Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China med tilskuddsnummer på 21425519, 91853105 og 21621003.

1. Cellekultur
<ol><li>Forbered komplett medium for U87 MG-celler ved å tilsette føtal storfeserum (endelig konsentrasjon 10%) og penicillin-streptomycin (endelig konsentrasjon 1 %) til det minste essensielle mediet (MEM). Bruk plastcellekulturrett for celler subkultur.</li>
	<li>Passage celler 2 til 3 ganger i uken.<ol>
<li>Fjern kulturmediet og skyll cellelaget med Dulbeccos fosfatbufret saltvann (D-PBS) 2 ~ 3 ganger når samløpet (80% ~ 90%).</li>
		<li>Tilsett 1,0 til 2,0 ml Trypsin-EDTA-løsning i cellekulturfa...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Den presenterte protokollen brukes til å studere dynamikken i AuNRs på cellemembran. Protokollen består av fire deler, inkludert mikroskopisk bildebehandling, datautvinning, beregning av dynamiske parametere og dataanalysemetoder, og hver del er fleksibel og universell. Derfor er det mange mulige fremtidige anvendelser, for eksempel å studere bevegelse av NP-koblede membranmolekyler på membran, endocytose dynamikk av NP-merkede reseptorer, dynamisk analyse av intracellulære NP-er og vesikkelbelagte NP-transport lan...

Dynamikken i nanopartikler (NPs) på membranen er nært forbundet med cellulæropptaksprosessen, noe som er avgjørende for forståelsen av cellefunksjoner, virale eller bakterielle infeksjoner og utvikling av kunstige nanomedisinske leveringssystemer1,2. Enkelt partikkelsporing (SPT) teknikk er et robust verktøy for å karakterisere heterogen atferd av NPs3,4. Generelt er cellemembranen fluidisk, noe som betyr at komponentene som proteiner og lipider kan bevege seg sidealt i plasmamembranplan5,6,7. Den spatiotemporale kompleksiteten i membranorganisasjon og struktur kan føre til spatiotemporal heterogenitet av samspillet mellom NPs og membran. Derfor krever direkte visualisering av bevegelsen av NPs på membranen både høy romlig og timelig oppløsning.
Enkeltpartikkelsporing mikroskopi som overvåker lokalisering av individuelle partikler i levende celler med en romlig oppløsning på titalls nanometer og en tidsoppløsning på millisekunder har blitt godt utviklet for å studere NPs eller membranmolekylerdynamikk 8,9. Fluorescensbaserte mikroskopiske bildeteknikker har blitt verdifulle verktøy for å observere NPs / molekyler i levende cellemiljø9,10,11,12. For eksempel har total intern refleksjon fluorescensmikroskopi, som bilder tynne lag (~ 100 nm) av prøven på substratet / løsningsgrensesnittet med høy spatiotemporal oppløsning blitt mye brukt i studier av membranmolekylerdynamikk 13,14. Imidlertid reduserer de iboende ulempene ved enkeltfluoforer, for eksempel lav intensitet og rask irreversibel fotobleaching nøyaktigheten og varigheten av sporing13. Derfor har ikke-fluorescerende plasmoniske NPer, som erstatter fluorescerende sonder, tiltrukket seg mer og mer oppmerksomhet i langsiktige bildestudier på grunn av deres unike optiskeegenskaper 15. Basert på spredningssignalene fra plasmoniske NP-sonder, har flere typer optiske mikroskopiske bildeteknologier blitt brukt til å studere mekanismen for biologiske prosesser, for eksempel mørkfeltmikroskopi (DFM)16, interferometrisk spredning (iSCAT) mikroskopi17 og differensial interferenskontrastmikroskopi (DICM)18. I tillegg kan bevegelses- og rotasjonsdynamikken til AuNRs oppnås ved hjelp av DFM og DICM18,19,20,21,22. I et SPT-eksperiment registreres vanligvis objektets bevegelse av det optiske mikroskopet, og analyseres deretter av SPT-analysemetoder3. De tidsløste banene og orienteringsvinklene som genereres av individuelle NPer, er normalt stokastisk og heterogen, så det er nødvendig å presentere rikelig dynamisk informasjon med ulike analysemetoder.
Her gir vi en integrert protokoll som overvåker dynamikken i AuNRs på cellemembran ved hjelp av DFM, trekker ut plasseringen og orienteringen til AuNRs med ImageJ og MATLAB og karakteriserer spredningen av AuNRs med SPT-analysemetoder. Som en demonstrasjon viser vi her hvordan du bruker SPT-protokollen til å visualisere dynamikken i umodifiserte AuNRs (CTAB-AuNRs, syntetisert av cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyl som beskyttende middel) på U87 MG cellemembran. Det har blitt vist at CTAB-AuNRs kan adsorbere proteiner i biologisk miljø, bevege seg på cellemembran og deretter gåinn i cellene 2,20,22. U87 MG celle er den vanligste og mest ondartede svulsten i sentralnervesystemet, og dets membranreseptorer er unormalt uttrykt. Membranreseptorene kan samhandle med proteiner på AuNRs, som påvirker dynamikken i AuNRs. Vår protokoll gjelder generelt for andre SPT-eksperimenter innen biologi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Analyse av nanopartiklers diffuse dynamikk på cellemembran spiller en betydelig rolle i bedre forståelse av cellulær opptaksprosessen og gir et teoretisk grunnlag for rasjonell design av nanomedisinlevering. Enkelt partikkelsporing (SPT) analyse kan undersøke posisjonen og orienteringen til individuelle nanopartikler på cellemembran, og avsløre deres translasjonelle og rotasjonstilstander. Her viser vi hvordan du bruker tradisjonell mørkfeltmikroskopi for å overvåke dynamikken i gullnanoroder (AuNRs) på levende cellemembran. Vi viser også hvordan du trekker ut plasseringen og orienteringen til AuNRs ved hjelp av ImageJ og MATLAB, og hvordan man karakteriserer de diffusive tilstander av AuNRs. Statistisk analyse av hundrevis av partikler viser at enkelt AuNRs utfører Brownian bevegelse på overflaten av U87 MG cellemembran. Imidlertid viser individuell lang baneanalyse at AuNRs har to forskjellige typer bevegelsesstater på membranen, nemlig langdistansetransport og begrenset områdebegrensning. Våre SPT-metoder kan potensielt brukes til å studere overflaten eller intracellulær partikkeldiffusjon i forskjellige biologiske celler og kan bli et kraftig verktøy for undersøkelser av komplekse cellulære mekanismer.

