raccordez, raccordez la courbe non linéaire et ouvrez le dialogue et définissez les paramètres graphiques. Pour l’analyse statistique multiparticule, définissez les paramètres dynamiques d’intérêt comme Y et cliquez sur l’intrigue et l’histogramme. Double-cliquez sur l’histogramme pour définir la taille de la division ou le nombre de divisions et cliquez sur appliquer.Ajoutez ensuite une colonne et définissez les paramètres graphiques. Pour une analyse de série de temps, définissez l’heure comme X et les paramètres de la série de temps comme y.click plot, multi-pane, et stack. Dans la fenêtre popup, sélectionnez la ligne et OK. Définissez ensuite les paramètres du graphique.Le maximum plasmonique longitudinal de 40 par 85 nanomètres de nanorods d’or enduits de CTAB est d’environ 650 nanomètres et la résonance transversale est de 520 nanomètres. L’intensité de diffusion des nanorods d’or enduits CTAB sur les membranes cellulaires U87 démontre une distribution gaussienne typique avec une largeur étroite compatible avec celle des nanorods d’or enduits CTAB sur verre indiquant que les nanorods d’or enduits CTAB suivis dans cette expérience sont bien monodispersés. Comme il est illustré, plus de 500 trajectoires nanorod en or enduites de CTAB peuvent être suivies par microscopie darkfield et peuvent être divisées en trajectoires de diffusion à longue portée et trajectoires de diffusion confinées.Le rayon de gyration des 500 trajectoires de cette analyse représentative a montré une petite distribution de valeur avec un rayon moyen de gyration de 0,5 micromètre et le déplacement maximum était plus réparti à de petites valeurs. Comme l’a démontré cette analyse moyenne du déplacement carré moyen du temps d’ensemble, les nanorods d’or enduits de CTAB se diffusent normalement avec un alpha d’environ un. La répartition de la densité du coefficient de diffusion et de l’alpha obtenu à partir de toutes les trajectoires, cependant, révèle que la dynamique des nanorods d’or présente une distribution hétérogène avec des mouvements de superdiffusion, brownien et subdiffusion.En outre, l’analyse statistique des particules individuelles et l’analyse des paramètres des séries de temps peuvent être utilisées pour caractériser deux trajectoires confinées et mobiles représentatives à long terme. Il est nécessaire de résumer et d’extraire une interprétation unique et nouvelle des données de la lecture de l’analyse de suivi des particules unique, car il y a généralement des compromis difficiles à faire.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Recherche

Biochimie

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