Name: mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging
Uploaded: 2020-07-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Kim lab og Lance Davidson for deres kommentarer og støtte. Dette arbeidet ble støttet av Young Scientist Fellowship til HYK fra Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).

Dyrebruk og eksperimentelle protokoller ble godkjent av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC) ved Institute for Basic Science (IBS 18-01) og Korea Advanced Institute of Science and Technology (KA2017-22).
1. Embryoer
<ol><li>Få X. laevis embryoer ved hjelp av en standard prosedyre: manuelt samle egg fra stimulerte kvinnelige frosker og utføre in vitrobefruktning 18,19.</li>
	<li>De-gelé de befruktede embryoene med mild agitasjon i ca 5 min i 2% cystein i 1/3x modifisert Barths saltvann (MBS; se oppskriften på 1X MBS nedenfor) ved pH 819.</li>
	<li>Valgfritt trinn for levende bildebehandling: å fluorescerende merke bestemte proteiner og observere deres dynamikk i organoid, fortsett til seksjon 5.</li>
	<li>(Valgfritt) For å overvåke kontaminering av overfladiske ectoderm celler i organoider, merk den a apiske overflaten av embryoene med NHS-rhodamine på stadium 914. Inkuber embryoer i 1 mg/ml NHS-Rhodamine i 1/3x MBS (pH 9.0) i 30 min med mild nutation. Vask embryoer tre ganger ved å overføre til en petriskål fylt med 1/3x MBS i 15 min.</li>
	<li>Kultur embryoet i 1/3x MBS ved foretrukket temperatur (14–26 °C) til de første tegnene på trinn 10 oppdages (det vil vil at utseendet av mørke pigmenterte celler rundt blastopore ved vegetalvisningen).</li>
</ol>2. Utarbeidelse av mikrokirurgiske verktøy, løsninger og kulturfartøy
<ol><li>Forbered verktøyene som trengs, inkludert et par kirurgiske grade tang og hårverktøy (hårløkke og hårkniv) for mikrokirurgi20.</li>
	<li>Forbered følgende kulturmedier for embryoer: 1/3X MBS, der 1X MBS er laget med NaCl (88 mM), KCl (1 mM), NaHCO3 (2,4 mM), MgSO4 (0,82 mM), Ca(NO3)2 (0,33 mM), CaCl2 (0,41 mM) og HEPES (10 mM). Juster pH til 7,4 med 10 M NaOH. MERK: Valgfritt: Tilsett dråper fenolrød for å indikere pH.</li>
	<li>Forbered følgende kulturmedier for embryonale vev og organoider: Danilchik's for Amy (DFA)21 supplert med frisk 1% antibiotika og antimykotisk løsning. Forbered DFA med NaCl (53 mM), Na2CO3 (5 mM), kaliumglukonat (4,5 mM), natriumglukonat (32 mM), CaCl2 (1 mM) og MgSO4 (1 mM). Juster pH til 8,3 med granulær bicine. Filter DFA (0,2 μm flaskefilter), aliquot og oppbevar det ved -20 °C.</li>
	<li>Forbered kalsium- og magnesiumfri DFA for å skille dype celler fra ectoderm ved hjelp av oppskriften ovenfor og utelate CaCl2 og MgSO4. Aliquot og lagre på-20 °C.</li>
	<li>Forbered ikke-klebende PCR-rør for embryonal celleaggregasjon.<ol>
<li>For å indusere spontan aggregering av de isolerte embryonale cellene, klargjør ikke-klebende PCR-rør ved å belegge runde bunnede PCR-rør med 200 μL på 1% BSA (1 g BSA i 100 ml destillert vann) over natten ved 4 °C eller i 2 timer ved romtemperatur. Hvert rør vil bli brukt til å montere en organoid.</li>
		<li>Skyll BSA-belagte PCR-rør med DFA tre ganger for å fjerne eventuelle gjenværende BSA.</li>
		<li>Fyll PCR-rør med 200 μL DFA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolering av dype ectoderm celler
<ol><li>Velg og samle embryoer som de når tidlig stadium 10 ved hjelp av hårverktøy under et stereoskop.</li>
	<li>Bruk en engangsoverføringspipette til å overføre de valgte embryoene til en DFA-fylt petriskål.</li>
	<li>Fjern vitellinmembranen til embryoene ved hjelp av skarpe tang fra vegetalsiden uten å forstyrre embryoets dyreside. MERK: Vær forsiktig så du unngår å utsette embryoer for luften. Innføring av luftbobler i løsningen eller bringe embryoer til overflaten vil føre til at embryoet brister.</li>
	<li>For å isolere dyrehetten, plasser dyresiden av embryoet opp.</li>
	<li>Visuelt estimer omfanget av dyrehetten som skal skåret ut og gjøre det første snittet langs kanten av dyrehetten med en hårkniv. Trekk hårkniven utover for å lage et kutt.</li>
	<li>Gjenta trinn 3.5 for å lage en kjede av små kutt for å avgiftsdirektoratet dyrehetten.</li>
	<li>Trim den tykke lagdelte kanten av dyrehetten ved hjelp av en hårkniv for å forhindre inkludering av mesoderm forløpere. MERK: For å forhindre helbredelse og aggregering av isolerte dyrehetter, fortsett til neste trinn innen 10 min. Vanligvis isolerer vi 5-10 dyrecaps om gangen for å montere flere organoider.</li>
