Name: mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging
Uploaded: 2020-07-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Kim lab og Lance Davidson for deres kommentarer og støtte. Dette arbejde blev støttet af Young Scientist Fellowship til HYK fra Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).

Dyrebrug og forsøgsprotokoller blev godkendt af det institutionelle udvalg for pasning og anvendelse af dyr (IACUC) ved Institute for Basic Science (IBS 18-01) og Korea Advanced Institute of Science and Technology (KA2017-22).
1. Embryoner
<ol><li>X. laevis embryoner ved hjælp af en standard procedure: manuelt indsamle æg fra stimuleret kvindelige frøer og udføre in vitro befrugtning18,19.</li>
	<li>De-gelé de befrugtede embryoner med blid omrøring i ca 5 min i 2% cystein i 1/3x modificeret Barth's saltvand (MBS; se opskriften på 1X MBS nedenfor) på pH 819.</li>
	<li>Valgfrit trin for levende billeddannelse: at fluorescerende mærke specifikke proteiner og observere deres dynamik i organoid, gå videre til afsnit 5.</li>
	<li>(Valgfrit) For at overvåge forureningen af overfladiske ectoderm-celler i organoider skal embryoernes apikale overflade med NHS-rhodamin mærkes i trin 914. Inkuber embryoner i 1 mg/ml NHS-Rhodamin i 1/3x MBS (pH 9.0) i 30 min med blid møtrik. Vask embryoner tre gange ved at overføre til en petriskål fyldt med 1/3x MBS i 15 min.</li>
	<li>Embryoet dyrkes i 1/3x MBS ved den foretrukne temperatur (14-26 °C), indtil de første tegn på trin 10 detekteres (dvs. fremkomsten af mørke pigmenterede celler omkring blastopore ved vegetal visning).</li>
</ol>2. Udarbejdelse af mikrokirurgiske værktøjer, løsninger og kulturfartøjer
<ol><li>Forbered de nødvendige værktøjer, herunder et par kirurgiske grade sceskiver og hår værktøjer (hår loop og hår kniv) for mikrokirurgi20.</li>
	<li>Forbered følgende kulturmedier til embryoner: 1/3X MBS, hvor 1X MBS er lavet med NaCl (88 mM), KCl (1 mM), NaHCO3 (2,4 mM), MgSO4 (0,82 mM), Ca(NO3)2 (0,33 mM), CaCl2 (0,41 mM) og HEPES (10 mM). PH til 7,4 med 10 M NaOH. BEMÆRK: Valgfrit: Tilsæt dråber fenolrød for at angive pH.</li>
	<li>Forbered følgende kultur medier for embryonale væv og organoider: Danilchik's for Amy (DFA)21 suppleret med frisk 1% antibiotikum og antimykotisk opløsning. Der tilberedes DFA med NaCl (53 mM), Na2CO3 (5 mM), kaliumglækoat (4,5 mM), natriumglæum (32 mM), CaCl2 (1 mM) og MgSO4 (1 mM). PH til 8,3 med granuleret Bicine. Filter DFA (0,2 μm flaske-top filter), aliquot og gemme det ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered calcium- og magnesiumfri DFA til adskillelse af dybe celler fra ectoderm ved hjælp af opskriften ovenfor og udelade CaCl2 og MgSO4. Aliquot og opbevares ved-20 °C.</li>
	<li>Forbered ikke-klæbende PCR-rør til embryonal cellesammenlægning.<ol>
<li>For at fremkalde spontan aggregering af de isolerede embryonale celler skal der tilberedes ikke-klæbende PCR-rør ved belægning af pcr-rør med runde bund med 200 μL BSA (1 g BSA i 100 ml destilleret vand) natten over ved 4 °C eller i 2 timer ved stuetemperatur. Hvert rør vil blive brugt til at samle en organoid.</li>
		<li>Skyl BSA-belagte PCR-rør med DFA tre gange for at fjerne eventuelle resterende BSA.</li>
		<li>Fyld PCR rør med 200 μL DFA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolering af dybe ectoderm celler
<ol><li>Vælg og saml embryoner, når de når tidligt fase 10 ved hjælp af hår værktøjer under et stereoscope.</li>
	<li>Ved hjælp af en engangsoverførselspipette overføres de valgte embryoner til en DFA-fyldt petriskål.</li>
	<li>Embryonernes vitellinemembranen fjernes ved hjælp af skarpe snævn fra den vegetabilske side uden at forstyrre fosterets dyreside. BEMÆRK: Sørg for at undgå at udsætte embryoner for luften. Indførelse af luftbobler i opløsningen eller ved at bringe embryoner op til overfladen vil få fosteret til at briste.</li>
	<li>For at isolere dyrehætten skal du placere fosterets dyreside op.</li>
	<li>Visuelt anslå omfanget af dyret cap, der skal fjernes, og gøre det første snit langs kanten af dyret hætte med en hårkniv. Træk hårkniven udad for at lave et snit.</li>
	<li>Gentag trin 3.5 for at skabe en kæde af små nedskæringer i punktafgifter dyreloftet.</li>
	<li>Trim den tyk-lagne kant af dyret hætte ved hjælp af en hårkniv for at forhindre optagelse af mesoderm prækursorer. BEMÆRK: For at forhindre heling og sammenlægning af isolerede dyrehætter, skal du gå videre til næste trin inden for 10 min. Typisk isolerer vi 5-10 dyrehætter ad gangen for at samle flere organoider.</li>
