Name: mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging
Uploaded: 2020-07-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת קים ולאנס דוידסון על הערותיהם ותמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת מדען צעיר HYK מהמכון למדע בסיסי (IBS-R0250Y1).

שימוש בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של המכון למדע בסיסי (IBS 18-01) והמכון המתקדם של קוריאה למדע וטכנולוגיה (KA2017-22).
1. עוברים
<ol><li>השג את העוברים X. laevis באמצעות הליך סטנדרטי: לאסוף באופן ידני ביצים מצפרדעים מגורה נקבה ולבצע הפריהחוץ גופית 18,19.</li>
	<li>De-jelly העוברים מופרות עם תסיסה עדינה במשך כ 5 דקות ב 2% ציסטאין ב 1/3x שונה תמיסת מלח של בארת (MBS; ראה את המתכון 1X MBS להלן) ב pH 819.</li>
	<li>שלב אופציונלי להדמיה חיה: לתייג באופן פלורסנטי חלבונים ספציפיים ולהתבונן בדינמיקה שלהם באורגנואיד, המשך לסעיף 5.</li>
	<li>(אופציונלי) כדי ל כדי לפקח על זיהום של תאי ectoderm שטחיים בתוך אורגנואידים, לתייג את פני השטח apical של העוברים עם NHS-rhodamine בשלב 914. לדגור עוברים 1 מ"ג/ מ"ל NHS-Rhodamine ב 1/3x MBS (pH 9.0) במשך 30 דקות עם אגוז עדין. לשטוף עוברים שלוש פעמים על ידי העברה לצלחת פטרי מלא 1/3x MBS במשך 15 דקות.</li>
	<li>תרבות העובר ב 1/3x MBS בטמפרטורה המועדפת (14-26 ° C) עד הסימנים הראשונים של שלב 10 מזוהים (כלומר, המראה של תאים פיגמנטיים כהים סביב blastopore בתצוגה הצמחית).</li>
</ol>2. הכנת כלים מיקרוכירורגיים, פתרונות וכלי תרבות
<ol><li>להכין את הכלים הדרושים כולל זוג ממחטות כיתה כירורגית וכלים שיער (לולאת שיער וסכין שיער) עבור microsurgery20.</li>
	<li>הכן את מדיה התרבות הבאה לעוברים: 1/3X MBS, כאשר 1X MBS מיוצר עם NaCl (88 מ"מ), KCl (1 מ"מ), NaHCO3 (2.4 מ"מ), MgSO4 (0.82 מ"מ), Ca(NO3)2 (0.33 מ', CaCl2 (0.41 מ"ר) ו-HEPES (10 מ"ר). כוונן את ה-pH ל- 7.4 עם 10 M NaOH. הערה: אופציונלי: הוסף טיפות של פנול אדום כדי לציין pH.</li>
	<li>להכין את התקשורת התרבות הבאה עבור רקמות עובריות organoids: Danilchik של לאיימי (DFA)21 בתוספת עם טרי 1% אנטיביוטיקה ופתרון אנטי מיקוטי. הכן DFA עם NaCl (53 mM), Na2CO3 (5 mM), אשלגן גלוקונאט (4.5 mM), נתרן גלוקונאט (32 mM), CaCl2 (1 mM) ו MgSO4 (1 mM). כוונן את ה-pH ל-8.3 עם בין פרטני. סינון DFA (מסנן בקבוק 0.2 μm), aliquot ולאחסן אותו ב -20 °C.</li>
	<li>הכן DFA ללא סידן ומגנזיום להפרדת תאים עמוקים מectoderm באמצעות המתכון לעיל והשמטת CaCl2 ו MgSO4. Aliquot ולאחסן ב-20 °C.</li>
	<li>הכן צינורות PCR לא דביקים עבור צבירת תאים עובריים.<ol>
<li>כדי לגרום צבירה ספונטנית של תאים עובריים מבודדים, להכין צינורות PCR שאינם דביקים על ידי ציפוי צינורות PCR עגולים עם 200 μL של 1% BSA (1 גרם של BSA ב 100 מ"ל של מים מזוקקים) לילה ב 4 ° C או עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. כל צינור ישמש להרכבת אורגנואיד אחד.</li>
		<li>לשטוף צינורות PCR מצופה BSA עם DFA שלוש פעמים כדי להסיר כל BSA שיורית.</li>
		<li>למלא צינורות PCR עם 200 μL של DFA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. בידוד של תאי ectoderm עמוקים
<ol><li>בחר ולאסוף עוברים כפי שהם מגיעים בשלב מוקדם 10 באמצעות כלי שיער תחת סטריאוסקופ.</li>
	<li>באמצעות פיפטה העברה חד פעמית, להעביר את העוברים שנבחרו לתוך צלחת פטרי מלא DFA.</li>
	<li>הסר את קרום vitelline של העוברים באמצעות מפסים חדים מהצד הצמחי מבלי לשבש את הצד החייתי של העובר. הערה: הקפד להימנע מחשיפת עוברים לאוויר. החדרת בועות אוויר לתוך הפתרון או הבאת עוברים אל פני השטח תגרום לעובר להתפוצץ.</li>
	<li>כדי לבודד את כובע החיה, מקם את הצד החי של העובר למעלה.</li>
	<li>מבחינה ויזואלית להעריך את היקף כובע בעלי החיים להיות לחוץ ו לעשות את החתך הראשון לאורך קצה כובע בעלי החיים עם סכין שיער. משוך את סכין השיער כלפי חוץ כדי לעשות חתך.</li>
	<li>חזור על שלב 3.5 כדי ליצור שרשרת של חתכים קטנים כדי לתוסס את כובע בעלי החיים.</li>
	<li>חותכים את הקצה העבה של כובע החיה באמצעות סכין שיער כדי למנוע הכללה של מבשרי mesoderm. הערה: כדי למנוע ריפוי וצבירה של כובעי בעלי חיים מבודדים, המשך לשלב הבא בתוך 10 דקות. בדרך כלל, אנו מבודדים 5-10 כובעי בעלי חיים בכל פעם כדי להרכיב אורגנואידים מרובים.</li>
	<li>כדי להפריד תאים עמוקים מכובע בעלי החיים, להעביר את כובעי בעלי החיים שנפלט לצלחת פטרי מלאה סידן- ומגנזיום חינם DFA עם פיפטה העברה חד פעמית. היזהר לא להציג בועות אוויר במהלך ההעברה.</li>