	<li>For å skille dype ectoderm celler fra dyrehetten, overfør de utskårete dyrehettene til en petriskål fylt med kalsium- og magnesiumfri DFA med en engangsoverføringspipette. Vær forsiktig så du ikke introduserer noen luftbobler under overføringen.</li>
	<li>For å holde nok plass til de neste trinnene, bruk hårverktøyene, plasser dyrehettene for å møte dyresiden opp og opprettholde en sjenerøs avstand fra andre explants.</li>
	<li>Vent i 5–10 min og overvåk deretter eksplodene under et stereoskop. Når løsnede dype celler har blitt funnet fra kanten av det mørkepigmenterte overfladiske laget, begynn å løfte det overfladiske laget bort fra de lyse dype ectodermcellene ved hjelp av en hårkniv under stereoskopet.</li>
	<li>Ta forsiktig av (peel-off) det overfladiske laget med en hårkniv, som starter på kanten.</li>
	<li>Samle de dype ectoderm cellene med minimum aspirasjon (10 \ u201215 μL) for å begrense mengden kalsium- og magnesiumfri DFA som overføres til aggregeringsmediet i neste trinn. MERK: Frittliggende overfladiske celler kan fjernes fra media for å hindre forurense de gjenværende dype ectoderm cellene.</li>
</ol>4. Generasjon av mucociliary epitelorganoider
<ol><li>Overfør innsamlede dype ectoderm celler til et ikke-klebende PCR-rør som inneholder 200 μL DFA. Pipette mediet forsiktig (2\u20123 ganger) for å spre overførte celler i PCR-røret. MERK: Tidsberegningen som er angitt som timer etter aggregering (hpa) starter på dette trinnet. Størrelsen på de resulterende organoider styres av antall dype ectoderm celler lagt til et PCR-rør. Dype ectoderm celler fra en eller flere dyr caps kan brukes, avhengig av ønsket størrelse på organoid.</li>
	<li>Lukk PCR-røret. Hold PCR-rørene oppreist for å indusere spontan aggregering nederst.</li>
	<li>Overvåk aggregeringsprosessen under et stereoskop. Celler samles vanligvis på bunnen av PCR-røret innen en time og monteres i sfæriske aggregater innen 2–3 timer, avhengig av størrelsen.</li>
	<li>For å utføre levende bildebehandling eller narkotikatesting under utviklingen av mucociliary epitelorganoider, samle aggregater på 2 hpa ved hjelp av en 200 μL pipette utstyrt med forstørrede spisser (kuttet med sterilisert saks) for å unngå å forårsake skade på aggregatene under innsamling.</li>
	<li>For å tillate aggregater å utvikle seg til mucociliary epitelorganoid i kultur, samle sfæriske aggregater fra PCR-røret ved 5 hpa og overføre dem til en DFA-fylt petriskål.</li>
	<li>Plasser aggregatene langt fra andre for å hindre dem i å fikse. Innen 24 timer kultur ved romtemperatur uten ekstra faktorer, kan modne mucociliary epitelorganoider observeres å rotere med virkningen av å slå flimmerhår som dekker overflaten av det differensierte epitelet</li>
</ol>5. (Valgfritt) Høyoppløselig levende avbildning av utvikling av organoider
<ol><li>Forbered mRNA for mikroinjeksjon.<ol>
<li>For å visualisere epitelialiseringen som oppstår i begynnelsen av organoiddannelsen, forberede mRNA for epitel-spesifikk reguleringsplan okkluder protein-1 (ZO-1) og for å skissere cellemembraner ved å forsterke pCS2-ZO1-RFP og pCS2-mem-GFP plasmids (en gave fra Lance Davidson).</li>
		<li>Trekk ut og lineæriser plasmid-DNA, og transkriber deretter den avgrensede mRNA ved hjelp av et SP6/T7 in vitro transkripsjonssett.</li>
		<li>Aliquot transkribert mRNA og lagre den ved -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroinjisere mRNA i et befruktet embryo<ol>
<li>Plasser befruktede embryoer i 3% Ficoll i 1x MBS.</li>
		<li>Legg 3–4 μL mRNA ved hjelp av en mikrolasterspiss i en trukket glassnål (en lang og fin konisk nålespiss med en innvendig diameter på 10\u201230 μm).</li>
		<li>Fest nålen til en mikroinjektor og juster tid og trykk for å levere et konstant volum mRNA for mikroinjeksjon.</li>
		<li>Injiser mRNA like under den akeiske overflaten av dyrestangen. En distinkt blekfarget sirkulær patch som skyldes utvidelsen av cortex er synlig på tidspunktet for mikroinjeksjon.</li>
		<li>Overfør de injiserte embryoene til 1/3X MBS og kultur dem til trinn 9.5.</li>
		<li>Samle fluorescerende merkede embryoer under et fluorescensstereosko (eksitasjons-/utslippsinnstillinger for GFP (488/510) og RFP (532/588)).</li>
		<li>Fortsett med trinn 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sett sammen og kultur organoid (avsnitt 3 og 4) til ønsket utviklingsstadium.</li>
	<li>Utfør levende bildebehandling.<ol>
