Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין עם מספרי מענקים של 21425519, 91853105 ו 21621003.

1. תרבות התאים
<ol><li>הכן מדיום מלא עבור תאי U87 MG על ידי הוספת סרום שור עוברי (ריכוז סופי 10%) ופניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%) למדיום החיוני המינימלי (MEM). השתמש צלחת תרבות תא פלסטיק עבור תת תרבות תאים.</li>
	<li>תאי מעבר 2 עד 3 פעמים בשבוע.<ol>
<li>הסר את מדיום התרבות ושטוף את שכבת התא באמצעות מלוחי הפו...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג משמש כדי ללמוד את הדינמיקה של AuNRs על קרום התא. הפרוטוקול מורכב מארבעה חלקים, כולל הדמיה מיקרוסקופית, חילוץ נתונים, חישוב פרמטרים דינמיים ושיטות ניתוח נתונים, וכל חלק הוא גמיש ואוניברסלי. לכן, ישנם יישומים עתידיים אפשריים רבים, למשל, לימוד תנועה של מולקולות קרום הקשורות NP על ?...

הדינמיקה של חלקיקים (NPs) על הממברנה קשורה קשר הדוק עם תהליך ספיגת הסלולר, אשר חיוני להבנת תפקודי התא, זיהומים ויראליים או חיידקיים ופיתוח של מערכות משלוח ננו רפואי מלאכותי1,2. טכניקת מעקב חלקיקים בודדים (SPT) היא כלי חזק לאפיון ההתנהגויות ההטרוגניות של NPs3,4. באופן כללי, קרום התא הוא נוזלי, כלומר הרכיבים כגון חלבונים ושומנים יכולים לנוע לרוחב במישור קרום הפלזמה5,6,7. המורכבות המרחבית של ארגון ומבנה הממברנה עלולה להוביל להטרוגניות מרחבית של האינטראקציה בין NPs לקרום. לפיכך, הדמיה ישירה של התנועה של NPs על הממברנה דורשת רזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.
מיקרוסקופ מעקב חלקיקים יחיד המנטר לוקליזציה של חלקיקים בודדים בתאים חיים עם רזולוציה מרחבית של עשרות ננומטר ורזולוציית זמן של אלפיות שנייה פותחה היטב כדי לחקור את NPs או מולקולות קרוםדינמיקה 8,9. טכניקות הדמיה מיקרוסקופיות מבוססות פלואורסצנטיות הפכו לכלים יקרי ערך להתבוננות ב- NPs /מולקולות בסביבת תאיםחיים 9,10,11,12. לדוגמה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית הכוללת, אשר תמונות שכבות דקות (~ 100 ננומטר) של המדגם בממשק מצע / פתרון עם רזולוציה spatiotemporal גבוהה כבר בשימוש נרחב במחקרים של מולקולות קרוםדינמיקה 13,14. עם זאת, החסרונות הטבועים בפלואורופורים בודדים, כגון אינטנסיביות נמוכה וצילום מהיר ובלתי הפיך מפחיתים את הדיוק ומשך המעקב13. לכן, NPs פלסמוניים שאינם פלואורסצנטיים, אשר מחליפים את הבדיקות הפלואורסצנטיות, משכו יותר ויותר תשומת לב במחקרי הדמיה ארוכי טווח בשל המאפיינים האופטיים הייחודיים שלהם15. בהתבסס על אותות הפיזור של בדיקות NP פלסמוניות, נעשה שימוש במספר סוגים של טכנולוגיות הדמיה מיקרוסקופיות אופטיות כדי לחקור את המנגנון של תהליכים ביולוגיים, כגון מיקרוסקופיה שדה כהה (DFM)16, פיזור אינטרפרומטרי (iSCAT) מיקרוסקופיה17 ומיקרוסקופיית ניגוד הפרעה דיפרנציאלית (DICM)18. בנוסף, ניתן להשיג את דינמיקת התנועה והסיבוב של AuNRs באמצעות DFM ו DICM18,19,20,21,22. בדרך כלל, בניסוי SPT, התנועה של האובייקט נרשמת על ידי המיקרוסקופ האופטי, ולאחר מכן מנותחת על ידי שיטות ניתוח SPT3. המסלולים שנפתרו בזמן וזוויות האוריינטציה שנוצרו על ידי NPs בודדים הם בדרך כלל סטוכסטיים והטרוגניים, ולכן יש צורך להציג מידע דינמי בשפע עם שיטות ניתוח שונות.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול משולב המנטר את הדינמיקה של AuNRs על קרום התא באמצעות DFM, מחלץ את המיקום והכיוון של AuNRs עם ImageJ ו- MATLAB ומאפיין את הדיפוזיה של AuNRs עם שיטות ניתוח SPT. כהדגמה, אנו מראים כאן כיצד להשתמש בפרוטוקול SPT כדי לדמיין את הדינמיקה של AuNRs ללא שינוי (CTAB-AuNRs, מסונתז על ידי מולקולת אמוניום ברומיד cetyltrimethylammonium כסוכן מגן) על קרום התא U87 MG. הוכח כי CTAB-AuNRs יכול לתסלח חלבונים בסביבה ביולוגית, לנוע על קרום התא ולאחר מכן להזין תאים2,20,22. תא U87 MG הוא הגידול הנפוץ והממאיר ביותר של מערכת העצבים המרכזית, קולטני הממברנה שלו באים לידי ביטוי באופן חריג. קולטני הממברנה יכולים לקיים אינטראקציה עם חלבונים על AuNRs, אשר משפיעים על הדינמיקה של AuNRs. הפרוטוקול שלנו ישים בדרך כלל לניסויי SPT אחרים בתחום הביולוגיה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