	<li>כדי לשמור על מספיק מקום לצעדים הבאים, באמצעות כלי השיער, מקם את כובעי בעלי החיים כדי להתמודד עם הצד החיתי למעלה ולשמור על מרחק נדיב מהסברים אחרים.</li>
	<li>המתן 5-10 דקות ולאחר מכן לפקח על explants תחת סטריאוסקופ. לאחר תאים עמוקים משוחררים נמצאו מקצה השכבה השטחית כהה פיגמנט, להתחיל להרים את השכבה השטחית הרחק התאים ectoderm עמוק בצבע בהיר באמצעות סכין שיער מתחת סטריאוסקופ.</li>
	<li>נתק בזהירות (פילינג) את השכבה השטחית עם סכין שיער, החל מהקצה.</li>
	<li>לאסוף את התאים ectoderm עמוק עם שאיפה מינימלית (10\u201215 μL) כדי להגביל את כמות סידן- ומגנזיום חינם DFA המועבר למדיה צבירה בשלב הבא. הערה: ניתן להסיר תאים שטחיים מנותקים מהמדיה כדי למנוע זיהום תאי הקטודורם העמוקים הנותרים.</li>
</ol>4. דור אורגנואידים אפיתל mucociliary
<ol><li>להעביר תאים ectoderm עמוקים לצינור PCR לא דביק המכיל 200 μL של DFA. בעדינות פיפטה את המדיה (2\u20123 פעמים) כדי לפזר תאים שהועברו בצינור PCR. הערה: התזמון המוגדר כצובר שעות לאחר (hpa) מתחיל בשלב זה. הגודל של אורגנואידים וכתוצאה מכך נשלט על ידי מספר תאי ectoderm עמוקים שנוספו לצינור PCR. ניתן להשתמש בתאי ectoderm עמוקים מכובעי בעלי חיים אחד או יותר, בהתאם לגודל הרצוי של האורגן.</li>
	<li>סגור את צינור PCR. שמור על צינורות PCR זקוף כדי לגרום צבירה ספונטנית בתחתית.</li>
	<li>נטר את תהליך הצבירה תחת סטריאוסקופ. תאים בדרך כלל מתאספים בתחתית צינור PCR בתוך שעה ולהרכיב לתוך אגרגטים כדוריים בתוך 2-3 שעות, בהתאם לגודל.</li>
	<li>כדי לבצע הדמיה חיה או בדיקות סמים במהלך הפיתוח של אורגנואידים אפיתל mucociliary, לאסוף אגרגטים ב 2 hpa באמצעות 200 μL פיפטה מצויד טיפים מוגדלים (לחתוך עם מספריים מעוקר) כדי למנוע גרימת נזק לאגרגטים במהלך האיסוף.</li>
	<li>כדי לאפשר לאגרגטים להתפתח לתוך אורגנואיד אפיתל רירית בתרבות, לאסוף אגרגטים כדוריים מצינור PCR ב 5 hpa ולהעביר אותם לצלחת פטרי מלא DFA.</li>
	<li>מקם את הצבירות הרחק מאחרים כדי למנוע מהם להתיך. בתוך 24 שעות של תרבות בטמפרטורת החדר ללא כל גורמים נוספים, אורגנואידים אפיתל mucociliary בוגר ניתן לצפות להיות מסתובב עם הפעולה של להכות cilia מכסה את פני השטח של אפיתל מובחן</li>
</ol>5. (אופציונלי) הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של פיתוח אורגנואידים
<ol><li>הכן את ה-MRNA למיקרו-צורך.<ol>
<li>כדי לדמיין את האפיתל המתרחש בשלב הראשוני של היווצרות אורגנואיד, להכין mRNA עבור zonula ספציפי לאפיתל occludens חלבון-1 (ZO-1) ועל התוויית קרום התא על ידי הגביר את pCS2-ZO1-RFP ו pCS2-mem-GFP plasmids (מתנה מלאנס דוידסון).</li>
		<li>לחלץ ולליניאריזציה של ה-DNA פלסמיד, ולאחר מכן לתמלל את mRNA כתר באמצעות SP6 / T7 במבחנה ערכת שעתוק.</li>
		<li>אליקוט MRNA מתעתק ולאחסן אותו ב -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיקרו-תחוט את ה-mRNA לעובר מופרית<ol>
<li>מקם עוברים מופרות ב-3% פיקול ב-1 MBS.</li>
		<li>טען 3-4 μL של mRNA באמצעות קצה מיקרו-מטעין לתוך מחט זכוכית משך (קצה מחט מחודד ארוך ופיין עם קוטר פנימי של 10\u201230 μm).</li>
		<li>חבר את המחט למזרק זעיר והתאים את הזמן והלחץ כדי לספק נפח קבוע של mRNA עבור microinjection.</li>
		<li>להזריק את mRNA ממש מתחת לפני השטח apical של עמוד בעלי החיים. תיקון עגול בצבע חיוור מובהק הנגרמת על ידי הרחבת קליפת המוח נראה בזמן microinjection.</li>
		<li>להעביר את העוברים המוזרקים 1/3X MBS ותרבויות אותם לשלב 9.5.</li>
		<li>אסוף את העוברים המסווים בתווית פלורסנטית תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי (הגדרות ריזור/פליטה עבור GFP (488/510) ו- RFP (532/588)).</li>
		<li>המשך לשלב 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להרכיב ולתרגם את האורגניואיד (סעיפים 3 ו-4) עד לשלב הרצוי של הפיתוח.</li>
	<li>בצע הדמיה חיה.<ol>
<li>הכן תא הדמיה עם תחתית זכוכית על-ידי התזת כיסוי לתא אקריליק טחינה אישית באמצעות גריז סיליקון. הערה: אטמו היטב את התא כדי למנוע דליפה של אמצעי התקשורת של התרבות.</li>
		<li>מלא את תא ההדמיה ב-DFA.</li>
		<li>בחר רשת מיקרוסקופית אלקטרונים (TEM) אחת של שידור משושה (75 רשת) ממכל באמצעות מקצות ולהחיל כמות זעירה של גריז על קצה הרשת. הערה: גודל הרשת צריך להיות קטן יותר מהקוטר של הצבירה כך שהצבירה תהיה ברשת.</li>