<li>Forbered et bildekammer med glassbunn ved å lime et dekkglass til et spesialmalt akrylkammer ved hjelp av silisiumfett. MERK: Forsegle kammeret tett for å hindre lekkasje av kulturmediene.</li>
		<li>Fyll bildekammeret med DFA.</li>
		<li>Velg ett sekskantet transmisjonselektronmikroskopi (TEM) rutenett (75 mesh) fra en beholder ved hjelp av tang og påfør en liten mengde fett på kanten av gitteret. MERK: Størrelsen på nettet skal være mindre enn diameteren på aggregatet slik at aggregatet sitter på rutenettet.</li>
		<li>Trykk lett ned for å feste TEM-rutenettet til bunnen av bildekammeret.</li>
		<li>Overfør aggregatene til bildekammeret og plasser dem i rutenettet. MERK: Unngå å plassere aggregatene ved siden av fettet. Gjennom hele eksperimentet bør aggregatene sitte på TEM-rutenettet uten å kontakte bunnen av kammeret for å forhindre fysisk kompresjon.</li>
		<li>Fyll opp bildekammeret med DFA og forsegle det med et dekkglass og fett. MERK: Kammeret skal være lufttett uten luftbobler for å hindre turbulens eller bevegelse under bildebehandling.</li>
		<li>For å følge utviklingen av mucociliary epitelorganoid dannelse, samle time-lapse z-stack bilder av aggregater (fra 2 hpa) ved hjelp av et konfokal mikroskop. MERK: Vi samler vanligvis inn ~ 120 μm tykke z-stabler hver 15 min ved hjelp av et 20X-mål for å følge den dynamiske celleatferden, men disse spesifikasjonene bør optimaliseres for målet med eksperimenter.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. (Valgfritt) Imaging utvikle organoider ved fiksering og immunstaining
<ol><li>Fest organoider på ønsket utviklingsstadium ved å overføre dem til et hetteglass fylt med en fikseringsløsning. MERK: Legg til et volum med fikseringsløsning som er >20 ganger så mange som prøvene for å sikre fullstendig fiksering. Utfør følgende prosesser på en nutator med mindre annet er angitt. Generelt er organoider fast med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Imidlertid kan det være nødvendig med forskjellige fikseringsmidler for å oppdage spesifikke proteiner. For eksempel brukte vi 4% PFA med 0,25% glutaraldehyd i PBS for å oppdage F-actin og acetylated tubulin. For å oppdage intelectin (ITLN) og ZO-1, er organoider festet med iskalde Dents løsning (4:1 metanol:dimetylsulfoksid) for overnatting ved -20 °C. Dents faste organoider bør være seriedehydrert før vask (trinn 6.3). Varighet for antistoff inkubasjon og vasking kan optimaliseres for spesifikke behov.</li>
	<li>Fest organoider i 15 min ved romtemperatur (RT) eller over natten ved 4 °C.</li>
	<li>Vask 3 ganger med PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) i 15 min ved RT.</li>
	<li>Blokk uspesifisert binding med 10% geiteserum i PBST (PBSGT) i 1 time ved RT.</li>
	<li>Inkuber med primært antistoff (1:200) i PBSGT over natten ved 4 °C.</li>
	<li>Vask 3 ganger med PBST i 15 min ved RT.</li>
	<li>Inkuber med sekundært antistoff (1:200) i PBSGT over natten ved 4 °C.</li>
	<li>Vask 3 ganger med PBST i 15 min ved RT.</li>
	<li>Overfør faste og immunostained organoider til et bildekammer og fortsett med konfokal avbildning.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids:+current+uses+and+future+promise.">Lung organoids: current uses and future promise.</a> Development. 144 (6), 986-997 (2017).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+Epithelial+Repair,+Regeneration,+and+Remodeling+after+Injury+in+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease.">Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).</li><li>Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+dysfunction+in+lung+disease.">Cilia dysfunction in lung disease.</a> Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airway+Epithelium:+Soldier+in+the+Fight+against+Respiratory+Viruses.">The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Dubaissi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secretory+cell+type+develops+alongside+multiciliated+cells,+ionocytes+and+goblet+cells,+and+provides+a+protective,+anti-infective+function+in+the+frog+embryonic+mucociliary+epidermis.">A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis.</a> Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+ciliogenesis+factors+using+a+new+in+vivo+model+for+mucociliary+epithelial+development.">Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development.</a> Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).