Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China med bidragsnummer 21425519, 91853105 och 21621003.

1. Cellkultur
<ol><li>Förbered komplett medium för U87 MG-celler genom att tillsätta fetala nötkreatursserum (slutlig koncentration 10%) och penicillin-streptomycin (slutlig koncentration 1%) till det minsta väsentliga mediet (MEM). Använd plastcellsodlingsform för cellsubkultur.</li>
	<li>Passageceller 2 till 3 gånger i veckan.<ol>
<li>Ta bort odlingsmediet och skölj cellskiktet med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) 2 ~ 3 gånger när den konfluent (80%~ 90%).</li>
		<li>Tillsätt 1,0 till 2,0 ml ...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Det presenterade protokollet används för att studera dynamiken hos AuNRs på cellmembran. Protokollet består av fyra delar, inklusive mikroskopisk avbildning, datautvinning, beräkning av dynamiska parametrar och dataanalysmetoder, och varje del är flexibel och universell. Därför finns det många möjliga framtida tillämpningar, till exempel studier av rörelse av NP-länkade membranmolekyler på membran, endocytosdynamik hos NP-märkta receptorer, dynamisk analys av intracellulära NPs och vesikelbelagda NPs-tran...

Dynamiken hos nanopartiklar (NPs) på membranet är nära förknippad med cellulära upptagsprocessen, vilket är viktigt för förståelsen av cellfunktioner, virus- eller bakterieinfektioner och utvecklingen av artificiella nanomedicinska leveranssystem1,2. SPT-teknik (Single Particle Tracking) är ett robust verktyg för att karakterisera de heterogena beteendena hos NPs3,4. I allmänhet är cellmembranet fluidiskt, vilket innebär att komponenter som proteiner och lipider kan röra sig i senareled i plasmamembranplanet5,6,7. Spatiotemporal komplexiteten i membran organisation och struktur kan leda till spatiotemporal heterogenitet av interaktionen mellan NPs och membran. Därför kräver direkt visualisering av rörelsen av NPs på membranet både hög rumslig och temporal upplösning.
Enpartikelspårningsmikroskopi som övervakar lokaliseringen av enskilda partiklar i levande celler med en rumslig upplösning på tiotals nanometer och en tidsupplösning av millisekunder har utvecklats väl för att studera NPs eller membranmolekylernasdynamik 8,9. Fluorescensbaserade mikroskopiska avbildningstekniker har blivit värdefulla verktyg för att observera NPs / molekyler i levande cellmiljö9,10,11,12. Till exempel har total intern reflektion fluorescensmikroskopi, som avbildar tunna lager (~ 100 nm) av provet vid substrat/ lösningsgränssnittet med hög spatiotemporal upplösning, använts i stor utsträckning i studier av membranmolekyldynamik13,14. De inneboende nackdelarna med enstaka fluorforer, såsom låg intensitet och snabb irreversibel fotoblekning minskar dock noggrannheten och varaktigheten förspårning 13. Därför har icke-fluorescerande plasmoniska NPs, som ersätter fluorescerande sonder, lockat mer och mer uppmärksamhet i långsiktiga avbildningsstudier på grund av deras unika optiska egenskaper15. Baserat på spridningssignalerna från plasmoniska NP-sonder har flera typer av optisk mikroskopisk bildteknik använts för att studera mekanismen för biologiska processer, såsom mörkfältsmikroskopi (DFM)16, interferometrisk spridning (iSCAT)mikroskopi 17 och differentiell interferenskontrastmikroskopi (DICM)18. Dessutom kan rörelse- och rotationsdynamiken hos AuNR erhållas med DFM och DICM18,19,20,21,22. Vanligtvis registreras objektets rörelse av det optiska mikroskopet i ett SPT-experiment och analyseras sedan med SPT-analysmetoder3. De tidsavgjorda banorna och orienteringsvinklarna som genereras av enskilda NPs är normalt stokastiska och heterogena, så det är nödvändigt att presentera riklig dynamisk information med olika analysmetoder.
Här tillhandahåller vi ett integrerat protokoll som övervakar dynamiken hos AuNRs på cellmembran med DFM, extraherar placeringen och orienteringen av AuNRs med ImageJ och MATLAB och karakteriserar spridningen av AuNRs med SPT-analysmetoder. Som en demonstration visar vi här hur man använder SPT-protokollet för att visualisera dynamiken hos omodifierade aunr (CTAB-AuNRs, syntetiserade av cetyltrimethylammonium ammoniumbromidmolekyl som skyddsmedel) på U87 MG-cellmembran. Det har visat sig att CTAB-AuNRs kan adsorbera proteiner i biologisk miljö, flytta på cellmembranet och sedan komma in icellerna 2,20,22. U87 MG-cellen är den vanligaste och mest maligna tumören i centrala nervsystemet, och dess membranreceptorer uttrycks onormalt. Membranreceptorerna kan interagera med proteiner på AuNR, vilket påverkar dynamiken hos AuNRs. Vårt protokoll är allmänt tillämpligt på andra SPT-experiment inom biologiområdet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Att analysera nanopartiklarnas diffusionella dynamik på cellmembranet spelar en viktig roll för att bättre förstå den cellulära upptagsprocessen och ger en teoretisk grund för den rationella utformningen av nanomedicinsk leverans. SPT-analys (Single Particle Tracking) kan undersöka positionen och orienteringen av enskilda nanopartiklar på cellmembranet och avslöja deras translationella och roterande tillstånd. Här visar vi hur man använder traditionell mörkfältsmikroskopi för att övervaka dynamiken hos guldnanoroder (AuNRs) på levande cellmembran. Vi visar också hur man extraherar platsen och orienteringen för AuNRs med ImageJ och MATLAB, och hur man karakteriserar aunrs diffusiva tillstånd. Statistisk analys av hundratals partiklar visar att enstaka AuNR utför brownsk rörelse på ytan av U87 MG cellmembran. Individuell långloppsanalys visar dock att AuNR har två tydligt olika typer av rörelse tillstånd på membranet, nämligen långdistanstransport och begränsad område inneslutning. Våra SPT-metoder kan potentiellt användas för att studera ytan eller intracellulär partikeldiffusion i olika biologiska celler och kan bli ett kraftfullt verktyg för undersökningar av komplexa cellulära mekanismer.