		<li>לחץ למטה בקלילות כדי לאבטח את רשת TEM לתחתית תא ההדמיה.</li>
		<li>העבר את הצבירות לתא ההדמיה ומקם אותן בתוך הרשת. הערה: הימנע ממקם את הצבירות לצד הגריז. במהלך הניסוי, הצבירות צריכות לשבת על רשת TEM מבלי ליצור קשר עם תחתית התא כדי למנוע דחיסה פיזית.</li>
		<li>מלאו את תא ההדמיה ב-DFA ואוטמים אותו בזכוכית כיסוי ובשומן. הערה: התא צריך להיות אטום ללא בועות אוויר כדי למנוע מערבולות או תנועה במהלך ההדמיה.</li>
		<li>כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות אורגנואיד אפיתל mucociliary, לאסוף תמונות z-stack זמן לשגות של אגרגטים (מ 2 hpa) באמצעות מיקרוסקופ confocal. הערה: אנו אוספים בדרך כלל כ-120 ערימות z-stacks בעובי μm כל 15 דקות באמצעות מטרה של 20X כדי לעקוב אחר התנהגויות התא הדינמי, אך מפרטים אלה צריכים להיות ממוטבים למטרת הניסויים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. (אופציונלי) הדמיה פיתוח אורגנואידים על ידי קיבעון וחיסונים
<ol><li>לתקן אורגנואידים בשלב הרצוי של פיתוח על ידי העברתם בקבוקון זכוכית מלא בתמיסה קיבעון. הערה: הוסף אמצעי אחסון של פתרון קיבעון שהוא >פי 20 מזה של הדגימות כדי להבטיח קיבעון מלא. בצע את התהליכים הבאים על מאכל אלא אם צוין אחרת. באופן כללי, אורגנואידים קבועים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS. עם זאת, ייתכן שיידרשו חומרים שונים כדי לזהות חלבונים ספציפיים. לדוגמה, השתמשנו 4% PFA עם 0.25% גלוטראלדהייד ב PBS כדי לזהות F-actin ו אצטילאט טובלין. כדי לזהות אינטלקטין (ITLN) ו ZO-1, אורגנואידים קבועים עם הפתרון של דנט קר כקרח (4:1 מתנול:dimethyl sulfoxide) ללילה ב -20 °C. יש ליבש באופן סדרתי את האורגניואידים הקבועים של דנט לפני השטיפה (שלב 6.3). ניתן לייעל את משך הדגירה והשטיפה של נוגדנים לצרכים ספציפיים.</li>
	<li>לתקן אורגנואידים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או לילה ב 4 °C.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBST (PBS עם 0.1% Triton X-100) במשך 15 דקות ב RT.</li>
	<li>חסום כריכה לא ספציפית עם סרום עזים של 10% ב- PBST (PBSGT) למשך שעה אחת ב- RT.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן ראשוני (1:200) ב PBSGT לילה ב 4 ° C.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBST במשך 15 דקות ב RT.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן משני (1:200) ב PBSGT לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBST במשך 15 דקות ב RT.</li>
	<li>מעבירים את האורגנואידים הקבועים והמחוסמים לתא הדמיה והמשיכו בהדמיה קונפוקלית.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids:+current+uses+and+future+promise.">Lung organoids: current uses and future promise.</a> Development. 144 (6), 986-997 (2017).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+Epithelial+Repair,+Regeneration,+and+Remodeling+after+Injury+in+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease.">Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).</li><li>Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+dysfunction+in+lung+disease.">Cilia dysfunction in lung disease.</a> Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airway+Epithelium:+Soldier+in+the+Fight+against+Respiratory+Viruses.">The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Dubaissi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secretory+cell+type+develops+alongside+multiciliated+cells,+ionocytes+and+goblet+cells,+and+provides+a+protective,+anti-infective+function+in+the+frog+embryonic+mucociliary+epidermis.">A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis.</a> Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+ciliogenesis+factors+using+a+new+in+vivo+model+for+mucociliary+epithelial+development.">Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development.</a> Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).</li><li>Walentek, P., Quigley, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+can+learn+from+a+tadpole+about+ciliopathies+and+airway+diseases:+Using+systems+biology+in+Xenopus+to+study+cilia+and+mucociliary+epithelia.">What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Werner, M. E., Mitchell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+ciliated+epithelia:+The+power+of+Xenopus.">Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus.</a> Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).</li><li>Dubaissi, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+frog+epidermis:+a+model+for+the+study+of+cell-cell+interactions+in+the+development+of+mucociliary+disease.">Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).</li><li>Walentek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serotonin-secreting+cell+type+regulates+ciliary+motility+in+the+mucociliary+epidermis+of+Xenopus+tadpoles.">A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles.</a> Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).</li><li>Asashima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organogenesis+from+undifferentiated+cells+in+Xenopus.">In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus.</a> Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).</li><li>Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+drives+regeneration+of+a+mucociliated+epidermis+on+the+surface+of+Xenopus+embryonic+aggregates.">Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates.</a> Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).</li><li>Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaN-Tp63+Mediates+Wnt/beta-Catenin-Induced+Inhibition+of+Differentiation+in+Basal+Stem+Cells+of+Mucociliary+Epithelia.">DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia.</a> Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).</li><li>Green, J., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , 1-13 (1999).</li><li>Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+intercalation+of+ciliated+cells+during+Xenopus+skin+development.">Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development.</a> Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+tools+for+quantifying+developmental+dynamics+in+Xenopus+embryos.">Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).</li><li>Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuronal+differentiation+by+planar+signals+in+Xenopus+embryos.">Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos.</a> Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).</li><li>Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+an+Apical+Epithelial+Cell+Surface+In+Vivo.">Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo.</a> Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).</li><li>Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+basal+stem+cells:+a+perspective+on+their+roles+in+epithelial+homeostasis+and+remodeling.">Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

אורגנואידים אפיתל Mucociliary המופק מתאי ectoderm עמוקים של העובר X. laevis הם כלי רב עוצמה כדי ללמוד את האפיתל והבידול של נביאים רב עוצמה במבחנה. בניגוד למאגר כובע בעליחיים מאומץ נרחב 16 המשמש במבחנה organogenesis13 ופיתוח אפיתליה mucociliary15,17,22 המנצלים את ectoderm שלם, אורגנואידים נגזר ectoderm עמוק המוצג בפרוטוקול זה מציעים הזדמנות ברורה לפקח על שלבי התחדשות מונחה מכניקת רקמות של אפיתלפני השטח 14. בסביבות 2 hpa, החדש שנוצר ZO-1 תאי אפיתלחיוביים (איור 2)מתחילים להופיע על פני השטח apical של אורגנואידים ולהגדיל את האוכלוסייה שלהם כדי לכסות את האורגניואיד כולו כמו הרקמה להתגבש או מפחית אתהתאימות 14. ההתחדשות של האפיתל ומפרטי תוחם הבאים עבור תאי גביע ייצור ריר להמשיך באופן ספונטני בתקשורת תרבות המוגדרת כימית בתוך יום. אורגנואידים אפיתל mucociliary המתפתחים במהירות לספק פלטפורמה לבחון התנהגויות תאים דינמיים בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה, במהלך צעדים מתקדמים של התחדשות אפיתל. הם גם מאפשרים חקירה של שאלות בסיסיות המתעוררות במהלך פיתוח אפיתל mucociliary, הומוסטאזיס,ומחלות קשורות 2,9,23. בפרט, הרגישות המכנית של תאי אב רבי עמוק במהלך המעבר מבשרי תא גביע אפיתל שזוהו באורגנואידים14 עשוי לשמש לקשר מחלות נשימה הקשורות בידול בסיס חריג שבו תאי גביע הפרשת ריר הם מעל- או מתחת מיוצר23.
