Name: visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy
Uploaded: 2021-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından 21425519, 91853105 ve 21621003 hibe numaralarıyla desteklendi.

1. Hücre kültürü
<ol><li>Fetal sığır serumu ekleyerek U87 MG hücreleri için komple ortam hazırlayın (son konsantrasyon% 10) ve penisilin-streptomisin (son konsantrasyon %1) minimum temel ortama (MEM). Hücreler alt kültürü için plastik hücre kültürü çanağı kullanın.</li>
	<li>Pasaj hücreleri haftada 2 ila 3 kez.<ol>
<li>Kültür ortamını çıkarın ve hücre tabakasını Dulbecco'nun fosfat tamponlu saliniyle (D-PBS) birleştiğinde 2 ~3 kez durulayın (%80~%90).</li>
		<li>Hücre kültürü ?...

<ol>
	<li>Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+heterogeneous+nanoparticle+uptake+by+cells.">The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).</li><li>Behzadi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+nanoparticles:+journey+inside+the+cell.">Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell.</a> Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Particle+Tracking:+From+Theory+to+Biophysical+Applications.">Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+connecting+the+dots.">Single-particle tracking: connecting the dots.</a> Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).</li><li>Kusumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+organizing+principles+of+the+plasma+membrane+that+regulate+signal+transduction:+commemorating+the+fortieth+anniversary+of+Singer+and+Nicolson's+fluid-mosaic+model.">Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson's fluid-mosaic model.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).</li><li>Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lateral+Organization+and+Mobility+of+Plasma+Membrane+Components.">The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components.</a> Cell. 177 (4), 806-819 (2019).</li><li>Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mystery+of+membrane+organization:+composition,+regulation+and+roles+of+lipid+rafts.">The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).</li><li>von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Localization+of+Single+Molecules+for+Super-Resolution+Imaging+and+Single-Particle+Tracking.">Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking.</a> Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).</li><li>Rosenberg, J., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Surface+T-Cell+Receptor+Dynamics+Four-Dimensionally+Using+Lattice+Light-Sheet+Microscopy.">Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).</li><li>Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+single+molecules+at+work+in+living+cells.">Tracking single molecules at work in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).</li><li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules.">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+protein-DNA+interactions+in+live+bacterial+cells+using+photoactivated+single-molecule+tracking.">Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).</li><li>Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+events,+one+quantum+dot+at+a+time.">Probing cellular events, one quantum dot at a time.</a> Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).</li><li>Mehidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Activations+of+Rac1+at+the+Lamellipodium+Tip+Trigger+Membrane+Protrusion.">Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion.</a> Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).</li><li>Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Particle+Tracking+with+Scattering-Based+Optical+Microscopy.">Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).</li><li>Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Heterogeneity+of+Reactions+in+Solution+Observed+with+High-Speed+Single-Nanorod+Rotational+Sensing.">Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).</li><li>Taylor, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+reveals+microsecond+nanoscopic+protein+motion+on+a+live+cell+membrane.">Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane.</a> Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+rotational+behaviors+of+rod-shaped+cargo+revealed+by+automated+five-dimensional+single+particle+tracking.">Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking.</a> Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).</li><li>Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+the+orientation+dynamics+of+single+protein-coated+nanoparticles+at+liquid/solid+interfaces.">Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces.</a> Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).</li><li>Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Dimensional+Orientational+Imaging+of+Nanoparticles+with+Darkfield+Microscopy.">Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy.</a> Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).</li><li>Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+observation+of+dynamic+heterogeneity+of+gold+nanorods+on+plasma+membrane+with+darkfield+microscopy.">Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy.</a> Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Janczura, J., Weron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergodicity+testing+for+anomalous+diffusion:+small+sample+statistics.">Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics.</a> The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+particle+tracking-based+reaction+progress+kinetic+analysis+reveals+a+series+of+molecular+mechanisms+of+cetuximab-induced+EGFR+processes+in+a+single+living+cell.">Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell.</a> Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).</li><li>Kurzthaler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+Spatiotemporal+Dynamics+of+Catalytic+Janus+Particles+with+Single-Particle+Tracking+and+Differential+Dynamic+Microscopy.">Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy.</a> Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).</li><li>Lin, X., Pan, Q., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+protein+corona+on+single+particle+by+rotational+diffusivity.">In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity.</a> Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).</li><li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+localization+imaging+of+a+plasmonic+nanoparticle+pair+with+wavelength-resolved+dark-field+microscopy.">Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy.</a> Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).</li><li>Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-limited+plasmonic+imaging+with+anisotropic+metal+nanoparticles.">Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).</li><li>Belyy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhotoGate+microscopy+to+track+single+molecules+in+crowded+environments.">PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments.</a> Nature Communication. 8, 13978 (2017).</li></ol>