</li><li>Walentek, P., Quigley, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+can+learn+from+a+tadpole+about+ciliopathies+and+airway+diseases:+Using+systems+biology+in+Xenopus+to+study+cilia+and+mucociliary+epithelia.">What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Werner, M. E., Mitchell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+ciliated+epithelia:+The+power+of+Xenopus.">Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus.</a> Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).</li><li>Dubaissi, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+frog+epidermis:+a+model+for+the+study+of+cell-cell+interactions+in+the+development+of+mucociliary+disease.">Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).</li><li>Walentek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serotonin-secreting+cell+type+regulates+ciliary+motility+in+the+mucociliary+epidermis+of+Xenopus+tadpoles.">A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles.</a> Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).</li><li>Asashima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organogenesis+from+undifferentiated+cells+in+Xenopus.">In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus.</a> Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).</li><li>Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+drives+regeneration+of+a+mucociliated+epidermis+on+the+surface+of+Xenopus+embryonic+aggregates.">Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates.</a> Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).</li><li>Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaN-Tp63+Mediates+Wnt/beta-Catenin-Induced+Inhibition+of+Differentiation+in+Basal+Stem+Cells+of+Mucociliary+Epithelia.">DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia.</a> Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).</li><li>Green, J., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , 1-13 (1999).</li><li>Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+intercalation+of+ciliated+cells+during+Xenopus+skin+development.">Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development.</a> Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+tools+for+quantifying+developmental+dynamics+in+Xenopus+embryos.">Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).</li><li>Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuronal+differentiation+by+planar+signals+in+Xenopus+embryos.">Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos.</a> Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).</li><li>Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+an+Apical+Epithelial+Cell+Surface+In+Vivo.">Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo.</a> Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).</li><li>Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+basal+stem+cells:+a+perspective+on+their+roles+in+epithelial+homeostasis+and+remodeling.">Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Mucociliary epitelorganoider generert fra dype ectoderm celler av X. laevis embryo er et kraftig verktøy for å studere epitelialisering og differensiering av multipotente stamfar in vitro. I motsetning til den allment vedtatte dyrehetteanalysen 16 som brukes til in vitro organogenese13 og utviklingen av mucociliary epithelia15,17,22 som benytter intakt ectoderm, gir de dype ectoderm-avledede organoidene som presenteres i denne protokollen en tydelig mulighet til å overvåke vevsmekanikkdrevne regenereringsfaser av overflateepitelet14. Ved rundt 2 hk begynner de nylig genererte ZO-1 positive epitelcellene (figur 2) å vises på den a apiske overflaten av organoider og øke befolkningen for å dekke hele organoiden som vevet stivne eller redusereroverholdelse 14. Regenerering av epitelet og påfølgende avstamningsspesifikasjoner for slimproduserende begerceller fortsetter spontant i et kjemisk definert kulturmedi innen en dag. Disse raskt utvikle mucociliary epitel organoider gir en plattform for å undersøke dynamisk celle atferd i sanntid, i høy oppløsning, under progressive trinn av epitelregenerering. De muliggjør også undersøkelse av grunnleggende spørsmål som oppstår under mucociliary epitelutvikling, homeostase og tilhørendesykdommer 2,9,23. Spesielt kan den mekaniske følsomheten til de dype stamcellene under overgangen til epitelbegercelleforløpere identifisert i organoidene14 tjene til å knytte respiratoriske sykdommer forbundet med unormal basal differensiering der slimutskillende begerceller er over- eller underproduserte23.