	<li>For at adskille dybe ectoderm celler fra dyret hætte, overføre de punkterede dyr hætter til en petriskål fyldt med calcium- og magnesium-fri DFA med en engangsoverførsel pipette. Pas på ikke at indføre luftbobler under overførslen.</li>
	<li>For at holde nok plads til de næste skridt, ved hjælp af hår værktøjer, placere dyret hætter til ansigt dyret-side op og opretholde en generøs afstand fra andre explants.</li>
	<li>Vent i 5-10 min og derefter overvåge explants under et stereoscope. Når løsnet dybe celler er blevet fundet fra kanten af den mørk-pigmenterede overfladiske lag, begynde at løfte det overfladiske lag væk fra de lyse dybe ectoderm celler ved hjælp af en hårkniv under stereoscope.</li>
	<li>Løsn forsigtigt (peel-off) det overfladiske lag med en hårkniv, der starter ved kanten.</li>
	<li>De dybe ektodermceller indsamles med et minimum af aspiration (10\u201215 μL) for at begrænse mængden af calcium- og magnesiumfri DFA, der overføres til aggregeringsmediet i næste trin. BEMÆRK: Framonterede overfladiske celler kan fjernes fra medierne for at forhindre forurening af de resterende dybe ectoderm celler.</li>
</ol>4. Generering af mucociliære epitelorganoider
<ol><li>Overfør indsamlede dybe ektodermceller til et ikke-klæbende PCR-rør indeholdende 200 μL DFA. Pipette forsigtigt mediet (2\u20123 gange) for at sprede overførte celler i PCR-røret. BEMÆRK: Den timing, der er angivet som timer efter sammenlægning (hpa), starter ved dette trin. Størrelsen af de resulterende organoider styres af antallet af dybe ectoderm celler føjet til et PCR-rør. Dybe ectoderm celler fra en eller flere dyr hætter kan anvendes, afhængigt af den ønskede størrelse af organoid.</li>
	<li>Luk PCR-røret. Hold PCR-rør oprejst for at fremkalde spontan sammenlægning i bunden.</li>
	<li>Overvåg sammenlægningsprocessen under et stereoanlæg. Celler samles typisk i bunden af PCR-røret inden for en time og samles i sfæriske aggregater inden for 2-3 timer, afhængigt af størrelsen.</li>
	<li>At udføre levende billeddannelse eller drug test under udviklingen af mucociliary epitelorganoider, indsamle aggregater på 2 hpa ved hjælp af en 200 μL pipette udstyret med forstørrede spidser (skåret med steriliseret saks) for at undgå at forårsage skade på aggregater under indsamling.</li>
	<li>At tillade aggregater at udvikle sig til mucociliary epitel organoid i kultur, indsamle sfæriske aggregater fra PCR rør på 5 hpa og overføre dem til en DFA-fyldt Petri fad.</li>
	<li>Placer aggregater langt fra andre for at forhindre dem i at smelte. Inden for 24 timer af kultur ved stuetemperatur uden nogen ekstra faktorer, modne mucociliary epitel organoids kan observeres at være roterende med den virkning, slå cilier dækker overfladen af den differentierede epitel</li>
</ol>5. (Valgfri) Levende billeddannelse i høj opløsning af udvikling af organoider
<ol><li>Forbered mRNA til mikroinjektion.<ol>
<li>For at visualisere epiteliseringen, der opstår i den indledende fase af organoiddannelse, skal du forberede mRNA til epitelspecifikke zonula okcludens protein-1 (ZO-1) og til at skitsere cellemembranerne ved at forstærke pCS2-ZO1-RFP og pCS2-mem-GFP plasmider (en gave fra Lance Davidson).</li>
		<li>Uddrag og linearisere plasmid DNA, og derefter omskrive udjævnede mRNA ved hjælp af en SP6/T7 in vitro transskription kit.</li>
		<li>Aliquot den transskriberede mRNA og gemme det ved -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroinject mRNA i et befrugtet foster<ol>
<li>Placer befrugtede embryoner i 3% Ficoll i 1x MBS.</li>
		<li>3-4 μL mRNA med en mikrolæsserspids ind i en trukket glasnål (en lang og fin tilspidset nålespids med en indvendig diameter på 10\u201230 μm).</li>
		<li>Fastgør nålen til en mikroinjektor og juster tid og tryk for at levere en konstant mængde mRNA til mikroinjektion.</li>
		<li>Injicer mRNA lige under dyrestangens apikale overflade. En særskilt bleg-farvet cirkulær patch, der er forårsaget af udvidelsen af cortex er synlig på tidspunktet for mikroinjektion.</li>
		<li>De injicerede embryoner overføres til 1/3X MBS, og de skal udstøbes til trin 9.5.</li>
		<li>De fluorescerende mærkede embryoner indsamles under et fluorescenssterooskop (excitations-/emissionsindstillinger for GFP (488/510) og RFP (532/588)).</li>
		<li>Fortsæt med trin 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saml og kultur organoid (afsnit 3 og 4) indtil den ønskede fase af udviklingen.</li>
	<li>Udfør live billeddannelse.<ol>