בעוד פרוטוקול זה מציע גישה פשוטה כדי ליצור אורגנואידים אלה, ישנם מספר צעדים קריטיים להצלחה בניסויים. כדי למנוע זיהום של תאים אפיתל שטחיים במהלך הבידוד של תאים ectoderm עמוקים מכובע בעלי החיים, יש לפקח על כובע בעלי החיים להציב בסידן- ומגנזיום ללא DFA תחת סטריאוסקופ ולזהות את הזמן הנכון ליזום את ההפרדה של שכבה שטחית כהה פיגמנט של כובע בעלי החיים. אם הרקמה נשמרת ב- DFA ללא סידן ומגנזיום במשך זמן רב מדי, הרקמה כולה תנתק ותבדיל בין תאים עמוקים וחלניים יהיה בלתי אפשרי עבור אגרגטים ectoderm עמוק. כדי לאשר את היעדרם של תאים שטחיים בצרפיectoderm עמוקים, אנו ממליצים באופן פלורסנטי תיוג פני השטח apical של העובר עם NHS-rhodamine (שלב1.4 14)לפני מיקרוכירורגיה; זה יאפשר זיהוי קל של תאי פני השטח אם הם קיימים באורגן שנוצר. מאז התחדשות אפיתל מוסדר על ידימכניקת רקמות 14, זה חיוני כדי למנוע ייצור כוח לא מכוון עבור אורגנואידים ארגון עצמי. בפרט, אנו מציעים להימנע ממגע עם תחתית הזכוכית של תא ההדמיה במהלך הדמיה חיה על-ידי הצבת אגרגטים בקצוות רשתות TEM כפי שזה מאפשר מגע חופשי עם חלון ההדמיה של אגרגטים חיים (שלב 5.1.2.). זה במבחנה-תרבותי, מודל 3D מאורגן עצמית עבור אפיתל mucociliary ישמש ככלי לגרירה כדי לענות על השאלות הבסיסיות המתעוררות במהלך התחדשות של אפיתל מפרט תולדות של תאי גביע.

פציעה, זיהום, ומחלה של אפיתל רימוני קשורים ייצור לקוי ואישור של ריר אשר נמצא לעתים קרובות בהפרעות ריאתיות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית, אסטמה, סיסטיק פיברוזיס, bronchiectasis, ו dyskinesia ciliaryהראשי 1,2,3,4. התקדמות לאחרונה בטכנולוגיית אורגנואיד, למשל, התא בסיס נגזר אורגנואיד ריאות הנקרא tracheosphere המהסכם את ההתחדשות של אפיתל mucociliary להתעורר כמודל מבטיח עם פוטנציאל טיפולי1,5,6. עם זאת, השימוש בו מוגבל כיום, בין השאר בשל היעדר תנאי התרבות המוגדרים ויעילות נמוכה בהפקות אורגנואידים. אפיתל Mucociliary באפידרמיס דרכי הנשימה והצפרדע האנושי דומים להפליא מורפולוגיה רקמות, הרכב התא,ואת הפונקציה שלה 7,8,9,10,11,12. בשני האורגניזמים, אפיתל mucociliary מספק הגנה קו ראשון על ידי הפרשת ריר וחומרים מיקרוביאליים ומנקה חלקיקים מזיקים ופתוגנים באמצעות הפעולה המסונכרנת של cilia.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט כדי ליצור אורגנואידים אפיתל mucociliary באמצעות האבות הרב-תכליתיים של עוברי Xenopus laevis 13,14. בעבר, דיווחנו14 כי בהיעדר גורמי גדילה אקסוגניים והמטריצה החוץ תאית, תאים עמוקים מבודדים מיקרוכירורגית מן ectoderm שלב gastrula מוקדם באופן ספונטני להרכיב לתוך אגרגטים, לחדש את האפיתל על פני השטח שלה, ולהבשיל לתוך אפיתל mucociliary על ידי intercalating רב תאים אביזר אחרים בתוך 24 שעות. בנוסף להתפתחות המהירה, פרוטוקול זה מציע הזדמנות ברורה לגישה ישירה למעברים של תאים ectoderm עמוק רבפוטנטי לתוך אבות תאי גביע אפיתל המשנים את צעדי ההתחדשות של אפיתלמשובש 14 אשר אינם זמינים עוברים שלמים ectoderm (המכונה גם כובע בעליחיים) 15,16,17. המספר והגודל של האורבנואידים המיוצרים ניתנים להרחבה ביעילות גבוהה על ידי שליטה בחומרים ההתחלתיים של עוברי קסנופוס. אורגנואידים בתרבות צפה ניתן למיין בקלות ומועבר בשלב הרצוי לניתוחים נוספים, כולל הדמיה ברזולוציה גבוהה, בדיקות מכניות, טיפול תרופתי, אפיוןגנטי 14. זה ספונטני, מכניקת רקמות מונעת התחדשות של האפיתל על פני השטח של אגרגטים תא עוברי תוצאות אורגנואידים אפיתל mucociliary ולספק מודל תלת מימדי רומן (3D) כדי ללמוד את הביולוגיה של האפיתל mucociliary.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair knife</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cg10-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBS solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10M Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dejellying solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide 10M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22mm Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>222321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6/T7 in vitro transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA microinjection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>SSI</td>
