Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
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इस काम को चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ने 21425519, 91853105 और 21621003 के ग्रांट नंबरों के साथ सपोर्ट किया।

1. सेल संस्कृति
<ol><li>भ्रूण गोजातीय सीरम (अंतिम एकाग्रता 10%) जोड़कर U87 एमजी कोशिकाओं के लिए पूरा माध्यम तैयार करें और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम एकाग्रता 1%) न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) के लिए। कोशि?...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कोशिका झिल्ली पर AuNRs की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। प्रोटोकॉल में चार भाग होते हैं, जिनमें माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग, डेटा निष्कर्षण, गतिशील पैरामीटर गणना और ?...

झिल्ली पर नैनोकणों (एनपीएस) की गतिशीलता सेलुलर तेज प्रक्रिया से निकटता से जुड़ी हुई है, जो सेल कार्यों, वायरल या बैक्टीरियल संक्रमण और कृत्रिम नैनोमेडिकल डिलीवरी सिस्टम के विकास के लिए आवश्यक है1,2। सिंगल पार्टिकल ट्रैकिंग (एसपीटी) तकनीक एनपीएस3,4के विषम व्यवहारों की विशेषता के लिए एक मजबूत उपकरण है। सामान्य तौर पर, कोशिका झिल्ली तरल होती है, जिसका अर्थ है कि प्रोटीन और लिपिड जैसे घटक प्लाज्माझिल्ली विमान5,6,7में बाद में स्थानांतरित हो सकते हैं। झिल्ली संगठन और संरचना की स्थानिक जटिलता से एनपीएस और झिल्ली के बीच बातचीत की स्थानिक टेम्परल विषमता हो सकती है। इसलिए, झिल्ली पर एनपीएस के आंदोलन के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प दोनों की आवश्यकता होती है।
जीवित कोशिकाओं में अलग - अलग कणों के स्थानीयकरण पर नज़र रखने वाली एकल कण ों की पहचान करने वाले दसियों नैनोमीटर के स्थानिक संकल्प और मिलीसेकंड का एक समय संकल्प8,9 को एनपीएस या झिल्ली अणुओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अच्छीतरहसे विकसित किया गया है । फ्लोरेसेंस आधारित सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक जीवित कोशिका पर्यावरण 9 , 10 , 11,12में एनपीएस/अणुओं को देखने के लिए मूल्यवान उपकरण बन गई हैं । उदाहरण के लिए, कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, जो एक उच्च स्थानिकप्रेम संकल्प के साथ सब्सट्रेट/समाधान इंटरफेस पर नमूने की पतली परतों (~ 100 एनएम) को झिल्ली अणुओं गतिशीलता13, 14के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, कम तीव्रता और तेजी से अपरिवर्तनीय फोटोब्लैचिंग जैसे एकल फ्लोरोफोरस के अंतर्निहित नुकसान13ट्रैकिंग की सटीकता और अवधि को कम करते हैं। इसलिए, फ्लोरोसेंट जांच की जगह लेने वाले गैर-फ्लोरोसेंट प्लाज्मोनिक एनपीएस ने अपनी अनूठी ऑप्टिकल विशेषताओं15के कारण दीर्घकालिक इमेजिंग अध्ययनों में अधिक से अधिक ध्यान आकर्षित किया है। प्लाज्मोनिक एनपी जांच के बिखरने वाले संकेतों के आधार पर, कई प्रकार की ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का उपयोग जैविक प्रक्रियाओं के तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जैसे डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी (डीएफएम)16,इंटरफेरोमेट्रिक बिखरने (iSCAT) माइक्रोस्कोपी17 और अंतर हस्तक्षेप सूक्ष्मस्कोपी (डीआईसीएम)18। इसके अलावा, डीएफएम और डीआईसीएम18, 19, 20,21, 22का उपयोग करके ओएनआर की गति और रोटेशन गतिशील प्राप्त किया जा सकताहै। आमतौर पर, एक एसपीटी प्रयोग में, ऑब्जेक्ट की गति ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप द्वारा दर्ज की जाती है, और फिर एसपीटी विश्लेषण विधियों द्वारा विश्लेषण किया जाता है3। व्यक्तिगत एनपीएस द्वारा उत्पन्न समय-हल किए गए प्रक्षेप-पथ और अभिविन्यास कोण सामान्य रूप से स्टोचस्टिक और विषम होते हैं, इसलिए विभिन्न विश्लेषण विधियों के साथ प्रचुर मात्रा में गतिशील जानकारी पेश करना आवश्यक है।
यहां, हम एक एकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो डीएफएम का उपयोग करके सेल झिल्ली पर AuNRs की गतिशीलता पर नज़र रखता है, इमेजजे और मैटलैब के साथ AuNRs के स्थान और अभिविन्यास को निकालता है और एसपीटी विश्लेषण विधियों के साथ AuNRs के प्रसार की विशेषता है। एक प्रदर्शन के रूप में, हम यहां दिखाते हैं कि U87 एमजी सेल झिल्ली पर असंशोधित AuNRs (CTAB-AuNRs, सेटिल्रिमिथाइलाम्मोनियमनियम अमोनियम ब्रोमाइड अणु द्वारा सुरक्षात्मक एजेंट के रूप में संश्लेषित) की गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एसपीटी प्रोटोकॉल का उपयोग कैसे करें। यह प्रदर्शित किया गया है कि सीटीएबी-ओएनआर जैविक वातावरण में प्रोटीन को सोख सकता है, कोशिका झिल्ली पर आगे बढ़ सकता है और फिर कोशिकाओं में प्रवेश कर सकता है2,20,22। U87 एमजी सेल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का सबसे आम और सबसे घातक ट्यूमर है, और इसकी झिल्ली रिसेप्टर्स असामान्य रूप से व्यक्त किए जाते हैं। झिल्ली रिसेप्टर्स AuNRs पर प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकते हैं, जो AuNRs की गतिशीलता को प्रभावित करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल आम तौर पर जीव विज्ञान के क्षेत्र में अन्य एसपीटी प्रयोगों पर लागू होता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