Selv om denne protokollen tilbyr en enkel tilnærming til å generere disse organoidene, er det flere kritiske skritt for å lykkes i eksperimenter. For å forhindre kontaminering av overfladiske epitelceller under isolering av dype ectodermceller fra dyrehetten, bør man overvåke dyrehetten plassert i kalsium- og magnesiumfri DFA under et stereoskop og oppdage riktig tidspunkt for å initiere separasjonen av det mørke pigmenterte overfladiske laget av dyrehetten. Hvis vevet holdes i kalsium- og magnesiumfri DFA for lenge, vil hele vevet dissosiere og skille mellom dype og overfladiske celler vil da være umulig for dype ectoderm aggregater. For å bekrefte fraværet av overfladiske celler i dype ektoderm aggregater, anbefaler vi fluorescerende merking av den a apiske overflaten av embryoet med NHS-rhodamine (trinn 1.414) før mikrokirurgi; dette ville tillate enkel identifisering av overflateceller hvis de finnes i de resulterende organoider. Siden epitelregenerering reguleres av vevsmekanikk14, er det viktig å unngå utilsiktet kraftgenerering for selvorganisering av organoider. Spesielt foreslår vi at du unngår kontakt med glassbunnen av bildebehandlingskammeret under levende bildebehandling ved å plassere aggregater på kantene av TEM-rutenettene, da dette gir fri kontakt med bildevinduet til live aggregater (trinn 5.1.2.). Denne in vitro-kultivert, selvorganisert 3D-modell for mucociliary epitel vil tjene som et tractable verktøy for å svare på de grunnleggende spørsmålene som oppstår under regenerering av epitel og avstamningsspesifikasjonen av begerceller.

Skade, infeksjon og sykdom av slimete epitel er forbundet med nedsatt produksjon og clearance av slim som ofte finnes i lungesykdommer som kronisk obstruktiv lungesykdom, astma, cystisk fibrose, bronkiektasi og primær ciliary dyskinesi1,2,3,4. Et nylig fremskritt innen organoidteknologi, for eksempel, basalcellen avledet lungeorganoid kalt tracheosphere som rekapilerer regenerering av mucociliary epitel oppstår som en lovende modell med terapeutisk potensial1,5,6. Bruken er imidlertid for tiden begrenset, delvis på grunn av mangel på definerte kulturforhold og lav effektivitet i organoide produksjoner. Mucociliary epitel i humane luftveier og frosk epidermis er bemerkelsesverdig like i vev morfologi, cellulær sammensetning, og dens funksjon7,8,9,10,11,12. I begge organismene gir slimetiopitel førstelinjeforsvar ved å skille ut slim og antimikrobielle stoffer og fjerner skadelige partikler og patogener gjennom den synkroniserte virkningen av flimmerhår.
Her beskriver vi en enkel protokoll for å generere mucociliary epitelorganoider ved hjelp av de multipotente forfedrene til Xenopus laevis embryoer13,14. Tidligere rapporterte vi14 at i fravær av eksogene vekstfaktorer og den ekstracellulære matrisen, mikrokirurgisk isolerte dype celler fra tidlig gastrula stadium ectoderm spontant samles i aggregater, regenerere epitel på overflaten, og modnes til mucociliary epitel ved å interkalere multikilierte og andre tilbehørsceller innen 24 h. I tillegg til den raske utviklingen, gir denne protokollen en klar mulighet for direkte tilgang til overgangene til multipotente dype ectoderm celler til epitelbegercelle forfedre som rekapilerer regenereringstrinnene til et forstyrret epitel14 som ikke er tilgjengelige fra intakte embryoer og ectoderm (også kjent som dyrehetten)15,16,17. Antallet og størrelsen på organoidene som produseres, kan skaleres med høy effektivitet ved å kontrollere startmaterialene fra Xenopus embryoer. Organoider i flytende kultur kan enkelt sorteres og overføres på ønsket stadium for videre analyser, inkludert høyoppløselig bildebehandling, mekanisk testing, narkotikabehandling og genetisk karakterisering14. Denne spontane, vevsmekanikkdrevne regenereringen av epitelet på overflaten av embryonale celleaggregater resulterer i mucociliary epitelorganoider og gir en ny tredimensjonal (3D) modell for å studere biologien til det mucociliary epitelet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair knife</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cg10-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBS solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10M Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dejellying solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide 10M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22mm Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>222321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6/T7 in vitro transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA microinjection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>SSI</td>