<li>Forbered et glasbundet billeddannelseskammer ved at lime et dækglas til et specialslede akrylkammer ved hjælp af siliciumfedt. BEMÆRK: Tæt forsegl kammeret for at forhindre lækage af kulturmediet.</li>
		<li>Fyld billedkammeret med DFA.</li>
		<li>Vælg en sekskantet transmission elektron mikroskopi (TEM) gitter (75 mesh) fra en beholder ved hjælp af hændeglas og anvende en lille mængde fedt til kanten af nettet. BEMÆRK: Maskens størrelse skal være mindre end aggregatets diameter, så aggregaterne sidder på nettet.</li>
		<li>Tryk let ned for at fastgøre TEM-gitteret til bunden af billedkammeret.</li>
		<li>Overfør aggregaterne til billedkammeret, og placer dem i gitteret. BEMÆRK: Undgå at placere aggregaterne ved siden af fedtet. Under hele forsøget skal aggregaterne sidde på TEM-gitteret uden at kontakte bunden af kammeret for at forhindre fysisk komprimering.</li>
		<li>Fyld billedkammeret med DFA og luk det med et dækglas og fedt. BEMÆRK: Kammeret skal være lufttæt uden luftbobler for at undgå turbulens eller bevægelse under billeddannelse.</li>
		<li>For at følge udviklingen af mucociliary epitel organoid dannelse, indsamle time-lapse z-stack billeder af aggregater (fra 2 hpa) ved hjælp af en konfokal mikroskop. BEMÆRK: Vi indsamler typisk ~ 120 μm-tykke z-stakke hver 15 min ved hjælp af en 20X målsætning til at følge den dynamiske celle adfærd, men disse specifikationer bør optimeres til målet med eksperimenter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. (Valgfrit) Billeddannelse, der udvikler organoider ved fiksering og immunstaining
<ol><li>Fix organoider på det ønskede udviklingsstadi ved at overføre dem til et glashætteglas fyldt med en fiksativ opløsning. BEMÆRK: Der tilsættes en mængde fiksativ opløsning, der er >20 gange så stor som prøverne for at sikre fuldstændig fiksering. Udfør følgende processer på en nutator, medmindre andet er angivet. Generelt er organoider faste med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Der kan dog være behov for forskellige fiksativer for at påvise specifikke proteiner. For eksempel brugte vi 4% PFA med 0,25% glutaraldehyd i PBS til at detektere F-actin og acetyleret tubulin. For at detektere intelectin (ITLN) og ZO-1 fastgøres organoider med iskold Dents opløsning (4:1 methanol:dimethylsulfoxid) natten over ved -20 °C. Bulens faste organoider skal serielt dehydreres før vask (trin 6.3). Varighed for antistofinkubation og vask kan optimeres til specifikke behov.</li>
	<li>Dergørs organoider i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) eller natten over ved 4 °C.</li>
	<li>Vask 3 gange med PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) i 15 min. ved RT.</li>
	<li>Blok uspecifik binding med 10% gedeserum i PBST (PBSGT) i 1 time ved RT.</li>
	<li>Inkuberes med primært antistof (1:200) i PBSGT natten over ved 4 °C.</li>
	<li>Vask 3 gange med PBST i 15 min. ved RT.</li>
	<li>Inkuberes med sekundært antistof (1:200) i PBSGT natten over ved 4 °C.</li>
	<li>Vask 3 gange med PBST i 15 min. ved RT.</li>
	<li>Overfør de faste og immunostained organoids til et billeddannelseskammer og fortsæt med konfokal billeddannelse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids:+current+uses+and+future+promise.">Lung organoids: current uses and future promise.</a> Development. 144 (6), 986-997 (2017).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+Epithelial+Repair,+Regeneration,+and+Remodeling+after+Injury+in+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease.">Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).</li><li>Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+dysfunction+in+lung+disease.">Cilia dysfunction in lung disease.</a> Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airway+Epithelium:+Soldier+in+the+Fight+against+Respiratory+Viruses.">The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Dubaissi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secretory+cell+type+develops+alongside+multiciliated+cells,+ionocytes+and+goblet+cells,+and+provides+a+protective,+anti-infective+function+in+the+frog+embryonic+mucociliary+epidermis.">A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis.</a> Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+ciliogenesis+factors+using+a+new+in+vivo+model+for+mucociliary+epithelial+development.">Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development.</a> Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).