Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

이 작품은 21425519, 91853105 및 21621003의 보조금 번호로 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양
<ol><li>태아소 혈청을 추가하여 U87 MG 세포에 대한 완전한 배지 준비(최종 농도 10%) 및 페니실린 연쇄 절제술 (최종 농도 1%) 최소 필수 매체(MEM)에. 세포 하위 문화에 플라스틱 세포 배양 접시를 사용합니다.</li>
	<li>통로 세포는 일주일에 2 ~ 3 번.<ol>
<li>배양 배지를 제거하고 덜벡코의 인산완충식염(D-PBS)으로 세포층을 헹구면 컨실루(80%~90%)가 2~3배 나 늘어서 있다.</li>
		<li>세포 배양 접?...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

제시된 프로토콜은 세포막에 AuNRs의 역학을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이 프로토콜은 현미경 이미징, 데이터 추출, 동적 매개 변수 계산 및 데이터 분석 방법을 포함한 4개의 부분으로 구성되어 있으며 각 부품은 유연하고 보편적입니다. 따라서, 예를 들어, 멤브레인에 NP 연결 멤브레인 분자의 움직임을 연구하는 많은 가능한 미래의 응용 프로그램, NP 라벨 수용체의 내분비역학, 세포 내 NPs및 ?...

멤브레인상 나노입자(NPs)의 역학은 세포 기능, 바이러스 또는 세균 감염 및 인공 나노 의료 전달 시스템의 개발에 필수적인 세포 섭취 과정과 밀접한 관련이 있다1,2. 단일 입자 추적(SPT) 기술은 NPs3,4의이기종 동작을 특성화하는 강력한 도구이다. 일반적으로, 세포막은 단백질 및 지질과 같은 성분이 혈장 막평면5,6,7에서측면으로 이동할 수 있음을 의미하는 유체이다. 멤브레인 조직과 구조의 현면복잡성은 NP와 멤브레인 간의 상호 작용의 현면적 이질성으로 이어질 수 있다. 따라서 멤브레인에서 의한 NPs 의 움직임을 직접 시각화하려면 높은 공간 및 시간적 해상도가 필요합니다.
수십 나노미터의 공간 분해능과 밀리초의 시간 분해능을 가진 살아있는 세포에서 개별 입자의 국소화를 모니터링하는 단일 입자 추적 현미경 검사법은 NPs 또는 멤브레인 분자 역학8,9를연구하기 위해 잘 개발되었다. 형광계 현미경 이미징 기술은 살아있는 세포 환경에서 NPs/분자를 관찰하기 위한 귀중한도구가 되었다9,10,11,12. 예를 들어, 높은 스피처럴 분해능을 가진 기판/용액 인터페이스에서 시료의 얇은 층(~100nm)을 이미지하는 총 내부 반사 형광 현미경검사법은 멤브레인 분자 역학13,14의연구에 널리 사용되고 있다. 그러나, 낮은 강도및 신속한 돌이킬 수 없는 광표백과 같은 단일 형광의 내재된 단점은추적13의정확도와 지속시간을 감소시다. 따라서 형광 프로브를 대체하는 비형성 플라스모닉 PPs는 독특한 광학특성(15)으로인해 장기 이미징 연구에서 점점 더 많은 관심을 받고 있다. 플라스모닉 NP 프로브의 산란 신호에 기초하여, 여러 종류의 광학 현미경 이미징 기술은 암야 현미경 검사법(DFM)16,간섭 성 산란(iSCAT) 현미경 검사법(DICM)18과같은 생물학적 과정의 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔다. 또한, AuNRs의 동작 및 회전 역학은 DFM 및 DICM18,19,20,21,22를사용하여 얻을 수 있다. 전형적으로, SPT 실험에서, 물체의 움직임은 광학 현미경에 의해 기록된 다음 SPT 분석 방법3에의해 분석된다. 개별 NP에 의해 생성된 시간 해결 궤적 및 방향 각도는 일반적으로 스토카스틱및 이기종이므로 다양한 분석 방법으로 풍부한 동적 정보를 제시할 필요가 있습니다.
여기서는 DFM을 사용하여 세포막에 대한 AuNRs의 역학을 모니터링하고 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuNRs의 위치와 방향을 추출하고 SPT 분석 방법으로 AuNRs의 확산을 특징으로하는 통합 프로토콜을 제공합니다. 시연으로, 우리는 U87 MG 세포막에 수정되지 않은 AuNRs (CTAB-AuNRs, 보호 에이전트로 cetyltrimelammonium 암모늄 브로마이저 분자에 의해 합성)의 역학을 시각화하기 위해 SPT 프로토콜을 사용하는 방법을 여기에 보여줍니다. CTAB-AuNRs가 생물학적 환경에서 단백질을 흡착하고 세포막으로 이동한 다음 세포2,20,22를입력할 수 있음을 입증하였다. U87 MG 세포는 중추 신경계의 가장 일반적이고 가장 악성 종양이며, 그 막 수용체는 비정상적으로 발현된다. 멤브레인 수용체는 AuNRs의 역학에 영향을 미치는 AuNRs의 단백질과 상호 작용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 일반적으로 생물학 분야의 다른 SPT 실험에 적용됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