कोशिका झिल्ली पर नैनोकणों की प्रसार गतिशीलता का विश्लेषण सेलुलर तेज प्रक्रिया को बेहतर तरह समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और नैनो-मेडिसिन डिलीवरी के तर्कसंगत डिजाइन के लिए सैद्धांतिक आधार प्रदान करता है। एकल कण ट्रैकिंग (एसपीटी) विश्लेषण कोशिका झिल्ली पर व्यक्तिगत नैनोकणों की स्थिति और अभिविन्यास की जांच कर सकता है, और उनके अनुवादात्मक और घूर्णन राज्यों को प्रकट कर सकता है। यहां, हम लाइव सेल झिल्ली पर सोने के नैनोरोड (AuNRs) की गतिशीलता की निगरानी के लिए पारंपरिक डार्क-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करते हैं। हम यह भी दिखाते हैं कि इमेजजे और मैटलैब का उपयोग करके AuNRs का स्थान और अभिविन्यास कैसे निकाला जाए, और AuNRs के विसारक राज्यों की विशेषता कैसे बनाई जाए। सैकड़ों कणों के सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलता है कि एकल AuNRs U87 एमजी कोशिका झिल्ली की सतह पर ब्राउनियन गति प्रदर्शन करते हैं । हालांकि, व्यक्तिगत लंबे प्रक्षेपवक्र विश्लेषण से पता चलता है कि AuNRs झिल्ली पर गति राज्यों के दो अलग अलग प्रकार है, अर्थात् लंबी दूरी के परिवहन और सीमित क्षेत्र कारावास । हमारे एसपीटी विधियों का उपयोग संभावित रूप से विभिन्न जैविक कोशिकाओं में सतह या इंट्रासेलुलर कण प्रसार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और जटिल सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन सकता है।

प्रोटोकॉल में असंशोधित 40 x 85 एनएम सीटीएबी-एएनआर का इस्तेमाल किया गया। जैसा कि चित्रा 2Bमें दिखाया गया है, इसका देशांतर प्लाज्मोनिक अधिकतम ~ 650 एनएम (लाल क्षेत्र) है और ट्रांसवर्स प्रतिध्वनि 520 एन?...

