Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China mit den Fördernummern 21425519, 91853105 und 21621003 unterstützt.

1. Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie ein komplettes Medium für U87 MG-Zellen vor, indem Sie fetales Rinderserum hinzufügen (Endkonzentration 10%) und Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1%) auf das minimale wesentliche Medium (MEM). Verwenden Sie Kunststoff-Zellkulturschale für Zellen Subkultur.</li>
	<li>Durchgangszellen 2 bis 3 Mal pro Woche.<ol>
<li>Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellschicht mit der phosphatgepufferten Saline (D-PBS) von Dulbecco 2-3 mal, wenn sie konfluent ist (80 % bis 9...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um die Dynamik von AuNRs auf Zellmembran zu untersuchen. Das Protokoll besteht aus vier Teilen, einschließlich mikroskopischer Bildgebung, Datenextraktion, Berechnung dynamischer Parameter und Datenanalysemethoden, und jedes Teil ist flexibel und universell. Daher gibt es viele mögliche zukünftige Anwendungen, zum Beispiel die Untersuchung der Bewegung von NP-verknüpften Membranmolekülen auf der Membran, endozytose Dynamik von NP-markierten Rezeptoren, dynamische Analyse vo...

Die Dynamik von Nanopartikeln (NPs) auf der Membran ist eng mit dem zellulären Aufnahmeprozess verbunden, der für das Verständnis von Zellfunktionen, viralen oder bakteriellen Infektionen und der Entwicklung künstlicher nanomedizinischer Abgabesysteme1,2wesentlich ist. Die Single-Partikel-Tracking-Technik (SPT) ist ein robustes Werkzeug zur Charakterisierung des heterogenen Verhaltens von NPs3,4. Im Allgemeinen ist die Zellmembran flüssig, was bedeutet, dass sich die Komponenten wie Proteine und Lipide seitlich in der Plasmamembranebene5,6,7bewegen können. Die räumlich zeitliche Komplexität der Membranorganisation und -struktur kann zu einer raumzeitlichen Heterogenität der Interaktion zwischen NPs und Membran führen. Daher erfordert die direkte Visualisierung der Bewegung von NPs auf der Membran sowohl eine hohe räumliche als auch zeitliche Auflösung.
Die Einzelpartikel-Tracking-Mikroskopie, die die Lokalisierung einzelner Teilchen in lebenden Zellen mit einer räumlichen Auflösung von zig Nanometern und einer Zeitauflösung von Millisekunden überwacht, wurde gut entwickelt, um die Dynamik von NPs oder Membranmolekülen zu untersuchen8,9. Fluoreszenzbasierte mikroskopische Bildgebungstechniken sind zu wertvollen Werkzeugen für die Beobachtung von NPs/Molekülen in lebenden Zellumgebungen9,10,11,12. Zum Beispiel wurde die gesamte interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie, die dünne Schichten (ca. 100 nm) der Probe an der Substrat-/Lösungsschnittstelle mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung abbildt, in Studien der Membranmoleküldynamik13,14weit verbreitet eingesetzt. Die inhärenten Nachteile einzelner Fluorophore, wie niedrige Intensität und schnelle irreversible Photobleichung, reduzieren jedoch die Genauigkeit und Dauer der Verfolgung13. Daher haben nichtfluoreszierende Plasmononische NPs, die die fluoreszierenden Sonden ersetzen, aufgrund ihrer einzigartigen optischen Eigenschaften immer mehr Aufmerksamkeit in Langzeit-Bildgebungsstudien erregt15. Basierend auf den Streusignalen von plasmonischen NP-Sonden wurden verschiedene Arten von optischen mikroskopischen Bildgebungstechnologien verwendet, um den Mechanismus biologischer Prozesse zu untersuchen, wie z. B. Die Dunkelfeldmikroskopie (DFM)16, die interferometrische Streuung (iSCAT) Mikroskopie17 und die Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DICM)18. Darüber hinaus kann die Bewegungs- und Rotationsdynamik von AuNRs mit DFM und DICM18,19,20,21,22erhalten werden. In der Regel wird in einem SPT-Experiment die Bewegung des Objekts vom optischen Mikroskop aufgezeichnet und dann mit SPT-Analysemethoden3analysiert. Die zeitaufgelösten Bahnen und Orientierungswinkel, die von einzelnen NPs erzeugt werden, sind normalerweise stochastisch und heterogen, so dass es notwendig ist, reichlich dynamische Informationen mit verschiedenen Analysemethoden darzustellen.