</li><li>Walentek, P., Quigley, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+can+learn+from+a+tadpole+about+ciliopathies+and+airway+diseases:+Using+systems+biology+in+Xenopus+to+study+cilia+and+mucociliary+epithelia.">What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Werner, M. E., Mitchell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+ciliated+epithelia:+The+power+of+Xenopus.">Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus.</a> Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).</li><li>Dubaissi, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+frog+epidermis:+a+model+for+the+study+of+cell-cell+interactions+in+the+development+of+mucociliary+disease.">Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).</li><li>Walentek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serotonin-secreting+cell+type+regulates+ciliary+motility+in+the+mucociliary+epidermis+of+Xenopus+tadpoles.">A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles.</a> Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).</li><li>Asashima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organogenesis+from+undifferentiated+cells+in+Xenopus.">In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus.</a> Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).</li><li>Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+drives+regeneration+of+a+mucociliated+epidermis+on+the+surface+of+Xenopus+embryonic+aggregates.">Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates.</a> Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).</li><li>Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaN-Tp63+Mediates+Wnt/beta-Catenin-Induced+Inhibition+of+Differentiation+in+Basal+Stem+Cells+of+Mucociliary+Epithelia.">DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia.</a> Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).</li><li>Green, J., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , 1-13 (1999).</li><li>Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+intercalation+of+ciliated+cells+during+Xenopus+skin+development.">Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development.</a> Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+tools+for+quantifying+developmental+dynamics+in+Xenopus+embryos.">Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).</li><li>Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuronal+differentiation+by+planar+signals+in+Xenopus+embryos.">Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos.</a> Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).</li><li>Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+an+Apical+Epithelial+Cell+Surface+In+Vivo.">Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo.</a> Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).</li><li>Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+basal+stem+cells:+a+perspective+on+their+roles+in+epithelial+homeostasis+and+remodeling.">Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Mucociliary epitelorganoider genereret fra dybe ectoderm celler af X. laevis embryo er et effektivt redskab til at studere epitelisering og differentiering af multipotente forfædre in vitro. I modsætning til den bredt vedtagne dyreloftsanalyse16, der anvendes til in vitro organogenese13, og udviklingen af mukokiliære epithelia15,17,22, der udnytter den intakte ectoderm, giver de dybe ectoderm-afledte organoider, der præsenteres i denne protokol, en klar mulighed for at overvåge vævsmekanikdrevne regenereringsfaser af overfladeepitel14. På omkring 2 hpa, den nyligt genererede ZO-1 positive epitelceller (Figur 2) begynder at dukke op på den apikale overflade af organoids og øge deres befolkning til at dække hele organoid som væv størkne eller reducerer overholdelse14. Regenereringen af epitel og efterfølgende afstamningsspecifikationer for slimproducerende bægerceller sker spontant i et kemisk defineret kulturmedie inden for en dag. Disse hastigt udvikle mucociliary epitelorganoider giver en platform til at undersøge dynamisk celle adfærd i realtid, i høj opløsning, under progressive trin i epitel regenerering. De gør det også muligt at undersøge grundlæggendespørgsmål,der opstår under mucociliary epitel udvikling, homøostase, og tilknyttedesygdomme 2,9,23. Især kan den mekaniske følsomhed af de dybe progenitorceller under overgangen til epitelceller, der er identificeret i organoiderne14, tjene til at forbinde luftvejssygdomme forbundet med unormal basaldifferentiering, hvor slim-udskillende bægerceller er over- eller underproducerede23.