			<td>SSI-3245-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-milled acrylic chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 24mmX50mm</td>
			<td>Duran</td>
			<td>B01_001650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>275HGN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2775GN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Shinetsu</td>
			<td>HIVAC-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20ml screw top-cap vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WH.986580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml screw top-cap vial</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sgima</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% EM GRADE</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraforlamdehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>LPS Solution</td>
			<td>CBP007B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>clone 6-11B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itln1</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>11770-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1h5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-mem-GFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-ZO1-RFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging

Mucociliary epitel gir den første forsvarslinjen ved å fjerne fremmede partikler gjennom virkningen av slimproduksjon og cilia-mediert klaring. Mange klinisk relevante defekter i mucociliary epitelet er utsatt som de oppstår dypt inne i kroppen. Her introduserer vi en tractable 3D-modell for mucociliary epitel generert fra multipotente forfedre som var mikrokirurgisk isolert fra Xenopus laevis embryoer. Mucociliary epitelorganoider er dekket med nygenererte epitel fra dype ectoderm celler og senere dekorert med distinkte mønstrede multikilierte celler, sekretoriske celler, og slim-produserende begerceller som ikke kan skilles fra de innfødte epidermis innen 24 h. De fullstendige sekvensene av dynamiske celleoverganger fra mesenchymal til epitel som dukker opp på den apiske overflaten av organoider, kan spores av høyoppløselig live imaging. Disse in vitro kultiverte, selvorganiserende mucociliary epitelorganoider gir forskjellige fordeler i å studere biologien til mucociliary epitel med høy effektivitet i generasjon, definerte kulturforhold, kontroll over antall og størrelse, og direkte tilgang for levende avbildning under regenerering av differensiert epitel.

Denne standardiserte protokollen genererer en mucociliary epitel organoid fra multipotente forfedre isolert fra tidlig gastrula stadium X. laevis embryoer innen 24 timer av dyrking14. Samlet dype ectoderm celler selv montere for å danne en aggregat i en ikke-klebende PCR rør og gjennomgå overflate epitelisering og begercelledilatering. Den nylig epitelialiserte overflaten av aggregater gir et substrat som ligner på det opprinnelige epitelet som finnes in vivo for intercalating indre celler (f.eks. multikilierte og andre tilbehørsceller) og utvikler seg til å danne mucociliary epitelorganoider (figur 1A, B). Innen 24 timer etter aggregering regenererer selvorganiserte mucociliary epitelorganoider en moden epidermis som ikke kan skilles fra epidermis av en rumpetroll. Organoidene består av fullt differensiert epitel (keratin), slim-utskillende begerceller (ITLN), multikilierte celler (acetylated tubulin) og små sekretoriske celler (peanøttagglutinin, PNA) (figur 1C).
I tillegg til å bekrefte utviklingen av ulike celletyper med immunstaining, kan dynamikken i organoidutvikling etterfølges av levende bildebehandling (figur 2A). For å undersøke epitelialiseringen som oppstår på et tidlig stadium av organoiddannelse (figur 1B), merket vi embryoer ved å uttrykke fluorescerende merkede tette koblingsproteiner (ZO-1-RFP) og membran lokaliserende proteiner (mem-GFP). Med dobbel merking kan de sekvensielle trinnene i ZO-1-positiv tett veikryssdannelse merkes og kvantitativt analyseres under epitelialisering (figur 2). For celler ( figur2B, grønnfarget) på forskjellige stadier av epitelialisering (ved 0 min), har noen regioner med cellecelle vedheft spredt punktpunkt av ZO-1 (Figur 2B, grønne piler). Derimot har andre områder fullt montert, sammenhengende ZO-1 uttrykk (Figur 2B, gule piler). Over tid samler punktpunkt og kobles til for å danne sammenhengende tette veikryss (Figur 2B, grønne piler), og sammenhengende tette veikryss opprettholder sin morfologi selv under celledeling (Figur 2B, gule piler). Etter hvert som de trange veikryssene modnes, beveger cellene seg dynamisk inn og ut av overflaten langs de a apiske planene til organoidene (figur 2C, D). Videre, ved å spore celler spatiotemporally på overflaten av differensiering organoider (Figur 2B, fargekodede celler), multi-skala analyse er mulig, alt fra individuell punktpunkt til sammenhengende tette veikryss, cellecellegrenser, og undergrupper av cellepopulasjoner innenfor organoider.