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Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

यहां, हम कोशिका झिल्ली पर सोने के नैनोरोड (AuNRs) की गतिशीलता की निगरानी के लिए पारंपरिक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग दिखाते हैं। इमेजजे और मैटलैब का उपयोग करके एकल AuNRs के स्थान और अभिविन्यास का पता लगाया जाता है, और AuNRs के विसारक राज्यों को एकल कण ट्रैकिंग विश्लेषण की विशेषता है।

सिंगल नैनोपार्टिकल डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सेल झिल्ली पर गोल्ड नैनोरोड्स की प्रसार गतिशीलता की कल्पना करना

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

हमारा प्रोटोकॉल स्थान और अभिविन्यास की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एकल कण जांच विश्लेषण का उपयोग करता है और कोशिका झिल्ली पर सुनहरे नैनोरोड के प्रसार की विशेषता है। इस विधि का उपयोग करके, गोल्डन नैनोरोड्स के ट्रांसलेशनल और घूर्णन गतिशीलता दोनों प्राप्त किए जा सकते हैं और गतिशील का व्यापक विश्लेषण किया जा सकता है और प्रस्तुत किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में अन्य प्रकार की जटिल जैविक प्रणालियों के अध्ययन के लिए उपयोग करने की क्षमता है।लौ पर एक इथेनॉल डूबा ग्लास कवरलिप जलाने और 10 मिलीमीटर सेल संस्कृति डिश में कवरस्लिप रखने से शुरू करें जिसमें फिनोल लाल के बिना सेल कल्चर मीडियम के दो मिलीलीटर होते हैं। कवरस्लिप पर ब्याज के सेल निलंबन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे से कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए आगे और बाएं और सही डिश हिला। डिश को लगभग 12 घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि कोशिकाएं डिश में सीटीबीएबी लेपित गोल्ड नैनोरोड्स के 20 माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले 20 से 40% गैस तक न पहुंच जाएं।पकवान भर में समान रूप से नैनोरोड्स को तितर-बितर करने के लिए कोमल झटकों के बाद, पकवान को पांच मिनट के लिए एक आर्द्र वातावरण में रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, धीरे-धीरे एक ग्लास स्लाइड के नाली में पकवान से सुपरनिटर के 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें और ध्यान से कवरस्लिप सेल साइड को स्लाइड नाली पर रखें, फिर नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारे को सील करें और स्लाइड को डार्कफील्ड माइक्रोस्कोप चरण पर रखने से पहले नेल पॉलिश को सूखा दें। डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल कण ट्रैकिंग के लिए, तेल विसर्जित डार्कफील्ड कंडेनसर पर तेल की एक बूंद रखें और घुंडी को तब तक चालू करें जब तक कि कंडेनसर ग्लास स्लाइड से संपर्क न करे।कवर ग्लास के शीर्ष पर तेल की एक बूंद रखें और ध्यान केंद्रित घुंडी बारी जब तक 60X तेल विसर्जन उद्देश्य तेल को छूता है । प्रकाश स्रोत चालू करें और इमेजिंग विमान को केंद्रित करने के लिए फोकसिंग नॉब को थोड़ा चालू करें। फिर रंग CMOS कैमरे का उपयोग कर एक नमूना बिखरने प्रकाश छवि समय श्रृंखला रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में कैमरा आइकन पर क्लिक करें और एक झगड़ा प्रारूप में छवि को बचाने के लिए ।