Hier bieten wir ein integriertes Protokoll, das die Dynamik von AuNRs auf Zellmembran mit DFM überwacht, die Position und Ausrichtung von AuNRs mit ImageJ und MATLAB extrahiert und die Diffusion von AuNRs mit SPT-Analysemethoden charakterisiert. Als Demonstration zeigen wir hier, wie man das SPT-Protokoll verwendet, um die Dynamik von unveränderten AuNRs (CTAB-AuNRs, synthetisiert durch Cetyltrimethylammoniumammoniumbromidmolekül als Schutzmittel) auf der U87 MG-Zellmembran zu visualisieren. Es wurde gezeigt, dass CTAB-AuNRs Proteine in biologischer Umgebung adsorbieren, sich auf der Zellmembran bewegen und dann in Zellen2,20,22eindringen können. U87 MG-Zelle ist der häufigste und bösartigste Tumor des zentralen Nervensystems, und seine Membranrezeptoren sind ungewöhnlich exprimiert. Die Membranrezeptoren können mit Proteinen auf AuNRs interagieren, die die Dynamik von AuNRs beeinflussen. Unser Protokoll ist allgemein auf andere SPT-Experimente auf dem Gebiet der Biologie anwendbar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Die Analyse der Diffusionsdynamik von Nanopartikeln auf der Zellmembran spielt eine wichtige Rolle für ein besseres Verständnis des zellulären Aufnahmeprozesses und bietet eine theoretische Grundlage für die rationale Gestaltung der Nanomedizin-Entbindung. Die Einzelpartikelverfolgungsanalyse (SPT) könnte die Position und Ausrichtung einzelner Nanopartikel auf der Zellmembran untersuchen und deren Translations- und Rotationszustände aufzeigen. Hier zeigen wir, wie sie die traditionelle Dunkelfeldmikroskopie nutzt, um die Dynamik von Gold-Nanostäben (AuNRs) auf der lebenden Zellmembran zu überwachen. Wir zeigen auch, wie Sie die Position und Ausrichtung von AuNRs mit ImageJ und MATLAB extrahieren und die diffusiven Zustände von AuNRs charakterisieren. Die statistische Analyse von Hunderten von Partikeln zeigt, dass einzelne AuNRs Brownsche Bewegungen auf der Oberfläche der U87 MG-Zellmembran durchführen. Die individuelle Langzeitanalyse zeigt jedoch, dass AuNRs zwei deutlich unterschiedliche Arten von Bewegungszuständen auf der Membran aufweisen, nämlich Langstreckentransport und ein begrenztes Gebiet. Unsere SPT-Methoden können potenziell verwendet werden, um die Oberflächen- oder intrazelluläre Partikeldiffusion in verschiedenen biologischen Zellen zu untersuchen und kann zu einem leistungsfähigen Werkzeug für Untersuchungen komplexer zellulärer Mechanismen werden.

Im Protokoll wurden die unveränderten 40 x 85 nm CTAB-AuNRs verwendet. Wie in Abbildung 2Bdargestellt, liegt sein Längsplasmamaximum bei 650 nm (roter Bereich) und die Querresonanz bei 520 nm (grüner Bereich). Frühere Literaturen haben gezeigt, dass sich die optischen Eigenschaften (wie die LSPR-Intensität) von plasmonischen AuNRs mit ihrem Durchmesser20,22signifikant verändern werden. In Abbildung 2C</stro...

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Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Hier zeigen wir den Einsatz der traditionellen Dunkelfeldmikroskopie zur Überwachung der Dynamik von Gold-Nanostäben (AuNRs) auf der Zellmembran. Die Position und Ausrichtung einzelner AuNRs wird mit ImageJ und MATLAB erkannt, und die diffusiven Zustände von AuNRs sind durch eine einzelfaktnverfolgte Analyse gekennzeichnet.

Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Unser Protokoll verwendet eine Einzelpartikel-Prüfanalyse, um die Dynamik der Position und der Ausrichtung zu überwachen und charakterisiert die Diffusion von goldenen Nanostäben auf Zellmembranen. Mit dieser Methode können sowohl die translationale als auch die Rotationsdynamik von goldenen Nanostäben erhalten und die Dynamik umfassend analysiert und präsentiert werden. Dieses Protokoll hat das Potenzial, für die Untersuchung anderer Arten komplexer biologischer Systeme verwendet zu werden.Beginnen Sie mit dem Verbrennen eines Ethanol-Getauchtglasdeckels auf der Flamme und legen Sie den Deckelin in eine 35 mal 10 Millimeter große Zellkulturschale, die zwei Milliliter Zellkulturmedium ohne Phenolrot enthält. Fügen Sie 50 Mikroliter der zellgefederten Federung von Interesse auf den Deckelrutsch und schütteln Sie die Schale sanft hin und her und links und rechts, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Legen Sie die Schale für ca. 12 Stunden in den Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen 20 bis 40 % Konfluenz erreichen, bevor Sie 20 Mikroliter CTAB-beschichtete Gold-Nanostäbe in die Schale geben.Nach sanftem Schütteln, um die Nanostäbe gleichmäßig über die Schale zu verteilen, legen Sie das Gericht für fünf Minuten in eine befeuchtete Atmosphäre. Am Ende der Inkubation 100 Mikroliter Überstand langsam von der Schale in die Nut einer Glasrutsche geben und die Deckslipzellenseite vorsichtig auf die Gleitnut legen, dann den Rand des Deckels mit Nagellack versiegeln und den Nagellack trocknen lassen, bevor er den Schlitten auf die Dunkelfeld-Mikroskopbühne legt. Legen Sie für die Einzelpartikelverfolgung durch Dunkelfeldmikroskopie einen Tropfen Öl auf den Öl-Dunkelfeldkondensator und drehen Sie den Knopf, bis der Kondensator die Glasrutsche kontaktiert.Legen Sie einen Tropfen Öl auf die Oberseite des Deckglases und drehen Sie den Fokussierknopf, bis das 60X Öl-Tauchziel das Öl berührt. Schalten Sie die Lichtquelle ein, und drehen Sie den Fokussierknopf leicht, um die Bildebene zu fokussieren. Klicken Sie dann auf das Kamerasymbol in der Mikroskopsoftware, um eine Sample-Streubildzeitserie mit der Farb-CMOS-Kamera aufzuzeichnen und das Bild im TIFF-Format zu speichern.Um eine einzelne Langzeitflugbahn zu extrahieren, öffnen Sie das Bild in ImageJ, und klicken Sie auf Bild, Typ und 8-Bit, um das Bild aus dem RGB-Modus in den 8-Bit-Modus zu konvertieren. Um den Kontrast anzupassen, klicken Sie auf Bild, passen Sie den Helligkeitskontrast an und legen Sie die Parameter fest. Wählen Sie ein Zielpartikel aus, und verwenden Sie Steuerung X, um den Hintergrund der Zeitreihen abzuschneiden.Klicken Sie auf Plugins, Partikel-Tracker-Klassiker und Partikel-Tracker, um das Partikelerkennungs- und Partikelverknüpfungsfenster zu öffnen und den Radius auf sechs, den Cutoff auf Null und das Perzentil auf 0,01 % festzulegen, den Linkbereich auf 10 und die Verschiebung auf 10 und klicken Sie auf OK, um das Partikeltracker-Ergebnisfenster zu öffnen, um die Ergebnisse anzuzeigen. Klicken Sie auf Visualisierung aller Flugbahnen, um die generierten Flugbahnen zu überprüfen. Wenn die von der Software generierte Flugbahn und die Bewegungsbahn der Gold-Nanostäbe übereinstimmen, klicken Sie auf Vollständigen Bericht speichern, um die Ergebnisse zu speichern.Wenn die von der Software generierte Flugbahn nicht mit der bewegten Flugbahn der Gold-Nanostäbe übereinstimmt, klicken Sie auf Relink-Partikel, um die erkannten Partikel mit unterschiedlichen Verbindungsbereichs- und Perzentilparametern neu zu verknüpfen. Um die mittlere