I protokollen ble de umodifiserte 40 x 85 nm CTAB-AuNRs brukt. Som vist i figur 2B,er dens langsgående plasmoniske maksimum på ~ 650 nm (rød region) og tverrgående resonans på 520 nm (grønn region). Tidligere litteratur har vist at de optiske egenskapene (for eksempel LSPR intensitet) av plasmoniske AuNRs vil endre seg betydelig med diameter20,22. I figur 2Cviste spredningsintensiteten fra CTAB-AuN...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Her viser vi bruken av tradisjonell mørkfeltmikroskopi for å overvåke dynamikken i gullnanoroder (AuNRs) på cellemembran. Plasseringen og orienteringen til enkelt AuNRs oppdages ved hjelp av ImageJ og MATLAB, og de diffusive tilstander av AuNRs er preget av enkelt partikkelsporingsanalyse.

Visualisere diffus dynamikk av gull nanorods på cellemembran ved hjelp av enkelt nanopartikkel Darkfield mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Vår protokoll bruker enkelt partikkelkontrollanalyse for å overvåke dynamikken plasseringen og orienteringen og karakteriserer diffusjonen av gylne nanoroder på cellemembraner. Ved hjelp av denne metoden kan både den translasjonelle og rotasjonsdynamikken til gylne nanoroder oppnås, og dynamikken kan analyseres grundig og presenteres. Denne protokollen har potensial til å bli brukt til studiet av andre typer komplekse biologiske systemer.Begynn med å brenne en etanolen dyppet glassdeksler på flammen og plassere dekkslippen i en 35 med 10 millimeter cellekulturrett som inneholder to milliliter cellekulturmedium uten fenolrød. Tilsett 50 mikroliter av cellesuspensjonen av interesse på dekkslippen og rist forsiktig parabolen frem og tilbake og til venstre og høyre for å fordele cellene jevnt. Plasser parabolen i cellekulturinkubatoren i ca. 12 timer til cellene når 20 til 40 % samløpet før du legger til 20 mikroliter CTAB-belagte gullnanoroder til parabolen.Etter mild risting for å spre nanorods jevnt over parabolen, legg parabolen i en fuktet atmosfære i fem minutter. På slutten av inkubasjonen, sakte overføre 100 mikroliter av supernatant fra parabolen inn i sporet av et glass lysbilde og forsiktig plassere coverslip cellen side ned på lysbildet sporet, deretter forsegle kanten av coverslip med neglelakk og la neglelakk tørr før du plasserer lysbildet på darkfield mikroskop scenen. For enkel partikkelsporing ved darkfield mikroskopi, legg en dråpe olje på oljen nedsenk darkfield kondensator og vri knotten til kondensatoren kommer i kontakt med glasslysbildet.Plasser en dråpe olje på toppen av dekkglasset og vri fokuseringsknappen til 60X oljenedsenkingsmålet berører oljen. Slå på lyskilden og vri litt fokuseringsknappen for å fokusere bildeplanet. Klikk deretter på kameraikonet i mikroskopprogramvaren for å ta opp en prøve som sprer lysbildetidsserien ved hjelp av CMOS-fargekameraet og lagrer bildet i et TIFF-format.Hvis du vil pakke ut en enkelt langsiktig bane, åpner du bildet i ImageJ og klikker bilde, skriver inn og 8-biters for å konvertere bildet fra RGB-modus til 8-biters modus. Hvis du vil justere kontrasten, klikker du bilde, justerer, lysstyrkekontrast og angir parameterne. Velg en målpartikkel, og bruk Kontroll X til å kutte av bakgrunn for tidsserier.Klikk plugins, partikkel tracker klassisk, og partikkel tracker for å åpne partikkel deteksjon og partikkel kobling vindu og sette radius til seks, cutoff til null, og persentil til 0,01%Sett linkområdet til 10 og forskyvning til 10 og klikk OK for å åpne partikkel tracker resultater vinduet for å se resultatene. Klikk visualiser alle baner for å inspisere de genererte banene. Hvis programvaren generert bane og den bevegelige banen til gull nanorods er matchet, klikk lagre full rapport for å lagre resultatene.Hvis programvaren generert bane ikke samsvarer med den bevegelige banen til gull nanorods, klikk koble partikler for å koble de