Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая с номерами грантов 21425519, 91853105 и 21621003.

1. Культура клеток
<ol><li>Подготовка полной среды для клеток U87 MG путем добавления сыворотки крупного рогатого скота плода (окончательная концентрация 10%) и пенициллин-стрептомицин (окончательная концентрация 1%) до минимальной необходимой среды (MEM). Используйте пластиковые клетки культу...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Представленный протокол используется для изучения динамики AUNRs на клеточной мембране. Протокол состоит из четырех частей, включая микроскопическую визуализацию, извлечение данных, расчет динамических параметров и методы анализа данных, и каждая часть является гибкой и универсальной....

Динамика наночастиц (NPs) на мембране тесно связана с клеточным процессом поглощения, который необходим для понимания клеточных функций, вирусных или бактериальных инфекций и развития искусственных нанометических систем доставки1,2. Техника отслеживания отдельных частиц (SPT) является надежным инструментом для характеристики неоднородного поведения NPs3,4. В целом, клеточная мембрана является жидкой, что означает, что такие компоненты, как белки и липиды могут двигаться боково вплазменной мембране плоскости 5,6,7. Spatiotemporal сложность мембраны организации и структуры может привести к spatiotemporal неоднородность взаимодействия между NPs и мембраны. Следовательно, прямая визуализация движения NPs на мембране требует как высокого пространственного, так и временного разрешения.
Микроскопия слежения за отдельными частицами, которая отслеживает локализацию отдельных частиц в живых клетках с пространственным разрешением в десятки нанометров и разрешением времени миллисекунд, была хорошо разработана для изучения NPs или мембранных молекулдинамики 8,9. Флуоресценция основе микроскопических методов визуализации стали ценными инструментами для наблюдения NPs /молекулы в среде живых клеток 9,10,11,12. Например, общая внутренняя флуоресцентная микроскопия отражения, которая изображения тонких слоев (100 нм) образца на подложке / раствор интерфейс с высоким spatiotemporal разрешение широко используется в исследованиях мембранных молекулдинамики 13,14. Тем не менее, присущие недостатки одиночных флюорофоров, таких как низкая интенсивность и быстрое необратимое фотоотлив снижают точность и продолжительность отслеживания13. Таким образом, нефлуоресцентные плазмонные NPs, которые заменяют флуоресцентные зонды, привлекают все больше и больше внимания в долгосрочных исследованиях изображений из-за их уникальныхоптических характеристик 15. На основе рассеяния сигналов плазмонные зонды NP, несколько видов оптических микроскопических технологий визуализации были использованы для изучения механизма биологических процессов, таких как темно-полевой микроскопии (DFM)16, интерферометрические рассеяния (iSCAT)микроскопии 17 и дифференциального вмешательства контрастной микроскопии (DICM)18. Кроме того, динамику движения и вращения AUNRs можно получить с помощью DFM и DICM18,19,20,21,22. Как правило, в эксперименте SPT движение объекта записывается оптическим микроскопом, а затем анализируется методами анализа SPT3. Решенные по времени траектории и ориентационные углы, генерируемые отдельными NPs, как правило, стохастичны и неоднородны, поэтому необходимо представить обильную динамическую информацию с помощью различных методов анализа.
Здесь мы предоставляем интегрированный протокол, который отслеживает динамику AUNRs на клеточной мембране с помощью DFM, извлекает расположение и ориентацию AuNRs с ImageJ и MATLAB и характеризует распространение AuNRs с методами анализа SPT. В качестве демонстрации мы показываем здесь, как использовать протокол SPT для визуализации динамики неизмененных AuNRs (CTAB-AuNRs, синтезированных cetyltrimethylammonium молекулы бромида аммония в качестве защитного агента) на мембране клеток U87 MG. Было продемонстрировано, что CTAB-AuNRs может адсорбировать белки в биологической среде, двигаться по клеточной мембране, а затемвойти в клетки 2,20,22. Клетка U87 MG является наиболее распространенной и злокачественной опухолью центральной нервной системы, а ее мембранные рецепторы аномально выражены. Мембранные рецепторы могут взаимодействовать с белками на AUNRs, которые влияют на динамику AUNRs. Наш протокол, как правило, применим к другим экспериментам SPT в области биологии.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Анализ диффузной динамики наночастиц на клеточной мембране играет значительную роль в лучшем понимании процесса поглощения клеток и обеспечивает теоретическую основу для рационального проектирования доставки нано-медицины. Анализ слежения за отдельными частицами (SPT) может исследовать положение и ориентацию отдельных наночастиц на клеточной мембране и выявить их трансляционные и вращательное состояния. Здесь мы покажем, как использовать традиционную микроскопию темного поля для мониторинга динамики нанородов золота (AUNRs) на мембране живых клеток. Мы также показываем, как извлечь расположение и ориентацию AuNRs с помощью ImageJ и MATLAB, и как охарактеризовать диффузные состояния AUNRs. Статистический анализ сотен частиц показывает, что одиночные AUNRs выполняют броуианское движение на поверхности мембраны клеток U87 MG. Однако индивидуальный анализ длинной траектории показывает, что AUNRs имеют два совершенно разных типа состояний движения на мембране, а именно транспортировку на большой дальности и ограничение зоны заключения. Наши методы SPT потенциально могут быть использованы для изучения поверхности или внутриклеточной диффузии частиц в различных биологических клетках и могут стать мощным инструментом для исследования сложных клеточных механизмов.