Mens denne protokol tilbyder en enkel tilgang til at generere disse organoids, der er flere kritiske trin for succes i eksperimenter. For at forhindre kontaminering af overfladiske epitelceller under isolering af dybe ectoderm celler fra dyrehætten, bør man overvåge dyrehætten placeret i calcium- og magnesiumfri DFA under et stereoscope og opdage det rigtige tidspunkt til at indlede adskillelsen af det mørkpigpigede overfladiske lag af dyrehætten. Hvis vævet holdes i calcium- og magnesiumfri DFA for længe, vil hele vævet adskille sig, og det vil være umuligt for dybe ectoderm-aggregater at skelne mellem dybe og overfladiske celler. For at bekræfte fraværet af overfladiske celler i dybe ectoderm aggregater anbefaler vi fluorescerende mærkning af embryoets apikale overflade med NHS-rhodamin (trin1.4 14)før mikrokirurgi; dette vil gøre det let at identificere overfladeceller, hvis de findes i de resulterende organoider. Da epitelregenerering reguleres afvævsmekanik 14, er det vigtigt at undgå utilsigtet kraftgenerering til selvorganiserende organoider. Vi foreslår især, at man undgår kontakt med glasbunden i billeddannelseskammeret under levende billeddannelse ved at placere aggregater i kanterne af TEM-gitrene, da dette giver mulighed for fri kontakt med billedvinduet af live aggregater (trin 5.1.2.). Denne in vitro-kultiverede, selvorganiseret 3D-model for mucociliary epitel vil tjene som et tractable værktøj til at besvare de grundlæggende spørgsmål, der opstår under regenerering af epitel og afstamning specifikation af bæger celler.

Skade, infektion og sygdom i mucociliary epitel er forbundet med nedsat produktion og clearance af slim, som ofte findes i lungesygdomme såsom kronisk obstruktiv lungesygdom, astma, cystisk fibrose, bronchiectasis, og primær ciliaere dyskinesi1,2,3,4. En nylig fremskridt inden for organoid teknologi, for eksempel, de basalcellebaserede lungeorganoid kaldet tracheosphere, der opsummerer regenerering af mucociliary epitel opstå som en lovende model med terapeutisk potentiale1,5,6. Anvendelsen af den er imidlertid i øjeblikket begrænset, til dels på grund af manglende af de definerede kulturforhold og lav effektivitet i organoidproduktioner. Mucociliary epitel i de menneskelige luftveje og frøen epidermis er bemærkelsesværdigt ens i væv morfologi, cellulære sammensætning, og densfunktion 7,8,9,10,11,12. I begge organismer, mucociliary epitel giver første-line forsvar ved at udskille slim og antimikrobielle stoffer og rydder skadelige partikler og patogener gennem synkroniseret virkning af cilier.
Her beskriver vi en simpel protokol til at generere mucociliary epitelorganoider ved hjælp af multipotente stamfædre af Xenopus laevis embryoner13,14. Tidligere rapporterede vi14, at i mangel af udefrakommende vækstfaktorer og den ekstracellulære matrix, de mikrokirurgisk isolerede dybe celler fra den tidlige gastrula fase ectoderm spontant samles i aggregater, regenerere epitel på dens overflade, og modnes i mucociliary epitel ved intercalating multiciliated og andre tilbehørsceller inden for 24 h. Ud over den hurtige udvikling, denne protokol giver en klar mulighed for direkte adgang til overgange af multipotente dybe ectoderm celler i epitel bægercelle forfædre, der opsummerer regenerering trin af en forstyrret epitel14, som ikke er tilgængelige fra intakte embryoner og ektoderm (også kendt som dyret cap)15,16,17. Antallet og størrelsen af de producerede organoider kan skaleres med høj effektivitet ved at kontrollere udgangsmaterialerne fra Xenopus embryoner. Organoider i flydende kultur kan nemt sorteres og overføres på det ønskede stadium for yderligere analyser, herunder høj opløsning billeddannelse, mekanisk testning, narkotikabehandling, og genetisk karakterisering14. Denne spontane, vævsmekanik-drevet regenerering af epitel på overfladen af embryonale celle aggregater resulterer i mucociliary epitelorganoider og give en ny tre-dimensionel (3D) model til at studere biologi mucociliary epitel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair knife</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cg10-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBS solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10M Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dejellying solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide 10M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22mm Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>222321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6/T7 in vitro transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA microinjection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>SSI</td>