ניתוח הדינמיקה הדיפוזיונית של חלקיקים על קרום התא ממלא תפקיד משמעותי בהבנה טובה יותר של תהליך הספיגה התאית ומספק בסיס תיאורטי לעיצוב הרציונלי של אספקת ננו-רפואה. ניתוח מעקב חלקיקים יחיד (SPT) יכול לחקור את המיקום והכיוון של חלקיקים בודדים על קרום התא, ולחשוף את מצבי התרגום והסיבוב שלהם. כאן, אנו מראים כיצד להשתמש מיקרוסקופיה שדה כהה מסורתי כדי לפקח על הדינמיקה של nanorods זהב (AuNRs) על קרום תא חי. אנו גם מראים כיצד לחלץ את המיקום והכיוון של AuNRs באמצעות ImageJ ו- MATLAB, וכיצד לאפיין את המצבים המפוזרים של AuNRs. ניתוח סטטיסטי של מאות חלקיקים מראים כי AuNRs יחיד לבצע תנועה בראונית על פני השטח של קרום התא U87 MG. עם זאת, ניתוח מסלול ארוך בודדים מראה כי AuNRs יש שני סוגים שונים במובהק של מצבי תנועה על הממברנה, כלומר תחבורה ארוכת טווח וכליאה באזור מוגבל. שיטות SPT שלנו יכול לשמש פוטנציאל לחקור את פני השטח או דיפוזיה חלקיקים תאיים בתאים ביולוגיים שונים והוא יכול להיות כלי רב עוצמה לחקירות של מנגנונים תאיים מורכבים.

בפרוטוקול נעשה שימוש ב- CTAB-AuNRs ללא שינוי של 40 x 85 ננומטר. כפי שמוצג באיור 2B, המקסימום הפלסמוני האורך שלו הוא ~ 650 ננומטר (אזור אדום) ותהודה רוחבית היא ב 520 ננומטר (אזור ירוק). ספרות קודמת חשפה כי המאפיינים האופטיים (כגון עוצמת LSPR) של AuNRs פלסמוני ישתנו באופן משמעותי עם קוטרם<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

כאן, אנו מראים את השימוש במיקרוסקופיה מסורתית של שדה כהה כדי לפקח על הדינמיקה של nanorods זהב (AuNRs) על קרום התא. המיקום והכיוון של AuNRs יחיד מזוהים באמצעות ImageJ ו- MATLAB, והמדינות המפוזרות של AuNRs מאופיינים בניתוח מעקב אחר חלקיקים בודדים.