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig01.jpg"> Figur 1: Generasjon av mucociliary epitelorganoider. (A)En skjematisk som viser protokollen for å montere dype ectoderm aggregater fra X. laevis embryoer. (B)En skjematisk for en modell av mucociliary epitel organoid formasjon stammer fra multipotente dype ectoderm celler (tverrsnittsvisning). Overflateposisjonerte celler går over i epitelceller og skiller seg inn i begerceller. Differensiere ciliated celler, sekretoriske celler, og ionocytter radialt intercalate inn i overflaten og regenerere en moden epidermis. (C)Maksimal z-projeksjon av mucociliary epitel immunostained for ITLN (slimproduserende begerceller), acetylated tubulin (ciliated celler), PNA (små sekretoriske celler), og keratin (epitelceller) i organoider ved 24 hpa (øvre panel) og rumpetroll epidermis (nedre panel). Vektstangen = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig02.jpg"> Figur 2: Levende avbildning av utvikling av organoider. (A) En skjematisk av bildekammeret for levende organoider (ikke å skalere). (B)Time-lapse sekvenser av confocal stabler samlet fra dype ectoderm celle aggregater uttrykker ZO-1-RFP og mem-GFP fra 2,5 hpa. Vektstangen = 20 μm. Celler er pseudo-farget for sporing over tid. Grønnfarget celle har forskjellige celle vedheftsstatuser, inkludert en som gradvis utvikler ZO-1 positiv vedheft (grønne piler) og en opprettholder sammenhengende ZO-1 positiv vedheft (gule piler) over tid. (C, D) Tidsforløp confocal bilder av ZO-1-RFP-uttrykke dype ectoderm celle aggregater viser radial intercalating celler beveger seg til overflaten (C, gul stjerne) og beveger seg inne i aggregatene (D, blå stjerne). Vektstenger = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Vi beskriver en enkel protokoll for å utvikle mucociliary epitelorganoider fra dype ectoderm celler isolert fra Xenopus laevis embryoer. De multipotente forfedrene regenererer epitelbegercelleforløpere og tillater live sporing av initiering og progresjon av celleovergangene på overflaten av organoider.

Mucociliary Epitel Organoids fra Xenopus embryonale celler: Generasjon, kultur og høyoppløselig live imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Mucociliary epitel linjer indre organer i kroppen vår og gir den første forsvarslinjen ved å fjerne fremmede partikler. Denne protokollen gjør det mulig å generere embryonale celle avledet mucociliary epitel organoid i 24 timer. Den viktigste fordelen med vår metode er at vi kan overvåke den levende utviklingen av celleoverganger på overflaten av organoider.Denne reproduserbare, skalerbare og raske protokollen for det utviklende organoidet vil tillate forskere å ta opp grunnleggende spørsmål for biologien til mucociliary epitel. Til å begynne med, få X.Laevis embryoer ved å manuelt samle egg fra stimulerte kvinnelige frosker og utføre in vitro befruktning. De-gelé de befruktede embryoene med mild agitasjon i 2% cystein, i en tredjedel X-modifisert Barths saltvann i omtrent fem minutter.Kultur embryoene i en tredjedel XMBS ved foretrukket temperatur til de første tegnene på stadium 10 oppdages, for eksempel utseendet av mørke pigmenterte celler rundt blastoporet på vegetalvisningen. Velg og samle embryoer som de når tidlig stadium 10 ved hjelp av hårverktøy under et stereoskop. Overfør de valgte embryoene til en DFA-fylt petriskål med en engangsoverføringspipette.Fjern deretter vitellinmembranen til embryoene ved hjelp av skarpe tang fra vegetalsiden, uten å forstyrre dyrets side av embryoet. For å isolere dyrehetten, plasser dyresiden av embryoet opp. Visuelt estimer omfanget av dyrehetten som skal skåret ut og gjøre det første snittet langs kanten med en hårkniv, trekke kniven utover for å gjøre kuttet.Gjenta denne prosessen for å lage en kjede av små kutt for å avgiftsdirektoratet dyrehetten. Trim den tykke lagdelte kanten av dyrehetten ved hjelp av en hårkniv