세포막에 나노 입자의 확산 역학을 분석하는 것은 세포 섭취 과정을 더 잘 이해하는 데 중요한 역할을하며 나노 의학 전달의 합리적 설계를위한 이론적 근거를 제공합니다. 단일 입자 추적(SPT) 분석은 세포막에 개별 나노 입자의 위치와 방향을 조사하고 그들의 번역 및 회전 상태를 나타낼 수 있었습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 AuN의 위치와 방향을 추출하는 방법과 AuNR의 확산 상태를 특성화하는 방법을 보여줍니다. 수백 개의 입자의 통계 적 분석은 단일 AuNRs가 U87 MG 세포막의 표면에 브라운 운동을 수행한다는 것을 보여줍니다. 그러나 개별 적인 긴 궤적 분석은 AuNRs가 멤브레인, 즉 장거리 운송 및 제한된 면적 감금에 두 가지 유형의 모션 상태를 가지고 있음을 보여줍니다. 우리의 SPT 방법은 잠재적으로 다른 생물학적 세포에 있는 표면 또는 세포내 입자 확산을 연구하기 위하여 이용될 수 있고 복잡한 세포 기계장치의 조사를 위한 강력한 공구가 될 수 있습니다.

프로토콜에서 수정되지 않은 40 x 85 nm CTAB-AuNR이 사용되었습니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 세로 플라스모닉 최대값은 ~650nm(적색 영역)이며 횡방향 공명은 520nm(녹색 영역)이다. 이전 문헌은 플라스모닉 AuNR의 광학 특성(예: LSPR 강도)이 직경20,22로크게 변화할 것이라고 밝혔다. 도 2C에서,U87 세포막에 CTAB-AuNRs에?...

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Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

여기서, 우리는 세포막에 금 나노로드 (AuNRs)의 역학을 감시하기 위하여 전통적인 암장 현미경 검사법의 사용을 보여줍니다. 단일 AuNR의 위치와 방향은 ImageJ 및 MATLAB을 사용하여 감지되며 AuNRs의 확산 상태는 단일 입자 추적 해석을 특징으로 합니다.