एक दीर्घकालिक प्रक्षेपवक्र निकालने के लिए, इमेजज में इमेज को खोलें और इमेज, टाइप और 8-बिट पर क्लिक करें ताकि इमेज को आरजीबी मोड से 8-बिट मोड में बदला जा सके । इसके विपरीत समायोजित करने के लिए, छवि पर क्लिक करें, समायोजित करें, चमक विपरीत और मापदंडों को निर्धारित करें। एक लक्ष्य कण का चयन करें और समय श्रृंखला पृष्ठभूमि को काटने के लिए नियंत्रण एक्स का उपयोग करें।क्लिक प्लगइन्स, कण ट्रैकर क्लासिक, और कण ट्रैकर कण का पता लगाने और कण जोड़ने खिड़की खोलने के लिए और छह करने के लिए त्रिज्या सेट, शून्य करने के लिए कटऑफ, और ०.०१% करने के लिए शतमक 10 और विस्थापन के लिए लिंक रेंज सेट 10 और क्लिक ठीक क्लिक करने के लिए कण ट्रैकर परिणाम खिड़की खोलने के लिए परिणाम देखने के लिए । जनित प्रक्षेप पथ का निरीक्षण करने के लिए सभी प्रक्षेप पथों की कल्पना पर क्लिक करें। यदि सॉफ्टवेयर ने प्रक्षेपवक्र उत्पन्न किया है और सोने के नैनोरोड के चलती प्रक्षेपवक्र का मिलान किया जाता है, तो परिणामों को बचाने के लिए पूरी रिपोर्ट बचाने पर क्लिक करें।यदि सॉफ्टवेयर जनित प्रक्षेपवक्र सोने के नैनोरोड्स के चलती प्रक्षेपवक्र से मेल नहीं खाती है, तो विभिन्न लिंक रेंज और शतमक मापदंडों के साथ पता किए गए कणों को फिर से जोड़ने के लिए पुनः लिंक कणों पर क्लिक करें। XY समन्वय के अनुसार प्रत्येक फ्रेम में सोने नैनोरॉड के केंद्र पिक्सेल समन्वय खोजने के लिए, xycoordination का उपयोग करें। एम समारोह।तीन पिक्सल मैट्रिक्स द्वारा तीन परिसीमन करने के लिए, लाल या हरे चैनलों के नौ बिखरने तीव्रता मूल्यों को निकालने और एक औसत मूल्य की गणना, rgextraction का उपयोग करें । एम समारोह। इसके बाद पोलरगल का इस्तेमाल करें।एम दोहरी चैनल अंतर विधि का उपयोग कर ध्रुवीय कोणों की गणना करने के लिए कार्य करते हैं। तालिका में सूत्रों का उपयोग करके गतिशील मापदंडों की गणना करने के लिए, दो विश्लेषण लिपियों को चलाएं। प्रक्षेपवक्र के दृश्य विश्लेषण के लिए, एक्स समन्वय को एक्स के रूप में सेट करें, वाई के रूप में समन्वय करें, और वाई के रूप में समय, फिर प्लॉट, स्कैटर और रंग मानचित्र पर क्लिक करें, ग्राफ पैरामीटर सेट करें, और रंग बार जोड़ें।मतलब वर्ग विस्थापन समय अंतराल के आंकड़े उत्पन्न करने के लिए, एक्स के रूप में समय अंतराल और वाई क्लिक प्लॉट, स्कैटर, विश्लेषण, फिटिंग, नॉनलाइनर वक्र फिटिंग और खुली बातचीत के रूप में मतलब वर्ग विस्थापन निर्धारित करें और ग्राफ पैरामीटर सेट करें। बहु-कण सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, ब्याज के गतिशील मापदंडों को वाई और क्लिक प्लॉट और हिस्टोग्राम के रूप में सेट करें। डिवीजन का आकार या डिवीजनों की संख्या निर्धारित करने के लिए हिस्टोग्राम पर डबल क्लिक करें और आवेदन करें।फिर एक कॉलम जोड़ें और ग्राफ पैरामीटर सेट करें। एक समय श्रृंखला विश्लेषण के लिए, एक्स और वाई क्लिक प्लॉट, मल्टी-फलक और स्टैक के रूप में समय श्रृंखला मापदंडों के रूप में समय निर्धारित करें। पॉपअप विंडो में, लाइन और ओके का चयन करें। फिर ग्राफ के लिए पैरामीटर सेट करें।