I protokollet användes de oförändrade 40 x 85 nm CTAB-AuNRs. Som visas i figur 2Bär dess längsgående plasmoniska max vid ~650 nm (röd region) och tvärgående resonans 520 nm (grön region). Tidigare litteraturer har visat att de optiska egenskaperna (såsom LSPR-intensitet) hos plasmoniska AuNRs kommer att förändras avsevärt med deras diameter20,22. I figur 2Cvisade spridningsintensiteten frå...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Här visar vi användningen av traditionell mörkfältsmikroskopi för att övervaka dynamiken hos guldnanoroder (AuNRs) på cellmembranet. Placeringen och orienteringen av enskilda AuNR identifieras med ImageJ och MATLAB, och aunr:s diffusiva tillstånd kännetecknas av analys av enstaka partikelspårning.

Visualisera diffusionell dynamik av guldnanroder på cellmembran med hjälp av en nanopartikel Darkfield Mikroskopi

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Vårt protokoll använder en enda partikelkontrollanalys för att övervaka dynamiken platsen och orienteringen och karakteriserar diffusionen av gyllene nanoroder på cellmembran. Med hjälp av denna metod kan både translationell och rotationsdynamiken hos gyllene nanoroder erhållas och dynamiken kan analyseras omfattande och presenteras. Detta protokoll har potential att användas för studier av andra typer av komplexa biologiska system.Börja med att bränna ett etanol doppat glaslock på lågan och placera täcket i en 35 till 10 millimeters cellkulturrätt som innehåller två milliliter cellkulturmedium utan fenolrött. Tillsätt 50 mikroliter av cellupphängningen av intresse på täckglaset och skaka försiktigt skålen fram och tillbaka och vänster och höger för att fördela cellerna jämnt. Placera skålen i cellkulturinkubatorn i cirka 12 timmar tills cellerna når 20 till 40% confluency innan du lägger till 20 mikroliter CTAB-belagda guldnanoroder till skålen.Efter skonsam skakning för att sprida nanoroderna jämnt över skålen, placera skålen i en fuktig atmosfär i fem minuter. I slutet av inkubationen, överför långsamt 100 mikroliter supernatant från skålen till spåret på en glasrutschbana och placera försiktigt täckcellssidan ner på glidspåret, försegla sedan kanten på täcket med nagellack och låt nagellacket torka innan du placerar glidningen på darkfield mikroskopstadiet. För enkel partikelspårning med darkfieldmikroskopi, placera en droppe olja på oljans nedsänkta darkfieldkondensator och vrid ratten tills kondensorn kommer i kontakt med glasglaset.Placera en droppe olja på toppen av täckglaset och vrid på fokuseringsknappen tills oljesänkningsmålet på 60X vidrör oljan. Slå på ljuskällan och vrid på fokuseringsknappen något för att fokusera bildplanet. Klicka sedan på kameraikonen i mikroskopprogramvaran för att spela in en exempel på spridning av ljusbildtidsserie med hjälp av färgen CMOS-kamera och spara bilden i ett TIFF-format.Om du vill extrahera en enda långsiktig bana öppnar du bilden i ImageJ och klickar på bild, skriver och 8-bitars för att konvertera bilden från RGB-läge till 8-bitarsläge. Om du vill justera kontrasten klickar du på bild, justerar, kontrasterar ljusstyrkan och ställer in parametrarna. Välj en målpartikel och använd Control X för att klippa av tidsseriebakgrunden.Klicka på plugins, particle tracker classic och particle tracker för att öppna partikeldetekterings- och partikellänkfönstret och ställ in radien på sex, cutoffen till noll och percentilen till 0,01%Ställ in länkområdet på 10 och förskjutningen till 10 och klicka på OK för att öppna fönstret för partikelspårarens resultat för att se resultaten. Klicka på visualisera alla banor för att inspektera de genererade banorna. Om den programvarugenererade banan och den rörliga banan för guldnanoroderna matchas klickar du på spara fullständig rapport för att spara resultaten.Om den programvarugenererade banan inte matchar den rörliga banan