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

הפרוטוקול שלנו משתמש בניתוח בדיקת חלקיקים יחיד כדי לפקח על הדינמיקה של המיקום והכיוון ומאפיין את הדיפוזיה של ננו-רודים זהובים על קרום התא. בשיטה זו ניתן להשיג הן את התרגום והן את הדינמיקה הסיבובית של ננורודים זהובים ואת הדינמיקה ניתן לנתח באופן מקיף את המוצג. לפרוטוקול זה יש פוטנציאל לשמש לחקר סוגים אחרים של מערכות ביולוגיות מורכבות.התחל על ידי שריפת כיסויי זכוכית טבול אתנול על הלהבה והנחת כיסוי בצלחת 35 על ידי 10 מילימטר תרבות התא המכיל שני מיליליטר של מדיום תרבות התא ללא פנול אדום. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של השעיית התא של עניין על כריכה בעדינות לנער את המנה קדימה ואחורה שמאלה וימינה כדי להפיץ את התאים באופן שווה. מניחים את המנה לתוך החממה תרבות התא במשך כ 12 שעות עד התאים להגיע 20 עד 40% מפגש לפני הוספת 20 microliters של nanorods זהב מצופה CTAB למנה.לאחר טלטול עדין כדי לפזר את nanorods באופן שווה על פני המנה, מניחים את המנה באווירה לחה במשך חמש דקות. בסוף הדגירה, מעבירים באיטיות 100 מיקרוליטרים של על-טבעיים מהתבשיל לתוך הגרוב של מגלשת זכוכית ומניחים בזהירות את צד תא הכיסוי כלפי מטה על גרוב השקופית, ואז אוטמים את קצה הכיסוי בלק ציפורניים ומניחים את לק הציפורן יבש לפני הנחת השקופית על במת המיקרוסקופ של שדה אפל. למעקב אחר חלקיקים בודדים על ידי מיקרוסקופיה של שדה אפל, הניחו טיפת שמן על מייצב שדה החשוך טבילה בשמן וסובבו את הידית עד שהמעבה יוצר קשר עם מגלשת הזכוכית.מניחים טיפת שמן על החלק העליון של זכוכית הכיסוי ולהפוך את הידית התמקדות עד המטרה טבילה שמן 60X נוגע בשמן. הפעל את מקור האור וסובב מעט את ידית המיקוד כדי למקד את מישור ההדמיה. לאחר מכן לחצו על סמל המצלמה בתוכנת המיקרוסקופ כדי להקליט סדרת זמן תמונה קלה לפיזור לדוגמה באמצעות מצלמת CMOS הצבעונית ולשמור את התמונה בתבנית TIFF.לחילוץ מסלול ארוך טווח יחיד, פתחו את התמונה ב- ImageJ ולחצו על תמונה, כתב ו- 8 סיביות להמרת התמונה ממצב RGB למצב 8 סיביות. להתאמת החדות, לחצו על 'תמונה', 'כוונן', 'ניגודיות בהירות' וקבעו את הפרמטרים. בחר חלקיק יעד והשתמש בפקד X כדי לחתוך את רקע סידרת הזמן.לחץ על תוספים, גשש חלקיקים קלאסי וגשש חלקיקים כדי לפתוח את חלון זיהוי החלקיקים וקישור החלקיקים ולהגדיר את הרדיוס לשישה, את החיתוך לאפס ואת האחוזון ל- 0.01%הגדר את טווח הקישור ל- 10 ואת ההעתקה ל- 10 ולחץ על אישור כדי לפתוח את חלון התוצאות של עוקב החלקיקים כדי לראות את התוצאות. לחץ על דמיין את כל המסלולים כדי לבדוק את המסלולים שנוצרו. אם התוכנה שנוצרה מסלול ואת המסלול הנע של nanorods זהב תואמים, לחץ על שמור את הדו"ח המלא כדי לשמור את התוצאות.