			<td>SSI-3245-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-milled acrylic chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 24mmX50mm</td>
			<td>Duran</td>
			<td>B01_001650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>275HGN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2775GN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Shinetsu</td>
			<td>HIVAC-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20ml screw top-cap vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WH.986580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml screw top-cap vial</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sgima</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% EM GRADE</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraforlamdehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>LPS Solution</td>
			<td>CBP007B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>clone 6-11B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itln1</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>11770-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1h5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-mem-GFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-ZO1-RFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging

Mucociliary epitel giver den første linje i forsvaret ved at fjerne fremmede partikler gennem handling af slim produktion og cilia-medieret clearance. Mange klinisk relevante defekter i mucociliary epitel udledes, da de forekommer dybt inde i kroppen. Her introducerer vi en tractable 3D-model for mucociliary epitel genereret fra multipotente forfædre, der var mikrokirurgisk isoleret fra Xenopus laevis embryoner. De mucociliære epitelorganoider er dækket med nygenererede epitel fra dybe ectoderm celler og senere dekoreret med forskellige mønstrede multikilierede celler, sekretoriske celler, og slim-producerende bæger celler, der ikke kan skelnes fra den indfødte epidermis inden for 24 h. Den fulde sekvenser af dynamiske celle overgange fra mesenkymal til epitel, der opstår på den apikale overflade af organoider kan spores ved høj opløsning levende billeddannelse. Disse in vitro-kultiverede, selvorganiserende mucociliære epitelorganoider giver klare fordele ved at studere mucociliary epitels biologi med høj effektivitet i generation, definerede kulturforhold, kontrol over antal og størrelse og direkte adgang til levende billeddannelse under regenerering af det differentierede epitel.

Denne standardiserede protokol genererer en mucociliær epitelorganoid fra multipotente forfædre isoleret fra den tidlige gastrula fase X. laevis embryoner inden for 24 timer af dyrkning14. Indsamlet dybe ectoderm celler selv samles til at danne en samlet i en ikke-klæbende PCR rør og gennemgå overflade epitelisering og bæger celle differentiering. Den nyligt epiteliserede overflade af aggregater giver et substrat svarende til den indfødte epitel findes in vivo til interkalkning af indre celler (f.eks, multikilierede og andre tilbehørsceller) og udvikler sig til at danne mucociliære epitelorganoider (Figur 1A, B). Inden for 24 timer efter sammenlægning, selvorganiseret mucociliary epitel organoids regenerere en moden epidermis, der er umulig at skelne fra epidermis af en tadpole. Organoiderne omfatter fuldt differentieret epitel (keratin), slim-udskillende bægerceller (ITLN), multicilierede celler (acetyleret tubulin) og små sekretoriske celler (jordnøddealgglutinin, PNA) (Figur 1C).
Ud over at bekræfte udviklingen af forskellige celletyper med immunstaining kan dynamikken i organoidudvikling efterfølges af levende billeddannelse (figur 2A). For at undersøge epiteliseringen, der opstår i den tidlige fase af organoiddannelse (Figur 1B), mærkede vi embryoner ved at udtrykke fluorescerende mærkede stramme krydsproteiner (ZO-1-RFP) og membran, der lokaliserer proteiner (mem-GFP). Med dobbelt-mærkning, de sekventielle trin i ZO-1-positive stramme vejkryds dannelse kan markeres og kvantitativt analyseres under epitelisering (Figur 2). For eksempel, for celler(Figur 2B, grøn-farvet) på forskellige stadier af epitelisering (ved 0 min), nogle regioner af celle-celle vedhæftning har spredt punkttegn af ZO-1 (Figur 2B, grønne pile). I modsætning hertil har andre områder fuldt samlet, sammenhængende ZO-1 udtryk (Figur 2B,gule pile). Over tid, den punktformet sammen og forbinde til at danne sammenhængende strammevejkryds (Figur 2B, grønne pile), og sammenhængende stramme vejkryds bevare deres morfologi selv under celledeling (Figur 2B, gule pile). Efterhånden som de stramme vejkryds modnes, bevæger cellerne sig dynamisk ind og ud af overfladen langs organoidernes apikale planer (Figur 2C,D). Desuden, ved at spore celler spatiotemporally på overfladen af differentiere organoider(Figur 2B,farvekodede celler), multi-skala analyse er mulig, lige fra individuelle punktformidt til sammenhængende stramme kryds, celle-celle grænser, og delmængder af cellepopulationer i organoids.