Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China com números de bolsas de 21425519, 91853105 e 21621003.

1. Cultura celular
<ol><li>Prepare o meio completo para células U87 MG adicionando soro bovino fetal (concentração final 10%) e penicilina-estreptomicina (concentração final 1%) ao meio mínimo essencial (MEM). Use prato de cultura de células plásticas para subcultura celular.</li>
	<li>Células de passagem de 2 a 3 vezes por semana.<ol>
<li>Remova o meio de cultura e enxágue a camada celular com o soro fisco tamponado de Fosfato de Dulbecco (D-PBS) 2~3 vezes quando confluente (80%~90%).</li>
		<li>Adicione 1.0...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

O protocolo apresentado é utilizado para estudar a dinâmica dos AuNRs na membrana celular. O protocolo consiste em quatro partes, incluindo imagem microscópica, extração de dados, cálculo de parâmetros dinâmicos e métodos de análise de dados, e cada parte é flexível e universal. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis, por exemplo, estudando o movimento de moléculas de membrana ligadas ao NP na membrana, dinâmicas de endocitose de receptores rotulados por NP, análise dinâmica de NPs intra...

A dinâmica das nanopartículas (NPs) na membrana está intimamente associada ao processo de captação celular, essencial para a compreensão das funções celulares, infecções virais ou bacterianas e o desenvolvimento de sistemas de entrega nanomédicas artificiais1,2. A técnica de rastreamento de partículas únicas (SPT) é uma ferramenta robusta para caracterizar os comportamentos heterogêneos das NPs3,4. Em geral, a membrana celular é fluidica, o que significa que os componentes como proteínas e lipídios podem se mover lateralmente no plano da membrana plasmática5,6,7. A complexidade espiotemporal da organização e estrutura da membrana pode levar à heterogeneidade espiotemporal da interação entre NPs e membrana. Assim, a visualização direta do movimento de NPs na membrana requer alta resolução espacial e temporal.
Microscopia de rastreamento de partículas únicas que monitora a localização de partículas individuais em células vivas com uma resolução espacial de dezenas de nanômetros e uma resolução temporal de milissegundos foi bem desenvolvida para estudar as NPs ou moléculas de membrana dinâmica8,9. Técnicas de imagem microscópica baseadas em fluorescência tornaram-se ferramentas valiosas para observar NPs/moléculas no ambiente celular vivo9,10,11,12. Por exemplo, a microscopia total de fluorescência de reflexão interna, que imagens de camadas finas (~100 nm) da amostra na interface substrato/solução com alta resolução espátula tem sido amplamente utilizada em estudos da dinâmica das moléculas de membrana13,14. No entanto, as desvantagens inerentes aos fluoroforos únicos, como baixa intensidade e fotobleaching irreversível rápido reduzem a precisão e a duração do rastreamento13. Portanto, NPs plasmônicos não fluorescentes, que substituem as sondas fluorescentes, têm atraído cada vez mais atenção em estudos de imagem de longo prazo devido às suas características ópticas únicas15. Com base nos sinais de dispersão de sondas NP plasmônicas, vários tipos de tecnologias ópticas de imagem microscópica têm sido utilizadas para estudar o mecanismo de processos biológicos, como microscopia de campo escuro (DFM)16,microscopia de dispersão interferométrica (iSCAT)17 e microscopia de contraste de interferência diferencial (DICM)18. Além disso, a dinâmica de movimento e rotação de AuNRs pode ser obtida utilizando DFM e DICM18,19,20,21,22. Normalmente, em um experimento SPT, o movimento do objeto é registrado pelo microscópio óptico e, em seguida, analisado pelos métodos de análise SPT3. As trajetórias e ângulos orientacionais gerados por NPs individuais são normalmente estocásticos e heterogêneos, por isso é necessário apresentar informações dinâmicas abundantes com vários métodos de análise.
Aqui, fornecemos um protocolo integrado que monitora a dinâmica dos AuNRs na membrana celular utilizando DFM, extrai a localização e orientação dos AuNRs com ImageJ e MATLAB e caracteriza a difusão de AuNRs com métodos de análise SPT. Como demonstração, mostramos aqui como usar o protocolo SPT para visualizar dinâmicas de AuNRs não modificados (CTAB-AuNRs, sintetizados pela molécula de brometo de amônio cetililomina como agente protetor) na membrana celular U87 MG. Foi demonstrado que os CTAB-AuNRs podem adsorb proteínas em ambiente biológico, mover-se na membrana celular e, emseguida,entrar nas células2,20,22. A célula U87 MG é o tumor mais comum e mais maligno do sistema nervoso central, e seus receptores de membrana são anormalmente expressos. Os receptores de membrana podem interagir com proteínas em AuNRs, que influenciam a dinâmica dos AuNRs. Nosso protocolo é geralmente aplicável a outros experimentos SPT no campo da biologia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Analisar a dinâmica difusiva das nanopartículas na membrana celular desempenha um papel significativo na melhor compreensão do processo de absorção celular e fornece uma base teórica para o desenho racional da entrega de nanoma medicamentos. A análise de rastreamento de partículas únicas (SPT) poderia sondar a posição e orientação de nanopartículas individuais na membrana celular, e revelar seus estados translacionais e rotacionais. Aqui, mostramos como usar a microscopia tradicional de campo escuro para monitorar a dinâmica dos nanorods de ouro (AuNRs) na membrana celular viva. Também mostramos como extrair a localização e orientação dos AuNRs utilizando ImageJ e MATLAB, e como caracterizar os estados difusivos de AuNRs. A análise estatística de centenas de partículas mostra que um único AuNRs realiza movimento browniano na superfície da membrana celular U87 MG. No entanto, a análise individual de longa trajetória mostra que os AuNRs têm dois tipos distintamente diferentes de estados de movimento na membrana, ou seja, transporte de longo alcance e confinamento de áreas limitadas. Nossos métodos SPT podem ser potencialmente usados para estudar a difusão de partículas superficiais ou intracelulares em diferentes células biológicas e podem se tornar uma ferramenta poderosa para investigações de mecanismos celulares complexos.