אם מסלול התוכנה שנוצר אינו תואם את המסלול הנע של nanorods זהב, לחץ על לקשר מחדש חלקיקים כדי לקשר מחדש את החלקיקים שזוהו עם טווח קישור שונה פרמטרים אחוזון. כדי למצוא את קואורדינטת הפיקסלים המרכזית של ננו-הקורוד המוזהב בכל מסגרת בהתאם לקואורדינטות XY, השתמש בקסיקורדיניזציה. פונקציית m.כדי לתחום מטריצת שלושה על שלושה פיקסלים, חלץ את תשעת ערכי עוצמת הפיזור של הערוצים האדומים או הירוקים וחשב ערך ממוצע, השתמש ב- rgextraction. פונקציית m. אז תשתמש בקוטב.m פונקציה לחישוב זוויות הקוטב בשיטת הדיפרנציאל של הערוץ הכפול. כדי לחשב פרמטרים דינאמיים באמצעות הנוסחאות בטבלה, הפעל את שני קבצי ה- Script של הניתוח. לניתוח חזותי של המסלול, הגדר את קואורדינטת X כ- X, את קואורדינטת Y כ- Y ואת השעה כ- Y ולאחר מכן לחץ על התוויה, פיזור ומפת צבע, הגדר את פרמטרי הגרף והוסף את סרגל הצבע.כדי ליצור נתוני מרווח זמן של התזוזה המרובעת הממוצעת, הגדר את מרווח הזמן כ- X ואת ההעתקה הריבועית הממוצעת כ- Y.Click התוויה, פיזור, ניתוח, התאמה, התאמת עקומה לא ליניארית ודיאלוג פתוח והגדר את פרמטרי הגרף. לניתוח סטטיסטי מרובה חלקיקים, הגדר את הפרמטרים הדינמיים של עניין כ- Y ולחץ על התוויה והיסטוגרמה. לחץ פעמיים על ההיסטוגרמה כדי להגדיר את גודל החטיבה או את מספר החטיבות ולחץ על החל.לאחר מכן הוסף עמודה והגדר את פרמטרי הגרף. עבור ניתוח סידרת זמנים, הגדר את השעה כ- X ואת הפרמטרים של סידרת הזמן כ- Y.Click התוויה, חלונית מרובה ומחסנית. בחלון המוקפץ, בחר קו ובסדר. לאחר מכן הגדר את הפרמטרים עבור הגרף.מקסימום פלסמוני אורך של 40 על ידי 85 ננומטר זהב מצופה CTAB הוא כ 650 ננומטר ואת התהודה הרוחבית היא 520 ננומטר. עוצמת הפיזור של nanorods זהב מצופה CTAB על קרום התא U87 מדגים התפלגות גאוסיאנית טיפוסית עם רוחב צר עולה בקנה אחד עם זה של NANORODs זהב מצופה CTAB על זכוכית המציין כי NANORODs זהב מצופה CTAB במעקב בניסוי זה הם מונודיספרסים היטב. כפי שמודגם, יותר מ 500 מסלולי nanorod זהב מצופה CTAB ניתן לעקוב אחר על ידי מיקרוסקופיה שדה כהה ניתן לחלק למסלולי דיפוזיה לטווח ארוך מסלולי דיפוזיה מוגבלים.הרדיוס של gyration של כל 500 מסלולים בניתוח מייצג זה הראה התפלגות ערך קטנה עם רדיוס ממוצע של gyration של 0.5 מיקרומטר ואת התזוזה המרבית היה מופץ יותר בערכים קטנים. כפי שהוכח בניתוח זה זמן ממוצע ממוצע תזוזה מרובעת, nanorods זהב מצופה CTAB בדרך כלל מפוזרים עם אלפא של אחד בערך. התפלגות הצפיפות של מקדם הדיפוזיה והאלפא המתקבל מכל המסלולים, עם זאת, מגלה כי הדינמיקה של nanorods זהב מציגה התפלגות הטרוגנית עם superdiffusion, בראוניאן, תנועות subdiffusion.בנוסף, ניתן להשתמש בניתוח סטטיסטי של חלקיק יחיד וניתוח פרמטרי סדרות זמן כדי לאפיין שני מסלולים מייצגים ארוכי טווח מוגבלים ונעים. יש צורך לסכם ולחלץ פרשנות רומן יחיד של נתונים על קריאת ניתוח מעקב חלקיקים יחיד כמו בדרך כלל יש כמה עסקאות קשות לעשות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...