Pixelkoordinate der Gold-Nanostange in jedem Frame gemäß der XY-Koordinate zu finden, verwenden Sie die xy-Koordination. m-Funktion.Um eine Matrix mit drei mal drei Pixeln zu begrenzen, extrahieren Sie die neun Streuintensitätswerte der roten oder grünen Kanäle und berechnen Sie einen Durchschnittswert, verwenden Sie die rgextraction. m-Funktion. Verwenden Sie dann das Polarwinkel.m-Funktion zur Berechnung der Polarwinkel mit der Dual-Channel-Differentialmethode. Um dynamische Parameter mithilfe der Formeln in der Tabelle zu berechnen, führen Sie die beiden Analyseskripts aus. Legen Sie für die visuelle Analyse der Flugbahn die X-Koordinate als X, die Y-Koordinate als Y und die Zeit als Y fest, klicken Sie dann auf Plot, Streuung und Farbzuordnung, legen Sie die Diagrammparameter fest, und fügen Sie die Farbleiste hinzu.Um mittlere quadratische Verschiebungszeitintervallzahlen zu generieren, legen Sie das Zeitintervall als X und die mittlere quadratische Verschiebung als Y.Click-Diagramm, Streuung, Analyse, Anpassung, nichtlineare Kurvenanpassung und öffnen den Dialog fest, und legen Sie die Diagrammparameter fest. Legen Sie für die statistische Analyse mit mehreren Partikeln die dynamischen Parameter von Interesse als Y fest, und klicken Sie auf Plot und Histogramm. Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um die Divisionsgröße oder die Anzahl der Divisionen festzulegen, und klicken Sie auf Anwenden.Fügen Sie dann eine Spalte hinzu, und legen Sie die Diagrammparameter fest. Legen Sie für eine Zeitreihenanalyse die Zeit als X und die Zeitreihenparameter als Y.Click-Plot, Multi-Bereich und Stack fest. Wählen Sie im Popupfenster Zeile und OK aus. Legen Sie dann die Parameter für das Diagramm fest.Das Längsplasmonische Maximum von 40 mal 85 Nanometern CTAB beschichtete Gold-Nanostäbe beträgt ca. 650 Nanometer und die Querresonanz beträgt 520 Nanometer. Die Streuintensität der CTAB-beschichteten Gold-Nanostäbe auf U87-Zellmembranen zeigt eine typische Gaußsche Verteilung mit einer schmalen Breite, die mit der von CTAB beschichteten Gold-Nanostäben auf Glas übereinstimmt, was darauf hinweist, dass CTAB-beschichtete Gold-Nanostäbe, die in diesem Experiment verfolgt wurden, gut monodisperse sind. Wie dargestellt, können mehr als 500 CTAB-beschichtete Gold-Nanostab-Trajektorien durch Dunkelfeldmikroskopie verfolgt und in Weitbereichsdiffusionsbahnen und begrenzte Diffusionsbahnen unterteilt werden.Der Kreiselradius aller 500 Flugbahnen in dieser repräsentativen Analyse zeigte eine kleine Werteverteilung mit einem mittleren Kreiselradius von 0,5 Mikrometern und die maximale Verschiebung war bei kleinen Werten stärker verteilt. Wie in dieser Ensemblezeitdurchschnittliche mittlere Quadratverschiebungsanalyse gezeigt, diffundieren die CTAB-beschichteten Gold-Nanostäbe normalerweise mit einem Alpha von etwa einem. Die Dichteverteilung des Diffusionskoeffizienten und des Alphaaus allen Bahnen zeigt jedoch, dass die Dynamik der Gold-Nanostäbe eine heterogene Verteilung mit Superdiffusions-, Brownian- und Subdiffusionsbewegungen aufweist.Darüber hinaus können einzelne partikelstatistische Analysen und Parameteranalysen für Zeitreihen verwendet werden, um zwei repräsentative, langfristig begrenzte und sich bewegende Bahnen zu charakterisieren. Es ist notwendig, eine einzige neuartige Interpretation der Daten aus der Einzelnen-Partikel-Tracking-Analyse zu resamieren und zu extrahieren, da es in der Regel einige schwierige Kompromisse zu machen gibt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Forschung

Biochemie

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...