for å forhindre inkludering av mesoderm forløpere. For å skille dype ectoderm celler fra dyrehetten, overfør de utskårete dyrehettene til en petriskål fylt med kalsium og magnesiumfri DFA med en engangsoverføringspipette.Plasser dyrehettene for å møte dyret side opp, og hold en sjenerøs avstand fra andre explants. Vent i fem til ti minutter, og overvåk deretter explants under et stereoskop. Når de løsnede dype cellene har blitt frigjort fra kanten av det mørke pigmenterte overfladiske laget, begynner du å løfte det overfladiske laget bort fra de lyse dype ectodermcellene.Ta forsiktig det overfladiske laget med en hårkniv, som starter på kanten. Samle deretter de dype ectoderm cellene med så lite kalsium og magnesiumfri DFA som mulig. Overfør innsamlede dype ectoderm celler til ikke-klebende PCR-rør som inneholder 200 mikroliter DFA og forsiktig pipette media to til tre ganger for å spre de overførte cellene.Lukk rørene og hold dem oppreist for å indusere spontan aggregering nederst. Overvåk aggregeringsprosessen under et stereomikroskop. Celler samles vanligvis på bunnen av PCR-røret innen en time og monteres i sfæriske aggregater innen to til tre timer, avhengig av størrelsen.For å utføre levende bildebehandling eller narkotikatesting under utviklingen av mucociliary epitelorganoider, samle aggregater på to timer etter aggregering ved hjelp av en 200 mikroliter pipette utstyrt med forstørrede spisser. For å tillate aggregater å utvikle seg til mucociliary epitelorganoider i kultur, samle dem fra PCR-røret på fem timer etter aggregering og overføre dem til en DFA-fylt petriskål. Plasser aggregatene langt fra hverandre for å hindre fiksering.Innen 24 timer med kultur ved romtemperatur, uten noen ekstra faktorer, kan modne mucociliary epitelorganoider observeres roterende på grunn av den slående flimmeri som dekker overflaten av det differensierte epitelet. Forbered et bildekammer med glassbunn ved å lime et dekkglass til et tilpasset malt akrylkammer med silisiumfett, tette kammeret for å forhindre lekkasje av kulturmediene, og fyll deretter bildekammeret med DFA. Plukk opp en sekskantet transmisjon elektron mikroskopi eller TEM rutenett ved hjelp av tang og påfør en liten mengde fett på kanten av rutenettet.Trykk lett ned for å feste TEM-rutenettet til bunnen av bildekammeret. Overfør aggregatene til bildekammeret og plasser dem i rutenettet. Fyll kammeret med DFA og forsegle det med et dekkglass og fett.For å følge utviklingen av mucociliary epitelorganoid dannelse, samle tidsavrundet z-stack bilder av aggregater ved hjelp av et konfokal mikroskop. Mucociliary epitelorganoider ble generert fra multipotente forfedre av tidlige gastrula stadium X.Laevis embryoer. Organoidene har en moden epidermis som ikke kan skilles fra en rumpetroll, inkludert et fullt differensiert epitel, slim som utskiller begerceller, multikilierte celler og små sekretoriske celler.Dynamikken i organoid utvikling ble etterfulgt av levende bildebehandling. For å undersøke epitelialiseringen som oppstår på det tidlige stadiet av organoiddannelse, ble embryoene merket med fluorescerende merkede tette koblingsproteiner og membran lokaliserende proteiner. Med dobbel merking kan de sekvensielle trinnene i ZO-1 positiv tett veikryssdannelse merkes og kvantitativt analyseres under epitelialisering.Noen regioner av cellecelle vedheft har spredt punktpunkt av ZO-1 på forskjellige stadier av epitelisering. Derimot har andre områder fullt montert sammenhengende ZO-1-uttrykk. Over tid puncta samler seg og koble til å danne sammenhengende tette veikryss, som opprettholder sin morfologi selv under celledeling.Etter hvert som de stramme veikryssene modnes, beveger cellene seg dynamisk inn og ut av overflaten langs de a apiske planene til organoidene. Multi-skala analyse er mulig ved å spore celler spatio-temporally på overflaten av differensiering organoider. Når du prøver denne protokollen, husk å sette den mørke pigmenterte siden av den isolerende dyrehetten vendt opp og overvåke den under et stereoskop.Det er viktig å skille det overfladiske laget av dyrehetten til riktig tidspunkt i kalsium / magnesiumfrie DFA-medier. Denne enkle protokollen tilbyr praktiske måter å studere dynamisk celle atferd samt molekylære og fysiske mekanismer som regulerer mucociliary epitel.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generation of hepatocytter-lignende celler fra humane embryonale Stem Cell pasientgrupper

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...