No protocolo, foram utilizados os CTAB-AuNRs não modificados de 40 x 85 nm. Como mostrado na Figura 2B, seu máximo plasmônico longitudinal em é de ~650 nm (região vermelha) e a ressonância transversal está em 520 nm (região verde). Literaturas anteriores revelaram que as propriedades ópticas (como a intensidade de LSPR) de AuNRs plasmônicos mudarão significativamente com seu diâmetro20,22. Na Figura 2...

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Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Aqui, mostramos o uso da microscopia tradicional de campo escuro para monitorar a dinâmica dos nanorods de ouro (AuNRs) na membrana celular. A localização e orientação de AuNRs únicos são detectadas usando ImageJ e MATLAB, e os estados difusivos de AuNRs são caracterizados por uma análise de rastreamento de partículas únicas.

Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Nosso protocolo utiliza uma análise de verificação de partículas únicas para monitorar a dinâmica do local e da orientação e caracteriza a difusão de nanorods dourados nas membranas celulares. Utilizando este método, tanto a dinâmica translacional quanto a rotacional dos nanorods dourados podem ser obtidas e a dinâmica pode ser analisada de forma abrangente e apresentada. Este protocolo tem potencial para ser utilizado para o estudo de outros tipos de sistemas biológicos complexos.Comece queimando uma mancha de vidro mergulhada com etanol na chama e colocando o deslizamento de cobertura em um prato de cultura celular de 35 por 10 milímetros contendo dois mililitros de cultura celular sem fenol vermelho. Adicione 50 microliters da suspensão celular de interesse na tampa e agite suavemente o prato para frente e para trás e para a esquerda e para a direita para distribuir uniformemente as células. Coloque o prato na incubadora de cultura celular por aproximadamente 12 horas até que as células atinjam 20 a 40% de confluência antes de adicionar 20 microliters de nanorods de ouro revestidos de CTAB ao prato.Depois de tremer suavemente para dispersar os nanorods uniformemente através do prato, coloque o prato em uma atmosfera umidificada por cinco minutos. No final da incubação, transfira lentamente 100 microlitros de supernadireção do prato para o sulco de um slide de vidro e coloque cuidadosamente o lado da célula de deslizamento para baixo na ranhura de slides, em seguida, selar a borda da tampa com esmalte e deixar o esmalte secar antes de colocar o slide no estágio do microscópio de campo escuro. Para um único rastreamento de partículas por microscopia de campo escuro, coloque uma gota de óleo no condensador de campo escuro e gire o botão até que o condensador entre em contato com a lâmina de vidro.Coloque uma gota de óleo na parte superior do vidro de cobertura e gire o botão de foco até que o objetivo de imersão de óleo de 60X toque o óleo. Acenda a fonte de luz e gire ligeiramente o botão de foco para focar o plano de imagem. Em seguida, clique no ícone da câmera no software do microscópio para gravar uma série de tempo de imagem de dispersão de luz usando a câmera CMOS colorida e salvar a imagem em um formato TIFF.Para extrair uma única trajetória de longo prazo, abra a imagem no ImageJ e clique em imagem, digite e 8 bits para converter a imagem do modo RGB para o modo de 8 bits. Para ajustar o contraste, clique na imagem, ajuste, contraste de brilho e defina os parâmetros. Selecione uma partícula de destino e use o Controle X para cortar o fundo da série temporal.Clique em plugins, rastreador de partículas e rastreador de partículas para abrir a janela de detecção de partículas e partículas e definir o raio para seis, o corte para zero e o percentil para 0,01%Defina o intervalo de link para 10 e o deslocamento para 10 e clique em OK para abrir a janela de resultados do rastreador de partículas para ver os resultados. Clique em visualizar todas as trajetórias para inspecionar as trajetórias geradas. Se a trajetória gerada pelo software e a trajetória móvel dos nanorods de ouro forem combinadas, clique em salvar o relatório completo para salvar os resultados.Se a trajetória gerada pelo software não corresponder à trajetória móvel