Sunulan protokol, AuNR'lerin hücre zarı üzerindeki dinamiklerini incelemek için kullanılır. Mikroskobik görüntüleme, veri çıkarma, dinamik parametre hesaplama ve veri analizi yöntemleri olmak üzere dört bölümden oluşan protokolde her bölüm esnek ve evrenseldir. Bu nedenle, örneğin, NP bağlantılı membran moleküllerinin membran üzerindeki hareketini, NP etiketli reseptörlerin endositoz dinamiklerini, hücre içi NP'lerin dinamik analizini ve mikrotübüller boyunca vezikül kaplı NPs taşımacı...

Membran üzerindeki nanopartiküllerin (NP) dinamikleri, hücre fonksiyonlarının, viral veya bakteriyel enfeksiyonların anlaşılması ve yapay nanomedikal iletim sistemlerinin geliştirilmesi için gerekli olan hücresel alım süreci ile yakından ilişkilidir1,2. Tek parçacık izleme (SPT) tekniği, NPs3,4'ünheterojen davranışlarını karakterize etmek için sağlam bir araçtır. Genel olarak, hücre zarı akışkandır, bu da proteinler ve lipitler gibi bileşenlerin plazma membran düzleminde yanal olarak hareket edebileceği anlamına gelir5,6,7. Membran organizasyonu ve yapısının mekansal karmaşıklığı, NP'ler ve membran arasındaki etkileşimin mekansal heterojenliğine yol açabilir. Bu nedenle, NP'lerin membran üzerindeki hareketinin doğrudan görselleştirilmesi hem yüksek uzamsal hem de zamansal çözünürlük gerektirir.
Canlı hücrelerdeki tek tek parçacıkların lokalizasyonunu onlarca nanometre uzamsal çözünürlük ve milisaniyelik bir zaman çözünürlüğü ile izleyen tek parçacık izleme mikroskopisi, NP'leri veya membran molekülleri dinamiklerini incelemek için iyi geliştirilmiştir8,9. Floresan bazlı mikroskobik görüntüleme teknikleri canlı hücre ortamında NP/molekülleri gözlemlemek için değerli araçlar haline gelmiştir9,10,11,12. Örneğin, numunenin ince katmanlarını (~100 nm) yüksek patiotemporal çözünürlüğe sahip substrat/çözelti arayüzünde gösteren toplam iç yansıma floresan mikroskopisi, membran molekülleri dinamikleri13,14çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu ve hızlı geri dönüşü olmayan fotobleaching gibi tek floroforların doğal dezavantajları izleme doğruluğunu ve süresini azaltır13. Bu nedenle, floresan probların yerini alan floresan olmayan plazmonik NP'ler, benzersiz optik özellikleri nedeniyle uzun süreli görüntüleme çalışmalarında giderek daha fazla dikkat çekmiştir15. Plazmonik NP problarının saçılma sinyallerine dayanarak, karanlık alan mikroskopisi (DFM)16,interferometrik saçılma (iSCAT) mikroskopisi 17 ve diferansiyel girişim kontrastı mikroskopisi(DICM) 18 gibi biyolojik süreçlerin mekanizmasını incelemek için çeşitli optik mikroskobik görüntüleme teknolojileri kullanılmıştır. Ek olarak, AuNR'ların hareket ve dönme dinamiği DFM ve DICM18 , 19,20,21,22kullanılarak elde edilebilir. Tipik olarak, bir SPT deneyinde, nesnenin hareketi optik mikroskop tarafından kaydedilir ve daha sonra SPT analiz yöntemleri ile analiz edilir3. Bireysel NP'ler tarafından oluşturulan zaman çözümlenmiş yörüngeler ve oryantasyonsal açılar normalde stokastik ve heterojendir, bu nedenle çeşitli analiz yöntemleriyle bol dinamik bilgi sunmak gerekir.
Burada, DFM kullanarak Hücre zarı üzerindeki AuNR'lerin dinamiklerini izleyen, ImageJ ve MATLAB ile AuNR'lerin konumunu ve yönünü çıkaran ve AuNR'lerin difüzyonunu SPT analiz yöntemleriyle karakterize eden entegre bir protokol sunuyoruz. Bir gösteri olarak, U87 MG hücre zarında değiştirilmemiş AuNR'lerin (Cetyltrimethylammonium amonyum bromür molekülü tarafından koruyucu ajan olarak sentezlenen CTAB-AuNRs) dinamiklerini görselleştirmek için SPT protokolünün nasıl kullanılacağını burada gösteriyoruz. CTAB-AuNR'lerin biyolojik ortamda proteinleri adsorbe edebileceği, hücre zarı üzerinde hareket edebileceği ve daha sonra 2,20,22hücrelerine girebileceği gösterilmiştir. U87 MG hücre merkezi sinir sisteminin en sık görülen ve en kötü huylu tümörüdür ve membran reseptörleri anormal bir şekilde ifade edilir. Membran reseptörleri, AuNR'lerin dinamiklerini etkileyen AuNR'lerdeki proteinlerle etkileşime girebilir. Protokolümüz genellikle biyoloji alanındaki diğer SPT deneyleri için geçerlidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs)</td>
			<td>Nanoseedz</td>
			<td>NR-40-650</td>
			<td>85 nm * 40 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CMOS camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP74</td>
			<td>Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>z10212222C</td>
			<td>22*22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dark-field microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td>upright microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>2.0.0-rc-69/1.52 p</td>
			<td>a distribution of ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grooved glass slide</td>
			<td>Sail brand</td>
			<td>7103</td>
			<td>Single concave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.52 j</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>R2019b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-010-CVR</td>
			<td>with phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200038</td>
			<td>no phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td>Origin Pro 2018C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cell culture dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>35*10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 MG cell</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-14</td>
			<td>a human primary glioblastoma cell line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing diffusional dynamics of gold nanorods on cell membrane using single nanoparticle darkfield microscopy