för guldnanoroderna klickar du på länka om partiklar för att länka om de detekterade partiklarna med olika länkområde och percentilparametrar. Om du vill hitta guldnanrodens mittpixelkoordinate i varje bildruta enligt XY-koordinaten använder du xykoordineringen. m funktion.Om du vill avgränsa en matris med tre x tre bildpunkter extraherar du de nio spridningsintensitetsvärdena för de röda eller gröna kanalerna och beräknar ett medelvärde, använder du rgextraktionen. m funktion. Använd sedan polaranglet.m funktion för att beräkna polära vinklar med hjälp av dual channel differentialmetoden. Om du vill beräkna dynamiska parametrar med hjälp av formlerna i tabellen kör du de två analysskripten. För visuell analys av banan ställer du in X-koordinaten som X, Y-koordinaten som Y och tiden som Y, klickar sedan på rita, punkt och färgkarta, ställer in diagramparametrarna och lägger till färgfältet.Om du vill generera genomsnittliga siffror för kvadratisk förskjutningstid ställer du in tidsintervallet som X och den genomsnittliga kvadratförskjutningen som Y.Klicka på diagram, punkt, analys, montering, icke-linjär kurvpassning och öppen dialog och ställ in diagramparametrarna. För statistisk analys med flera partiklar anger du de dynamiska parametrarna av intresse som Y och klickar på diagram och histogram. Dubbelklicka på histogrammet för att ange divisionsstorleken eller antalet divisioner och klicka på Använd.Lägg sedan till en kolumn och ange diagramparametrarna. För en tidsserieanalys anger du tiden som X och tidsserieparametrarna som Y.Click-diagram, flera fönsterrutor och stack. I popup-fönstret väljer du rad och OK. Ställ sedan in parametrarna för diagrammet.Det längsgående plasmoniska maxvärdet 40 av 85 nanometer CTAB belagda guldnanoroder är cirka 650 nanometer och den tvärgående resonansen är 520 nanometer. Spridningsintensiteten hos CTAB-belagda guldnanoroder på U87-cellmembran visar en typisk gaussisk fördelning med en smal bredd som överensstämmer med CTAB-belagda guldnanoroder på glas som indikerar att CTAB-belagda guldnanoroder som spåras i detta experiment är väl monodispersed. Som illustreras kan mer än 500 CTAB-belagda guldnanorodbanor spåras med darkfieldmikroskopi och kan delas in i diffusionsbanor med lång räckvidd och begränsade diffusionsbanor.Radien för gyration av alla 500 banor i denna representativa analys visade en liten värdefördelning med en genomsnittlig radie av gyration på 0,5 mikrometer och max förskjutningen var mer fördelad vid små värden. Som framgår av denna ensemble tid genomsnittliga genomsnittliga kvadratisk förskjutning analys, CTAB belagda guld nanorods normalt diffusa med en alfa på ungefär en. Densitetsfördelningen av diffusionskoefficienten och alfan som erhålls från alla banor avslöjar dock att dynamiken hos guldnanroderna uppvisar en heterogen fördelning med superdiffusion, brownska och subdiffusionsrörelser.Dessutom kan enpartikel statistisk analys och tidsserie parameter analys användas för att karakterisera två representativa långsiktiga begränsade och rörliga banor. Det är nödvändigt att sammanfatta och extrahera en enda ny tolkning av data från på den enda partikelspårningsanalysavläsningen eftersom det vanligtvis finns några svåra kompromisser att göra.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Enda Liposom mätningar för studien av Proton-pumpning membran enzymer med elektrokemi och fluorescerande mikroskopi

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Utvärdering av protein-proteininteraktioner med hjälp av en on-membran rötnings teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisera Surface T-cellsreceptordynamik fyrdimensionellt använda lattice ljusark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

En modell membran plattform för rekonstituering mitokondriellt membran Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...