단일 나노 입자 암장 현미경 검사를 사용하여 세포 막에 금 나노로드의 확산 역학 시각화

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

당사의 프로토콜은 단일 입자 검사 분석을 사용하여 위치와 방향의 역학을 모니터링하고 세포막에 황금 나노로드가 확산되는 특성화합니다. 이 방법을 이용하여, 황금 나노로드의 번역 및 회전 역학을 모두 얻을 수 있고 역학을 종합적으로 분석하고 제시할 수 있다. 이 프로토콜은 복잡한 생물학적 시스템의 다른 유형의 연구에 사용될 가능성이 있다.먼저 화염에 에탄올 담근 유리 커버슬립을 태우고 페놀 레드 없이 세포 배양 배지 2밀리리터를 함유한 35~10mm 세포 배양 접시에 커버슬립을 넣는 것으로 시작한다. 커버슬립에 관심 있는 셀 서스펜션 50마이크로리터를 넣고, 접시를 앞뒤로 그리고 좌우로 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분배합니다. CTAB 코팅 금 나노로드 20 마이크로리터를 첨가하기 전에 세포가 20~40%에 도달할 때까지 약 12시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 넣습니다.부드러운 흔들림으로 나노로드를 접시 전체에 고르게 분산시키고 5분간 가습된 분위기에 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서, 천천히 유리 슬라이드의 홈으로 접시에서 100 마이크로 리터를 전송하고 조심스럽게 슬라이드 홈에 커버 슬립 셀 측면을 배치 한 다음 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉하고 암필드 현미경 단계에 슬라이드를 배치하기 전에 매니큐어 건조하자. 암필드 현미경 검사법에 의한 단일 입자 추적의 경우, 오일 한 방울을 암필드 응축기에 넣고 응축기가 유리 슬라이드에 닿을 때까지 노브를 돌립니다.60X 오일 침지 목표가 오일에 닿을 때까지 오일 한 방울을 커버 글래스 상단에 놓고 초점 손잡이를 켭니다. 광원을 켜고 초점 손잡이를 약간 돌려 이미징 평면에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 카메라 아이콘을 클릭하여 CMOS 카메라를 사용하여 샘플 산란 광 화상 타임 시리즈를 기록하고 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.단일 장기 궤적을 추출하려면 ImageJ에서 이미지를 열고 이미지, 유형 및 8비트를 클릭하여 RGB 모드에서 8비트 모드로 이미지를 변환합니다. 대비를 조정하려면 이미지를 클릭하고 조정하고 밝기 대비를 설정하고 매개 변수를 설정합니다. 대상 파티클을 선택하고 컨트롤 X를 사용하여 타임시리즈 배경을 차단합니다.플러그인, 파티클 트래커 클래식 및 파티클 트래커를 클릭하여 파티클 감지 및 파티클 연결 창을 열고 반경을 6으로 설정하고, 차단을 0으로 설정하고, 백분위수는 링크 범위를 10으로 설정하고 변위를 10으로 설정하고 확인을 클릭하여 결과를 볼 수 있습니다. 생성된 궤적을 검사하려면 모든 궤적을 시각화합니다. 소프트웨어가 생성된 궤적과 금 나노로드의 이동 궤적이 일치하는 경우 전체 보고서를 저장하여 결과를 저장합니다.소프트웨어 생성 궤적이 금 나노로드의 이동 궤적과 일치하지 않는 경우 파티클을 다시 클릭하여 감지된 입자를 서로 다른 링크 범위 및 백분위수 매개 변수로 다시 연결합니다. XY 좌표에 따라 각 프레임에서 금 나노로드의 중앙 픽셀 좌표를 찾으려면 xycoordination를 사용하십시오. m 기능.3x 3픽셀 행렬을 제한하려면 빨간색 또는 녹색 채널의 9개의 산란 강도 값을 추출하고 평균 값을 계산하려면 rg추출을 사용합니다. m 기능. 그런 다음 극지각을 사용합니다.m 함수는 이중 채널 차동 방법을 사용하여 극지 각도를 계산합니다. 테이블의 수식을 사용하여 동적 매개 변수를 계산하려면 두 분석 스크립트를 실행합니다. 궤적을 시각적으로 분석하려면 X 좌표를 X로 설정하고 Y 좌표를 Y로 조정한 다음 플롯, 산란 및 색상 맵을 클릭하고 그래프 매개 변수를 설정하고 색상 막대를 추가합니다.평균 정사각형 변위 시간 간격 수치를 생성하려면 시간 간격을 Y.Click 플롯, 분산, 분석, 피팅, 비선형 곡선 피팅 및 열린 대화로 X 및 평균 제곱 변위로 설정하고 그래프 매개 변수를 설정합니다. 다중 입자 통계 해석의 경우 관심 있는 동적 매개 변수를 Y로 설정하고 플롯및 히스토그램을 클릭합니다. 히스토그램을 두 번 클릭하여 분할 크기 또는 분할 수를 설정하고 적용을 클릭합니다.그런 다음 열을 추가하고 그래프 매개 변수를 설정합니다. 타임시리즈 해석의 경우 시간을 X 및 타임시리즈 매개변수로 설정하여 Y.Click 플롯, 멀티창 및 스택으로 설정합니다. 팝업 창에서 줄을 선택하고 확인합니다. 그런 다음 그래프의 매개 변수를 설정합니다.경도 플라스모닉 최대 40 x 85 나노미터 CTAB 코팅 금 나노로드는 약 650 나노미터이고 횡단 공명은 520 나노미터이다. U87 세포막에 CTAB 코팅 금 나노로드의 산란 강도는 이 실험에서 추적된 CTAB 코팅 금 나노로드가 잘 단분산되었음을 나타내는 유리에 CTAB 코팅 금 나노로드의 폭이 좁은 전형적인 가우시안 분포를 나타낸다. 그림과 같이, 500개 이상의 CTAB 코팅금 나노로드 궤적을 암장 현미경검사에 의해 추적할 수 있으며 장거리 확산 궤적 및 제한된 확산 궤적으로 나눌 수 있다.본 대표적인 분석에서 모든 500개의 궤적의 경화 반경은 0.5 마이크로미터의 평균 반경과 최대 변위가 작은 값으로 더 분포된 작은 값 분포를 보였다. 이 앙상블 시간 평균 평균 제곱 변위 분석에서 입증된 바와 같이, CTAB 코팅 금 나노로드는 일반적으로 약 하나의 알파로 확산된다. 그러나 모든 궤적으로부터 얻은 확산 계수와 알파의 밀도 분포는 금 나노로드의 역학이 초대형, 브라우니아 및 해류 모션을 통해 이질분포를 나타낸다는 것을 보여준다.또한 단일 입자 통계 분석 및 시계열 파라미터 분석을 사용하여 두 가지 대표적인 장기 제한 및 이동 궤적을 특성화할 수 있습니다. 일반적으로 몇 가지 어려운 절충이 있기 때문에 단일 입자 추적 분석 판독에서 데이터의 단일 신규 해석을 요약하고 추출할 필요가 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

연구

생화학

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

셀 연락처에서 단백질 단백질 상호 작용의 형광 변동 분광학 분석 결과

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

전기 화학 및 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 양성자 펌프 막 효소의 연구에 대 한 단일 Liposome 측정

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...