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig01.jpg"> Figur 1: Generering af mucociliære epitelorganoider. (A) En skematisk, der viser protokollen til at samle dybe ectoderm aggregater fra X. laevis embryoner. (B) Et skema for en model af mucociliary epitel organoid dannelse stammer fra multipotente dybe ectoderm celler (tværsnitsvisning). Overflade-placerede celler transit i epitelceller og differentiere i bæger celler. Differentiere cilierede celler, sekretoriske celler, og ionocyter radialt intercalate i overfladen og regenerere en moden epidermis. ( C) Maksimal z-projektion af mucociliary epitelimmunostained for ITLN (slimproducerende bægerceller), acetyleret tubulin (cilierede celler), PNA (små sekretoriske celler) og keratin (epitelceller) i organoider ved 24 hpa (øverste panel) og tadpole epidermis (nederste panel). Skalabar = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig02.jpg"> Figur 2: Levende billeddannelse af udvikling af organoider. (A) Et skema over billeddiagnostisk kammer for levende organoider (ikke at skalere). (B)Time-lapse sekvenser af konfokale stakke indsamlet fra dybe ectoderm celle aggregater udtrykke ZO-1-RFP og mem-GFP fra 2,5 hpa. Skalabar = 20 μm. Celler er pseudofarvede til sporing over tid. Grøn-farvet celle har forskellige celle vedhæftning statusser, herunder en gradvist udvikle ZO-1 positiv vedhæftning (grønne pile) og en opretholde tilstødende ZO-1 positiv vedhæftning (gule pile) over tid. (C, D) Time-lapse konfokale billeder af ZO-1-RFP-udtrykkende dyb ectoderm celle aggregater viser radialt intercalating celler bevæger sig til overfladen (C, gul stjerne) og bevæger sig inde i aggregater (D, blå stjerne). Skalastænger = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Vi beskriver en simpel protokol til at udvikle mucociliære epitelorganoider fra dybe ectoderm celler isoleret fra Xenopus laevis embryoner. De multipotente forfædre regenererer epitelcelleprækursorer og tillader direkte sporing af initieringen og progressionen af celleovergangene på overfladen af organoider.

Mucociliary Epithelial Organoids fra Xenopus embryonale celler: Generation, Kultur og høj opløsning Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Mucociliary epitel linjer indre organer i vores krop og giver den første linje i forsvaret ved at rydde fremmede partikler. Denne protokol gør det muligt at generere embryonale celler afledt mucociliary epitel organoid i 24 timer. Den vigtigste fordel ved vores metode er, at vi kan overvåge den levende progression af celleovergange på overfladen af organoider.Denne reproducerbare, skalerbare, og hurtig protokol for udvikling organoid vil give forskerne mulighed for at behandle grundlæggende spørgsmål for biologi mucociliary epitel. Til at begynde, opnå X.Laevis embryoner ved manuelt at indsamle æg fra stimuleret kvindelige frøer og udføre in vitro befrugtning. De-gelé de befrugtede embryoner med blid omrøring i 2% Cystein, i en tredjedel X-modificeret Barth's saltvand i cirka fem minutter.Embryo embryonerne dyrkes i en tredjedel XMBS ved den foretrukne temperatur, indtil de første tegn på trin 10 opdages, såsom fremkomsten af mørke pigmenterede celler omkring blastopore ved vegetal visning. Vælg og saml embryoner, når de når tidligt fase 10 ved hjælp af hår værktøjer under et stereoscope. De udvalgte embryoner overføres til en DFA-fyldt petriskål med engangsoverførselspipette.Fjern derefter vitellinemembranen af embryonerne ved hjælp af skarpe snævn fra den vegetabilske side, uden at forstyrre fosterets dyreside. For at isolere dyrehætten skal du placere fosterets dyreside op. Visuelt anslå omfanget af dyret cap, der skal fjernes, og gøre det første snit langs kanten med en hårkniv, trække kniven udad for at gøre snittet.Gentag denne proces for at skabe en kæde af små nedskæringer til punktafgifter dyret cap. Trim den tyk-lagne kant af dyret hætte ved hjælp af en hårkniv for at forhindre optagelse af mesoderm prækursorer. For at adskille dybe ectoderm celler fra dyret hætte, overføre de punkterede