			<td>SSI-3245-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-milled acrylic chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 24mmX50mm</td>
			<td>Duran</td>
			<td>B01_001650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>275HGN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2775GN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Shinetsu</td>
			<td>HIVAC-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20ml screw top-cap vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WH.986580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml screw top-cap vial</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sgima</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% EM GRADE</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraforlamdehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>LPS Solution</td>
			<td>CBP007B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>clone 6-11B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itln1</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>11770-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1h5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-mem-GFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-ZO1-RFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging

אפיתל Mucociliary מספק את קו ההגנה הראשון על ידי הסרת חלקיקים זרים באמצעות הפעולה של ייצור ריר וסיווג סיווג סיליה-מתווכת. פגמים רבים רלוונטיים קלינית באפיתל mucociliary הם להסיק כפי שהם מתרחשים עמוק בתוך הגוף. כאן, אנו מציגים מודל תלת-מימדי נשלף לאפיתל ריקוצילי המופק מנביאים רב-תכליתיים שהיו מבודדים מיקרוכירורגית מעוברי קסנופוס לאבי. אורגנואידים אפיתל mucociliary מכוסים אפיתל שנוצר לאחרונה מתאי ectoderm עמוקים ומאוחר יותר מעוטרים בתאים מרובי דפוס שונים, תאי הפרשה, ותאי גביע ייצור ריר כי הם לא ניתן להבחין בין האפידרמיס היליד בתוך 24 שעות. הרצפים המלאים של מעברי תאים דינמיים מ mesenchymal לאפיתל כי להגיח על פני השטח apical של אורגנואידים ניתן לעקוב על ידי הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה. אלה במבחנה, ארגון עצמי אורגנואידים אפיתל mucociliary מציעים יתרונות ברורים בלימוד הביולוגיה של אפיתל mucociliary עם יעילות גבוהה בדור, תנאי תרבות מוגדרים, שליטה על מספר וגודל, וגישה ישירה להדמיה חיה במהלך התחדשות האפיתל המבדיל.

פרוטוקול מתוקננים זה יוצר אורגנואיד אפיתל ריקולרי מקרבות רב-תכליתיים המבודדים מהשלב המוקדם של גסטרולה X. laevis עוברים בתוך 24 שעות שלטיפוח 14. נאסף תאים ectoderm עמוק להרכיב את עצמו כדי ליצור צבירה בצינור PCR שאינו דביק ולעבור אפיתל פני השטח בידול תאים גביע. המשטח האפיתל החדש של אגרגטים מספק מצע דומה אפיתל היליד נמצא vivo עבור תאים פנימיים intercalating (למשל, multiciliated ותאי עזר אחרים) ומתפתח כדי ליצור אורגנואידים אפיתלריקוצילי(איור 1,B). בתוך 24 שעות לאחר הצבירה, אורגנואידים אפיתל שרירים מאורגנים עצמית לחדש אפידרמיס בוגר כי הוא בלתי ניתן להבחין בין האפידרמיס של ראשן. organoids כוללים אפיתל מופרש באופן מלא (קרטין), תאי גביע הפרשת ריר (ITLN), תאים מרובי (טובולין אצטילאט), ותאי הפרשה קטנים (בוטנים אגלוטין, PNA)(איור 1C).