oppdagede partiklene med forskjellige koblingsområde og persentil parametere. For å finne den midterre pikselkoordinaten til gullnanoroden i hver ramme i henhold til XY-koordinaten, bruk xycoordination. m funksjon.Hvis du vil skille mellom en matrise med tre og tre piksler, trekker du ut de ni spredningsintensitetsverdiene for de røde eller grønne kanalene og beregner en gjennomsnittsverdi, bruker du rgextraction. m funksjon. Bruk deretter polarangle.m-funksjonen for å beregne polarvinklene ved hjelp av tokanals differensialmetoden. Hvis du vil beregne dynamiske parametere ved hjelp av formlene i tabellen, kjører du de to analyseskriptene. For visuell analyse av banen angir du X-koordinaten som X, Y-koordinaten som Y og klokkeslettet som Y, klikker deretter tegne-, punkt- og fargekart, angir diagramparameterne og legger til fargelinjen.Hvis du vil generere gjennomsnittlige kvadratforskyvningstidsintervallfigurer, angir du tidsintervallet som X og gjennomsnittlig kvadratforskyvning som Y.Klikk-plott, scatter, analyse, montering, ikke-lineær kurvetilpasning og åpen dialog og angi grafparametrene. For statistisk analyse med flere partikler angir du de dynamiske parameterne av interesse som Y og klikkplott og histogrammet. Dobbeltklikk histogrammet for å angi divisjonsstørrelsen eller antall divisjoner, og klikk bruk.Legg deretter til en kolonne og angi grafparameterne. For en tidsserieanalyse angir du tidsparameterne X og tidsserieparameterne som Y.Click-tegneskjema, flere ruter og stakk. Velg linje og OK i popup-vinduet. Angi deretter parameterne for grafen.Den langsgående plasmoniske maksimum på 40 av 85 nanometer CTAB belagt gull nanorods er ca 650 nanometer og tverrgående resonans er 520 nanometer. Den strøde intensiteten til CTAB-belagte gullnanoroder på U87-cellemembraner viser en typisk gaussisk fordeling med en smal bredde i samsvar med CTAB-belagte gullnanoroder på glass som indikerer at CTAB-belagte gullnanoroder sporet i dette eksperimentet er godt monodispede. Som illustrert kan mer enn 500 CTAB-belagte gullnanorodbaner spores av darkfield-mikroskopi og kan deles inn i langdistanse diffusjonsbaner og begrensede diffusjonsbaner.Radiusen av gyration av alle 500 baner i denne representative analysen viste en liten verdifordeling med en gjennomsnittlig radius av gyration av 0,5 mikrometer og maks forskyvning var mer fordelt på små verdier. Som demonstrert i dette ensemblet tid gjennomsnittlig gjennomsnittlig firkantet forskyvning analyse, CTAB belagt gull nanorods normalt diffuse med en alfa på omtrent en. Tetthetsfordelingen av diffusjonskoeffisienten og alfaen hentet fra alle banene avslører imidlertid at dynamikken i gullnanorodene viser en heterogen fordeling med superdiffusion, Brownian og subdiffusionbevegelser.I tillegg kan enkeltpartikkel statistisk analyse og tidsserieparameteranalyse brukes til å karakterisere to representative langsiktige begrensede og bevegelige baner. Det er nødvendig å oppsummere og trekke ut en enkelt ny tolkning av data fra på enkelt partikkelsporing analyse avlesning som det er vanligvis noen vanskelige avveininger å gjøre.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Verifiserer strukturen og dynamikken i Nucleosomes med Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enkelt Liposome mål for studiet av Proton pumpe membran enzymer elektrokjemi og fluorescerende mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering av protein-protein interaksjoner ved hjelp av en on-membran fordøyelsen Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produksjon av Dynein og Kinesin motor ensembler på DNA Origami nanostrukturer for single molekyl observasjon

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

En modell membran plattform for rekonstituere mitokondrie membran dynamikk

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...