85 नैनोमीटर सीटीबीएपी लेपित सोने नैनोरोड्स द्वारा 40 की देशांतर प्लाज्मोनिक अधिकतम लगभग 650 नैनोमीटर है और ट्रांसवर्स प्रतिध्वनि 520 नैनोमीटर है। U87 सेल झिल्ली पर सीटीबीएबी लेपित सोने के नैनोरोड की बिखरने की तीव्रता कांच पर सीटीबीएबी कोटेड गोल्ड नैनोरोड के अनुरूप एक संकीर्ण चौड़ाई के साथ एक विशिष्ट गॉसियन वितरण को दर्शाती है जो यह दर्शाता है कि इस प्रयोग में ट्रैक किए गए सीटीबीएपी कोटेड गोल्ड नैनोरोड अच्छी तरह से मोनोडिस्प्ड हैं। जैसा कि सचित्र, 500 से अधिक सीटीबीबी कोटेड गोल्ड नैनोरॉड प्रक्षेप पथ को डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्रैक किया जा सकता है और इसे लंबी दूरी के प्रसार प्रक्षेप पथ और सीमित प्रसार प्रक्षेप पथ में विभाजित किया जा सकता है।इस प्रतिनिधि विश्लेषण में सभी 500 प्रक्षेप पथों के जायरेशन के त्रिज्या ने 0.5 माइक्रोमीटर के जायरेशन के एक औसत त्रिज्या के साथ एक छोटा सा मूल्य वितरण दिखाया और अधिकतम विस्थापन को छोटे मूल्यों पर अधिक वितरित किया गया। जैसा कि इस पहनावा समय औसत औसत मतलब वर्ग विस्थापन विश्लेषण में दिखाया गया है, सीटीबीएबी लेपित सोने के नैनोरोड सामान्य रूप से लगभग एक अल्फा के साथ फैलते हैं। हालांकि, सभी प्रक्षेपवक्रों से प्राप्त प्रसार गुणांक और अल्फा का घनत्व वितरण से पता चलता है कि सोने के नैनोरोड का गतिशील सुपरडिफ्यूजन, ब्राउनियन और सबडिफ्यूजन गति के साथ एक विषम वितरण प्रदर्शित करता है।इसके अलावा, एकल कण सांख्यिकीय विश्लेषण और समय श्रृंखला पैरामीटर विश्लेषण का उपयोग दो प्रतिनिधि दीर्घकालिक सीमित और गति पथ को आगे बढ़ाने की विशेषता के लिए किया जा सकता है। एकल कण ट्रैकिंग विश्लेषण रीडआउट पर डेटा की एक उपन्यास व्याख्या को संक्षेप में प्रस्तुत करना और निकालना आवश्यक है क्योंकि आमतौर पर बनाने के लिए कुछ कठिन ट्रेडऑफ होते हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

सेल-सेल संपर्कों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की एक प्रतिदीप्ति अस्थिरता स्पेक्ट्रोस्कोपी परख

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

संरचना और Nucleosomes की गतिशीलता परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग का उपयोग कर की जांच

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

इलेक्ट्रोकैमिस्ट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटॉन-पंप झिल्ली एंजाइमों के अध्ययन के लिए एकल liposome मापन

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का उपयोग कर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन का मूल्यांकन

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

कल्पना सतह टी-सेल रिसेप्टर गतिशीलता चार आयामी जाली लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली गतिशीलता के पुनर्गठन के लिए एक मॉडल झिल्ली मंच

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

एकल अणु मछली द्वारा ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिव एलील्स का एकल सेल विश्लेषण

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...