בנוסף לאישור הפיתוח של סוגי תאים שונים עם immunostaining, הדינמיקה של התפתחות אורגנואיד יכול להיות מלווה הדמיה חיה (איור 2A). כדי לבחון את האפיתל שעולה בשלב מוקדם של היווצרות אורגנואיד(איור 1B), תייגנועוברים על ידי הבעת חלבוני צומת הדוקים מתויגים פלורסנט (ZO-1-RFP) וחלבונים ללוקליזציה של קרום (mem-GFP). עם תיוג כפול, ניתן לסמן את השלבים היקצים של ZO-1-חיובי בצומת הדוקה וניתח אותם באופן כמותי במהלך האפיתל (איור 2). לדוגמה, עבור תאים(איור 2B, בצבע ירוק) בשלבים שונים של אפיתל (ב- 0 דקות), אזורים מסוימים של הדבקת תא-תא פיזרו פיסוק של ZO-1(איור 2B, חצים ירוקים). לעומת זאת, אזורים אחרים הרכיבו באופן מלא, ביטוי ZO-1 רציף(איור 2B, חצים צהובים). עם הזמן, הפאנקטה מתמזגת ומתחברת כדי ליצורצמתים הדוקים רציפים (איור 2B, חצים ירוקים), וצמתים הדוקים רציפים שומרים על המורפולוגיה שלהם גם במהלך חלוקתהתאים (איור 2B, חצים צהובים). ככל שהצומתים ההדוקים מתבגרים, התאים נעים באופן דינמי פנימה והחוצה מפני השטח לאורך המישורים האפיתיים של האורגניואידים(איור 2ג', ד). יתר על כן, על ידי מעקב אחר תאים spatiotemporally על פני השטח של אורגנואידיםמבדילים (איור 2B,תאים מקודדים בצבע), ניתוח בקנה מידה רב אפשרי, החל מporncta בודדים צמתים הדוקים רציפים, גבולות תא תא, ותת קבוצות של אוכלוסיות תאים בתוך אורגנואידים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig01.jpg"> איור 1: דור של אורגנואידים אפיתל mucociliary. (א)סכמטי המציג את הפרוטוקול להרכבת אגרגטים ectoderm עמוק מעוברי X. laevis. (ב)תרשים למודל של היווצרות אורגנואיד אפיתל ריקוצילי שמקורו בתאים ectoderm עמוק רבפוטנטי (תצוגה חוצה חתך). תאים ממוקמים על פני השטח לעבור לתאי אפיתל ולהבדיל לתאי גביע. ההבחנה תאים ciliated, תאים הפרשה, וionocytes באופן רדיאלי להיכנס אל פני השטח ולחדש אפידרמיס בוגר. (ג)הקרנת z מרבית של אפיתל mucociliary immunostained עבור ITLN (תאי גביע ייצור ריר), טובולין אצטילאט (תאים צובעים), PNA (תאים הפרשה קטנים), וקרטין (תאי אפיתל) באורגניטים ב 24 hpa (פאנל עליון) ואפידרמיס ראשן (פאנל תחתון). סרגל קנה מידה = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig02.jpg"> איור 2: הדמיה חיה של פיתוח אורגנואידים. (א)תרשים של תא ההדמיה עבור אורגנואידים חיים (לא בקנה מידה). (ב)רצפי זמן-לשגות של ערימות confocal שנאספו מתוך אגרגטים עמוקים של תאים ectoderm לבטא ZO-1-RFP ו mem-GFP מ 2.5 hpa. סרגל קנה מידה = 20 μm. תאים הם בצבע מדומה למעקב לאורך זמן. לתא בצבע ירוק יש מצבי הידבקות תאים שונים, כולל הידבקות חיובית ZO-1 המתפתחת בהדרגה (חצים ירוקים) ואחד ששומר על הדבקה חיובית רציפה של ZO-1 (חצים צהובים) לאורך זמן. (ג,ד) מה אתה עושה? תמונות קונפוקליות של ZO-1-RFP המביעים צבירות תאים ectoderm עמוקים להראות את התאים intercalating רדיאלי נע אל פני השטח (C, כוכב צהוב) ו נע בתוך אגרגטים (D, כוכב כחול). קנה מידה של פסים = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לפתח אורגנואידים אפיתל mucociliary מתאי ectoderm עמוקים מבודדים מעוברי Xenopus laevis. האבות הרב-פוטנטיים מחדשים את מבשרי תא גביע האפיתל ומאפשרים מעקב חי אחר החניכה וההתקדמות של מעברי התא על פני השטח של אורגנואידים.

אורגנואידים אפיתל Mucociliary מתאי עובר קסנופוס: דור, תרבות והדמיה חיה ברזולוציה גבוהה

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

אפיתל Mucociliary קווי איברים פנימיים של הגוף שלנו ומספק את קו ההגנה הראשון על ידי ניקוי חלקיקים זרים. פרוטוקול זה מאפשר ליצור תא עוברי נגזר אורגנואיד אפיתל ררית ב 24 שעות. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא שאנחנו יכולים לפקח על ההתקדמות החיה של מעברי תאים על פני השטח של אורגנואידים.פרוטוקול רבייה, מדרגי ומהיר זה עבור האורגנואיד המתפתח יאפשר לחוקרים לענות על שאלות בסיסיות לביולוגיה של אפיתל הררית. כדי להתחיל, להשיג X.Laevis עוברים על ידי איסוף ידני ביצים צפרדעים נקבה מגורה וביצוע הפריה חוץ גופית. דה-ג'לי העוברים המופריים בתסיסה עדינה של 2% ציסטאין, בשליש מלוחים של בארט שעבר שינוי X במשך כחמש דקות.תרבות העוברים בשליש XMBS בטמפרטורה המועדפת עד הסימנים הראשונים של שלב 10 מזוהים, כגון המראה של תאים פיגמנטיים כהים סביב blastopore בתצוגה הצמחית. בחר ואסוף עוברים כשהם מגיעים לשלב מוקדם 10 באמצעות כלי שיער תחת סטריאוסקופ. מעבירים את העוברים שנבחרו לצלחת פטרי במילוי DFA עם פיפטה להעברה חד פעמית.לאחר מכן להסיר את קרום vitelline של העוברים באמצעות מטלפים חדים מהצד הצמחי, מבלי לשבש את הצד החייתי של העובר. כדי לבודד את כובע החיה, מקם את הצד החייתי של העובר למעלה. ויזואלית להעריך את היקף הכובע החייתי להיות excised ולעשות את החתך הראשון לאורך הקצה עם סכין שיער, מושך את הסכין כלפי חוץ כדי להפוך את החתך.