Hücre zarı üzerindeki nanopartiküllerin difüzyonel dinamiklerinin analiz etmek, hücresel alım sürecinin daha iyi anlaşılmasında önemli bir rol oynar ve nano-tıp teslimatının rasyonel tasarımı için teorik bir temel sağlar. Tek parçacık izleme (SPT) analizi, hücre zarı üzerindeki bireysel nanopartiküllerin konumunu ve yönünü araştırabilir ve çevirisel ve dönme durumlarını ortaya getirebilir. Burada, canlı hücre zarında altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca ImageJ ve MATLAB kullanarak AuNR'lerin konumunun ve yönünün nasıl çıkarılacağını ve AuNR'lerin difüzör durumlarının nasıl karakterize edeceğini gösteriyoruz. Yüzlerce parçacığın istatistiksel analizi, tek AuNR'lerin U87 MG hücre zarının yüzeyinde Brownian hareketi gerçekleştirdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bireysel uzun yörünge analizi, AuNR'ların membran üzerinde iki belirgin şekilde farklı hareket durumlarının olduğunu göstermektedir, yani uzun menzilli taşıma ve sınırlı alan hapsi. SPT yöntemlerimiz potansiyel olarak farklı biyolojik hücrelerdeki yüzey veya hücre içi parçacık difüzyonunu incelemek için kullanılabilir ve karmaşık hücresel mekanizmaların araştırılması için güçlü bir araç haline gelebilir.

Protokolde değiştirilmemiş 40 x 85 nm CTAB-AuNR kullanıldı. Şekil 2B'degösterildiği gibi, boyuna plazmonik maksimum değeri ~650 nm 'dir (kırmızı bölge) ve enine rezonansı 520 nm'dedir (yeşil bölge). Önceki literatürler plazmonik AuNR'lerin optik özelliklerinin (LSPR yoğunluğu gibi) çapları20,22ile önemli ölçüde değişeceğini ortaya koydu. Şekil 2C'de, U87 hücre zarında CTA...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy at JoVE.com

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Burada, hücre zarındaki altın nanorodların (AuNR) dinamiklerini izlemek için geleneksel karanlık alan mikroskopisinin kullanımını gösteriyoruz. Tek AuNR'lerin konumu ve yönü ImageJ ve MATLAB kullanılarak algılanır ve AuNR'lerin difüzif durumları tek parçacık izleme analizi ile karakterize edilir.