В протоколе использовались неизмененные 40 х 85 нм CTAB-AuNRs. Как показано на рисунке 2B, его продольный плазмонный максимум составляет 650 нм (красная область) и поперечный резонанс находится на уровне 520 нм (зеленая область). Предыдущие литературы показали, что оптические свойс...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Здесь мы показываем использование традиционной микроскопии темного поля для мониторинга динамики нанородов золота (AUNRs) на клеточной мембране. Местоположение и ориентация отдельных AUNRs обнаруживаются с помощью ImageJ и MATLAB, а диффузные состояния AUNRs характеризуются анализом отслеживания отдельных частиц.

Визуализация диффузной динамики золотых нанородов на клеточной мембране с помощью одной наночастицы Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Наш протокол использует анализ одной частицы для мониторинга динамики местоположения и ориентации и характеризует диффузию золотых нанородов на клеточных мембранах. Используя этот метод, можно получить как трансляционную, так и вращательно-динамическую динамику золотых нанородов, а также всесторонне проанализировать динамику и преподносить ее. Этот протокол может быть использован для изучения других типов сложных биологических систем.Начните с сжигания этанола окунутый стеклянный крышку на пламя и размещение крышки в 35 на 10 миллиметров клеточной культуры блюдо, содержащее два миллилитров клеточной культуры среды без фенола красный. Добавьте 50 микролитров клеточной подвески интереса на крышку и аккуратно встряхните блюдо вперед и назад и влево и вправо, чтобы равномерно распределить клетки. Поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры в течение примерно 12 часов, пока клетки не достигнут 20-40%-ного слияния, прежде чем добавить в блюдо 20 микролитров нанородов CTAB с покрытием золота.После нежной тряски, чтобы равномерно разогнать нанороды по всему блюду, поместите блюдо во увлажненную атмосферу в течение пяти минут. В конце инкубации, медленно перенесите 100 микролитров супернатанта из блюда в паз стеклянной горки и аккуратно поместите сторону клетки крышки вниз на слайд паз, затем запечатайте край крышки лаком для ногтей и дайте лаку для ногтей высохнуть перед размещением слайда на стадии микроскопа темного поля. Для отслеживания отдельных частиц с помощью микроскопии темного поля поместите каплю масла на конденсатор темного поля и поверните ручку до тех пор, пока конденсатор не свяжется со стеклянной горкой.Поместите каплю масла на верхнюю часть крышки стекла и поверните фокусировку ручку до 60X нефти погружения цель касается масла. Включите источник света и слегка поверните фокусировку ручки, чтобы сфокусировать плоскость изображения. Затем нажмите значок камеры в программном обеспечении микроскопа, чтобы записать образец рассеяния светового изображения с помощью цветной камеры CMOS и сохранить изображение в формате TIFF.Чтобы извлечь одну долгосрочную траекторию, откройте изображение в ImageJ и нажмите изображение, введите и 8-битный для преобразования изображения из режима RGB в 8-битный режим. Чтобы настроить контраст, нажмите на изображение, отрегулируйте, контрастность яркости и установите параметры. Выберите целевую частицу и используйте Control X, чтобы отрезать фон тайм-ряда.Нажмите плагины, частицы трекер классический, и частицы трекер, чтобы открыть обнаружение частиц и частиц, связывающих окно и установить радиус до шести, отсечения до нуля, и процентиль до 0,01%Установить диапазон ссылок до 10 и смещения до 10 и нажмите OK, чтобы открыть окно результатов трекер частиц, чтобы увидеть результаты. Нажмите визуализировать все траектории для проверки генерируемых траекторий. Если программное обеспечение генерируется траектории и траектории движения золотых нанородов совпадают, нажмите сохранить полный отчет, чтобы сохранить результаты.