dyr hætter til en petriskål fyldt med calcium og magnesium-fri DFA med en engangsoverførsel pipette.Placer dyret hætter til ansigt dyr side op, opretholde en generøs afstand fra andre explants. Vent i fem til ti minutter, og derefter overvåge explants under et stereoscope. Når de løsnede dybe celler er blevet frigivet fra kanten af det mørkpigmenterede overfladiske lag, begynde at løfte det overfladiske lag væk fra de lyse dybe ectoderm celler.Fjern forsigtigt det overfladiske lag med en hårkniv, der starter ved kanten. Derefter indsamles de dybe ectoderm celler med så lidt calcium og magnesium-fri DFA som muligt. Overfør indsamlede dybe ectoderm celler til ikke-klæbende PCR rør, der indeholder 200 mikroliter DFA og forsigtigt pipette medierne to til tre gange for at sprede de overførte celler.Luk rørene og hold dem oprejst for at fremkalde spontan sammenlægning i bunden. Overvåg sammenlægningsprocessen under et stereomikroskop. Celler samles typisk i bunden af PCR-røret inden for en time og samles i sfæriske aggregater inden for to til tre timer afhængigt af størrelsen.At udføre levende billeddannelse eller drug test under udviklingen af mucociliary epitel organoids, indsamle aggregater på to timer efter sammenlægning ved hjælp af en 200 mikroliter pipette udstyret med forstørrede spidser. At tillade aggregater at udvikle sig til mucociliary epitelorganoider i kultur, indsamle dem fra PCR rør på fem timer efter sammenlægning og overføre dem til en DFA-fyldt Petriskål. Placer aggregaterne langt fra hinanden for at forhindre sammensmeltning.Inden for 24 timer af kultur ved stuetemperatur, uden nogen ekstra faktorer, modne mucociliary epitelorganoider kan observeres roterende på grund af slå cilier, der dækker overfladen af den differentierede epitel. Forbered et glasbundet billeddannelseskammer ved at lime et dækglas til et brugerdefineret sleben akrylkammer med siliciumfedt, tæt forsegling af kammeret for at forhindre lækage af kulturmediet, og fyld derefter billedkammeret med DFA. Saml en sekskantet transmission elektronmikroskopi eller TEM gitter ved hjælp af kraftbefængte og anvende en lille mængde fedt til kanten af nettet.Tryk let ned for at fastgøre TEM-gitteret til bunden af billedkammeret. Overfør aggregaterne til billedkammeret, og placer dem i gitteret. Fyld kammeret med DFA og forsegle det med et dækglas og fedt.For at følge udviklingen af mucociliary epitel organoid dannelse, indsamle tid-lapsed z-stack billeder af aggregater ved hjælp af en konfokal mikroskop. Mucociliary epitelorganoider blev genereret fra multipotente stamfædre af tidlige gastrula fase X.Laevis embryoner. De organoider har en moden epidermis, der er umulig at skelne fra en tadpole, herunder en fuldt differentieret epitel, slim udskiller bæger celler, multikilierede celler og små sekretoriske celler.Dynamikken i organoid udvikling blev efterfulgt af levende billeddannelse. For at undersøge epiteliseringen, der opstår i det tidlige stadium af organoiddannelse, blev embryonerne mærket med fluorescerende mærkede stramme krydsproteiner og membran lokaliserende proteiner. Med dobbelt mærkning de sekventielle trin i ZO-1 positive stramme krydset dannelse kan markeres og kvantitativt analyseres under epitelisering.Nogle regioner af celle-celle vedhæftning har spredt punktform og ZO-1 på forskellige stadier af epitelisering. I modsætning hertil har andre områder fuldt samlet sammenhængende ZO-1 udtryk. Over tid puncta sammensne og forbinde til at danne sammenhængende stramme vejkryds, som bevarer deres morfologi selv under celledeling.Som de stramme vejkryds modnes, bevæger cellerne sig dynamisk ind og ud af overfladen langs de apikale planer i organoiderne. Multi-skala analyse er muligt ved at spore celler spatio-tidsmæssigt på overfladen af differentiere organoids. Når du forsøger denne protokol, skal du huske at sætte den mørkpigmenterede side af den isolerede dyrehætte opad og overvåge den under et stereoscope.Det er afgørende at adskille det overfladiske lag af dyrehætten på den rigtige timing i calcium/magnesiumfri DFA-medier. Denne enkle protokol tilbyder praktiske måder at studere dynamisk celle adfærd samt de molekylære og fysiske mekanismer, der regulerer mucociliary epitel.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generering af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige embryonale stamceller populationer

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering og dyrkning af Dental Epiteliale stamceller fra voksne mus Fortand

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...