Tek Nanopartikül Darkfield Mikroskopisi Kullanarak Hücre Zarında Altın Nanorodların Difüzyonel Dinamiklerini Görselleştirme

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Protokolümüz, dinamikleri, konumu ve yönelimi izlemek için tek parçacık kontrol analizini kullanır ve altın nanorodların hücre zarlarında difüzyonunu karakterize eder. Bu yöntem kullanılarak, altın nanorodların hem çevirisel hem de dönme dinamikleri elde edilebilir ve dinamik kapsamlı bir şekilde analiz edilebilir ve sunulabilir. Bu protokol, diğer karmaşık biyolojik sistem türlerinin incelenmesi için kullanılma potansiyeline sahiptir.Alevin üzerine etanol batırılmış bir cam kapak kılıfı yakarak ve kapakları fenol kırmızısı olmadan iki mililitre hücre kültürü ortamı içeren 35 ila 10 milimetre hücre kültürü kabına yerleştirerek başlayın. Kapakçık üzerine 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücreleri eşit bir şekilde dağıtmak için kabı ileri geri ve sola doğru hafifçe sallayın. Çanağa 20 mikrolitre CTAB kaplı altın nanorod eklemeden önce, hücreler% 20 ila% 40 izdiahına ulaşana kadar yaklaşık 12 saat boyunca çanağı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Nanorodları yemek boyunca eşit bir şekilde dağıtmak için hafifçe salladıktan sonra, yemeği beş dakika boyunca nemli bir atmosfere yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, tabaktan 100 mikrolitreyi yavaşça bir cam kaydırağın oluğuna aktarın ve kapak hücresi tarafını dikkatlice slayt oluğuna yerleştirin, ardından kapak kapağının kenarını oje ile kapatın ve slaydı karanlık alan mikroskop aşamasına yerleştirmeden önce ojeyi kurumaya bırakın. Darkfield mikroskopisi ile tek parçacık takibi için, yağ daldırma koyu alan kondenserine bir damla yağ yerleştirin ve kondenser cam kaydırağa temas edene kadar düğmeyi çevirin.Kapak camının üstüne bir damla yağ yerleştirin ve 60X yağ daldırma hedefi yağa temas edene kadar odaklama düğmesini çevirin. Işık kaynağını açın ve görüntüleme düzlemini odaklamak için odaklama düğmesini hafifçe çevirin. Ardından, CMOS renkli kamerayı kullanarak örnek saçılma ışığı görüntü zaman serisini kaydetmek ve görüntüyü TIFF biçiminde kaydetmek için mikroskop yazılımındaki kamera simgesini tıklatın.Tek bir uzun vadeli yörünge ayıklamak için görüntüyü ImageJ'de açın ve görüntüyü RGB modundan 8 bit moduna dönüştürmek için görüntüyü, yazıyı ve 8 bit'i tıklatın. Kontrastı ayarlamak için görüntüyü tıklatın, ayarlayın, parlaklık kontrastını ayarlayın ve parametreleri ayarlayın. Bir hedef parçacık seçin ve zaman serisi arka planını kesmek için Kontrol X'i kullanın.Parçacık algılama ve parçacık bağlama penceresini açmak için eklentileri, parçacık izleyici klasiği ve parçacık izleyiciyi tıklayın ve yarıçapı altıya, kesmeyi sıfıra ve yüzdelik dilimi % 0,01'e ayarlayın Bağlantı aralığını 10'a ve yer değiştirmeyi 10'a ayarlayın ve sonuçları görmek için parçacık izleyici sonuçları penceresini açmak için Tamam'ı tıklatın. Oluşturulan yörüngeleri incelemek için tüm yörüngeleri görselleştir'i tıklatın. Yazılım oluşturulan yörünge ve altın nanorodların hareketli yörüngesi eşleşiyorsa, sonuçları kaydetmek için tam raporu kaydet'i tıklatın.Oluşturulan yazılım yörüngesi altın nanorodların hareketli yörüngesiyle eşleşmiyorsa, algılanan parçacıkları farklı bağlantı aralığı ve yüzdebirlik parametrelerle yeniden bağlamak için parçacıkları yeniden bağlayın' ı tıklatın. XY koordinatlarına göre her karedeki altın nanorodun orta piksel koordinatını bulmak için ksycoordination kullanın. m işlevi.