Если генерируемая программным обеспечением траектория не соответствует траектории движения золотых нанородов, щелкните частицы пересылки для повторной связи обнаруженных частиц с различным диапазоном ссылок и параметрами процентиля. Чтобы найти центральную пиксельную координату золотого нанорода в каждом кадре в соответствии с координатами XY, используйте ксикоординацию. м функции.Чтобы разграничить матрицу из трех на три пикселя, извлечь девять значений интенсивности рассеяния красных или зеленых каналов и рассчитать среднее значение, используйте rgextraction. м функции. Затем используйте поляризацию.m функция для расчета полярных углов с помощью метода дифференциала двойного канала. Для расчета динамических параметров с помощью формул в таблице запустите два сценария анализа. Для визуального анализа траектории установите координаты X как X, Y координируйте как Y, и время, как Y, затем нажмите на участок, рассеяние и цветную карту, установите параметры графика и добавьте цветовую планку.Для генерации средних цифр интервала времени перемещения квадрата установите интервал времени как X и среднее квадратное смещение как Y.Click участок, рассеяние, анализ, фитинг, нелинейная установка кривой и открытый диалог и установите параметры графика. Для многочастицового статистического анализа установите динамические параметры интереса как Y и нажмите на участок и гистограмму. Дважды нажмите на гистограмму, чтобы установить размер деления или количество делений и нажмите применить.Затем добавьте столбец и установите параметры графика. Для анализа тайм-рядов установите время в качестве параметров X и тайм-рядов, такие как Y.Click plot, multi-pane и стек. В всплывающем окне выберите строку и ОК. Затем установите параметры для графика.Продольный плазмонный максимум 40 на 85 нанометров CTAB покрытием золотых нанородов составляет около 650 нанометров и поперечный резонанс составляет 520 нанометров. Интенсивность рассеяния нанородов CTAB с покрытием золота на клеточных мембранах U87 демонстрирует типичное гауссийское распределение с узкой шириной, в соответствии с нанородами CTAB с покрытием золота на стекле, что указывает на то, что нанороды CTAB с покрытием, отслеживаемые в этом эксперименте, хорошо монодисперсны. Как показано на примере, более 500 траекторий нанородного слоя CTAB с покрытием золота можно отслеживать с помощью микроскопии темного поля и можно разделить на траектории диффузии дальнего действия и ограниченные траектории диффузии.Радиус gyration всех 500 траекторий в этом репрезентативном анализе показал небольшое распределение значения со средним радиусом gyration 0.5 микрометров и максимальное смещение было более распределено на малых значениях. Как попродемонстрировано в этом ансамбле время среднего среднего квадратного смещения анализа, CTAB покрытием золотых нанородов обычно диффузных с альфа примерно один. Распределение плотности коэффициента диффузии и альфа, полученного со всех траекторий, однако, показывает, что динамика золотых нанородов демонстрирует неоднородное распределение со сверхдиффузией, броунительными и субдифференцированными движениями.Кроме того, для характеристики двух репрезентативных долгосрочных ограниченных и движущихся траекторий можно использовать статистический анализ отдельных частиц и анализ параметров часовых рядов. Необходимо обобщить и извлечь одну новую интерпретацию данных из считывания анализа одного отслеживания частиц, поскольку, как правило, существуют некоторые трудные компромиссы.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Модель Мембранная платформа для восстановления митохондриальной динамики мембран

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...