dos nanorods de ouro, clique em relink partículas para revincular as partículas detectadas com diferentes intervalos de link e parâmetros percentil. Para encontrar a coordenada de pixel central do nanorod de ouro em cada quadro de acordo com a coordenada XY, use a xicoordinação. função m.Para delimitar uma matriz de três por três pixels, extrair os nove valores de intensidade de dispersão dos canais vermelho ou verde e calcular um valor médio, use a rgextraction. função m. Então use o polarangle.função m para calcular os ângulos polares usando o método diferencial de canal duplo. Para calcular parâmetros dinâmicos usando as fórmulas na tabela, execute os dois scripts de análise. Para análise visual da trajetória, defina a coordenada X como X, a coordenada Y como Y, e o tempo como Y, em seguida, clique em plot, dispersão e mapa de cores, defina os parâmetros gráficos e adicione a barra de cores.Para gerar números médios de intervalo de deslocamento quadrado, defina o intervalo de tempo como X e o deslocamento quadrado médio como Y.Clique em plot, dispersão, análise, montagem, encaixe da curva não linear e diálogo aberto e defina os parâmetros gráficos. Para análise estatística de várias partículas, defina os parâmetros dinâmicos de interesse como Y e clique em plot e histograma. Clique duas vezes no histograma para definir o tamanho da divisão ou o número de divisões e clique em aplicar.Em seguida, adicione uma coluna e defina os parâmetros do gráfico. Para uma análise de séries temporáticas, defina o tempo como X e os parâmetros da série temporal como Y.Click plot, multi-pane e stack. Na janela pop-up, selecione linha e OK. Em seguida, defina os parâmetros para o gráfico.O máximo plasmônico longitudinal de 40 por 85 nanômetros CTAB revestido nanorods de ouro é de aproximadamente 650 nanômetros e a ressonância transversal é de 520 nanômetros. A intensidade de dispersão dos nanorods de ouro revestidos de CTAB em membranas celulares U87 demonstra uma distribuição típica gaussiana com uma largura estreita consistente com a de nanorods de ouro revestidos de CTAB em vidro indicando que os nanorods de ouro revestidos CTAB rastreados neste experimento são bem monodisperados. Como ilustrado, mais de 500 trajetórias de nanorod de ouro revestidas de CTAB podem ser rastreadas por microscopia de campo escuro e podem ser divididas em trajetórias de difusão de longo alcance e trajetórias de difusão confinadas.O raio de giro de todas as 500 trajetórias nesta análise representativa mostrou uma distribuição de pequeno valor com um raio médio de giro de 0,5 micrômetros e o deslocamento máximo foi mais distribuído em pequenos valores. Como demonstrado neste conjunto média de tempo análise de deslocamento quadrado, o CTAB revestido nanorods de ouro normalmente difuso com um alfa de aproximadamente um. A distribuição de densidade do coeficiente de difusão e do alfa obtido de todas as trajetórias, no entanto, revela que a dinâmica dos nanorods de ouro exibe uma distribuição heterogênea com movimentos de superdiffusão, browniano e subdiffusão.Além disso, a análise estatística de partículas únicas e a análise de parâmetros da série temporal podem ser utilizadas para caracterizar duas trajetórias representativas confinadas e móveis a longo prazo. É necessário resumir e extrair uma única interpretação nova dos dados da leitura da análise de rastreamento de partículas únicas, pois normalmente existem algumas trocas difíceis de fazer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Análise de uma única partícula de alta resolução a partir de imagens de crio-microscopia de elétrons usando SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Bioquímica

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Avaliação de interações proteína-proteína usando uma técnica de digestão na membrana

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualizando dinâmica sadrindo de receptor estéta de células t usando microscopia de folha de luz de rede

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Uma plataforma de membrana modelo para reconstituir a dinâmica da membrana mitocondrial

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...