Üçe üç piksel matrisini sınırlandırmak, kırmızı veya yeşil kanalların dokuz saçılma yoğunluğu değerini ayıklamak ve ortalama bir değer hesaplamak için rgextraction kullanın. m işlevi. O zaman kutup dalgasını kullan.m işlevi çift kanallı diferansiyel yöntemini kullanarak kutup açılarını hesaplamak için. Tablodaki formülleri kullanarak dinamik parametreleri hesaplamak için iki çözümleme komut dosyasını çalıştırın. Yörüngenin görsel analizi için X koordinatını X, Y koordinatını Y ve saati Y olarak ayarlayın, sonra çizim, dağılım ve renk eşlemini tıklatın, grafik parametrelerini ayarlayın ve renk çubuğunu ekleyin.Ortalama kare yer değiştirme zaman aralığı rakamları oluşturmak için, zaman aralığını X ve ortalama kare yer değiştirmeyi Y olarak ayarlayın.Çizim, dağılım, analiz, montaj, doğrusal olmayan eğri sığdırma ve açık diyalog olarak ayarlayın ve grafik parametrelerini ayarlayın. Çok parçacıklı istatistiksel analiz için, ilgi çekici dinamik parametreleri Y olarak ayarlayın ve çizim ve histogram'ı tıklatın. Bölme boyutunu veya bölüm sayısını ayarlamak için histogramı çift tıklatın ve Uygula'yı tıklatın.Ardından bir sütun ekleyin ve grafik parametrelerini ayarlayın. Bir zaman serisi analizi için, saati X olarak ve zaman serisi parametrelerini Y olarak ayarlayın.Çizimi, çok bölmeli ve yığını tıklatın. Açılır pencerede satır ve Tamam'ı seçin. Ardından grafiğin parametrelerini ayarlayın.Boyuna plazmonik maksimum 40 ile 85 nanometre CTAB kaplı altın nanorodlar yaklaşık 650 nanometre ve enine rezonans 520 nanometredir. CTAB kaplamalı altın nanorodların U87 hücre zarlarındaki saçılma yoğunluğu, bu deneyde izlenen CTAB kaplamalı altın nanorodların iyi monodispersed olduğunu gösteren cam üzerindeki CTAB kaplamalı altın nanorodlarınkiyle tutarlı dar genişliğe sahip tipik bir Gauss dağılımını göstermektedir. Gösterildiği gibi, 500'den fazla CTAB kaplamalı altın nanorod yörüngesi karanlık alan mikroskopisi ile izlenebilir ve uzun menzilli difüzyon yörüngelerine ve sınırlı difüzyon yörüngelerine ayrılabilir.Bu temsili analizde 500 yörüngenin tüm gyration yarıçapı, ortalama 0,5 mikrometre gyrasyon yarıçapı ile küçük bir değer dağılımı gösterdi ve maksimum yer değiştirme küçük değerlerde daha fazla dağıtıldı. Bu topluluk ortalama ortalama kare yer değiştirme analizinde gösterildiği gibi, CTAB kaplamalı altın nanorodlar normalde yaklaşık bir alfa ile yayılır. Bununla birlikte, difüzyon katsayısının ve tüm yörüngelerden elde edilen alfanın yoğunluk dağılımı, altın nanorodların dinamiği süper difüzyon, Brownian ve subdiffüzyon hareketleriyle heterojen bir dağılım sergilediğini ortaya koymaktadır.Ek olarak, tek parçacık istatistiksel analizi ve zaman serisi parametre analizi, iki temsili uzun süreli sınırlı ve hareketli yörüngeyi karakterize etmek için kullanılabilir. Genellikle yapılması zor bazı dengeler olduğu için, tek parçacık izleme analizi okumasından verilerin tek bir yeni yorumunu özetlemek ve ayıklamak gerekir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...