חזור על תהליך זה כדי ליצור שרשרת של חתכים קטנים כדי למלמל את כובע החיה. חותכים את הקצה עבה השכבות של כובע החיה באמצעות סכין שיער כדי למנוע הכללה של מבשרי mesoderm. כדי להפריד בין תאי אקטודרמה עמוקים למכסה החייתי, מעבירים את כובעי החיות הממולאים לצלחת פטרי מלאה בסידן ו-DFA ללא מגנזיום עם פיפטה להעברה חד פעמית.מקם את כובעי בעלי החיים כדי להתמודד עם צד החיה כלפי מעלה, תוך שמירה על מרחק נדיב מתפוצצים אחרים. המתן חמש עד עשר דקות ולאחר מכן נטר את המתפוצצים תחת סטריאוסקופ. לאחר שהתאים העמוקים המשוחררים שוחררו מקצה השכבה השטחית הכהה-פיגמנטית, התחילו להרים את השכבה השטחית הרחק מהתאים האפלודים העמוקים בצבעים בהירים.ניתוק זהיר של השכבה השטחית בעזרת סכין שיער, החל מהקצה. לאחר מכן לאסוף את התאים ectoderm עמוק עם מעט סידן ומגנזיום חינם DFA ככל האפשר. העברה אספה תאי ectoderm עמוקים לצינורות PCR שאינם דבק המכילים 200 microliters של DFA בעדינות pipette התקשורת פעמיים עד שלוש פעמים כדי לפזר את התאים שהועברו.סגור את הצינורות ולשמור אותם זקוף כדי לגרום לצבירה ספונטנית בתחתית. נטר את תהליך הצבירה תחת מיקרוסקופ סטריאו. תאים בדרך כלל מתאספים בתחתית צינור PCR בתוך שעה ולהרכיב לתוך אגרגטים כדוריים בתוך שעתיים עד שלוש שעות בהתאם לגודל.כדי לבצע הדמיה חיה או בדיקות סמים במהלך הפיתוח של אורגנואידים אפיתל הריר, לאסוף אגרגטים ב שעתיים לאחר הצבירה באמצעות פיפיליטר 200 מצויד טיפים מוגדלים. כדי לאפשר אגרגטים להתפתח אורגנואידים אפיתל רירית בתרבות, לאסוף אותם מצינור PCR בחמש שעות לאחר הצבירה ולהעביר אותם לצלחת פטרי מלא DFA. מקם את הצבירה רחוק אחד מהשני כדי למנוע היתוך.בתוך 24 שעות של תרבות בטמפרטורת החדר, ללא כל גורמים נוספים, אורגנואידים אפיתל ררית בוגרת ניתן לראות מסתובב בשל הסיסליה המכות המכסה את פני השטח של האפיתל הנבדל. הכינו תא הדמיה עם תחתית זכוכית על ידי הדבקת כיסוי לתא אקריליק טחון מותאם אישית עם שומן סיליקון, איטום הדוק של התא כדי למנוע דליפה של תקשורת התרבות, ולאחר מכן למלא את תא ההדמיה עם DFA. להרים מיקרוסקופ אלקטרונים שידור משושה אחד או רשת TEM באמצעות מלקחיים ולהחיל כמות זעירה של שומן על קצה הרשת.לחץ קלות כדי לאבטח את רשת TEM לתחתית תא ההדמיה. העבר את הצבירה לתא ההדמיה והצב אותם בתוך הרשת. ממלאים את התא ב- DFA ואוטמים אותו בזכוכית כיסוי ושומן.כדי לעקוב אחר ההתקדמות של היווצרות אורגנואיד אפיתל ריר, לאסוף תמונות z-מחסנית זמן פקע של אגרגטים באמצעות מיקרוסקופ confocal. אורגנואידים אפיתל Mucociliary נוצרו מאבי קדמונים רב תכליתיים של עוברי שלב גסטרולה מוקדם X.Laevis. האורגנואידים יש אפידרמיס בוגר כי הוא נבדל מזה של ראשן כולל אפיתל מובחן לחלוטין, ריר הפרשת תאי גביע, תאים multiciliated ותאי הפרשה קטנים.הדינמיקה של התפתחות האורגנואידים לוותה בהדמיה חיה. כדי לבחון את האפיתליזציה העולה בשלב מוקדם של היווצרות האורגנואידים, העוברים תויגו בחלבוני צומת הדוקים ומתויגים באופן פלואורסצנטי וחלבונים לוקליזציה של קרום. עם תיוג כפול השלבים הרציף של היווצרות צומת הדוק ZO-1 חיובי ניתן לסמן ולנתח כמותית במהלך אפיתליזציה.אזורים מסוימים של הידבקות תא תאים יש פנצטה מפוזרת של ZO-1 בשלבים שונים של אפיתליזציה. לעומת זאת, אזורים אחרים הרכיבו באופן מלא ביטוי ZO-1 רציף. עם הזמן הנקבה מתמזגת ומתחברת ויוצרת צמתים הדוקים רציפים, אשר שומרים על המורפולוגיה שלהם גם במהלך חלוקת התאים.ככל שהצומתים ההדוקים מתבגרים, התאים נעים באופן דינמי פנימה ומחוץ לפני השטח לאורך המישורים האפוריים של האורגנואידים. ניתוח רב-קנה מידה אפשרי על ידי מעקב אחר תאים מרחביים-זמניים על פני השטח של אורגנואידים מפרידים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לשים את הצד הכהה-פיגמנט של כובע החיה לבודד פונה כלפי מעלה ולנטר אותו תחת סטריאוסקופ.זה קריטי כדי להפריד את השכבה השטחית של כובע החיה בתזמון הנכון בתקשורת DFA ללא סידן / מגנזיום. פרוטוקול פשוט זה מציע דרכים שימושיות ללמוד התנהגויות תאים דינמיות, כמו גם את המנגנונים המולקולריים והפיזיים המסדירים אפיתל ררית.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...