Name: mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging
Uploaded: 2020-07-28T15:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

Vi tackar medlemmar av Kim lab och Lance Davidson för deras kommentarer och stöd. Detta arbete stöddes av Young Scientist Fellowship till HYK från Institute for Basic Science (IBS-R0250Y1).

Animal användning och experimentella protokoll godkändes av den institutionella djurvård och användning kommitté (IACUC) av Institutet för grundläggande vetenskap (IBS 18-01) och Korea Advanced Institute of Science and Technology (KA2017-22).
1. Embryon
<ol><li>Erhåll X. laevis embryon med hjälp av ett standardförfarande: manuellt samla ägg från stimulerade kvinnliga grodor och utföra in vitro-befruktning18,19.</li>
	<li>De-gelé de befruktade embryon med mild agitation för ca 5 min i 2% cystein i 1/3x modifierade Barths saltlösning (MBS; se receptet för 1X MBS nedan) på pH 819.</li>
	<li>Valfritt steg för live imaging: att fluorescerande märka specifika proteiner och observera deras dynamik i organoid, fortsätt till avsnitt 5.</li>
	<li>(Tillval) För att övervaka kontaminering av ytliga ektodermceller inom organoider, märk embryons apikala yta med NHS-rhodamin i stadium 914. Inkubera embryon i 1 mg/mL NHS-Rhodamin i 1/3x MBS (pH 9.0) i 30 min med mild nutation. Tvätta embryon tre gånger genom att överföra till en Petriskål fylld med 1/3x MBS i 15 min.</li>
	<li>Odla embryot i 1/3x MBS vid föredragen temperatur (14–26 °C) tills de första tecknen på steg 10 detekteras (dvs. utseendet på mörka pigmenterade celler runt blastopore vid vegetal vy).</li>
</ol>2. Beredning av mikrokirurgiska verktyg, lösningar, och kulturkärl
<ol><li>Förbered de verktyg som behövs inklusive ett par kirurgiska grade tlyckor och hårverktyg (hår slinga och hår kniv) för mikrokirurgi20.</li>
	<li>Förbered följande odlingsmedier för embryon: 1/3X MBS, där 1X MBS är tillverkad med NaCl (88 mM), KCl (1 mM), NaHCO3 (2,4 mM), MgSO4 (0,82 mM), Ca(NO3)2 (0,33 mM), CaCl2 (0,41 mM) och HEPES (10 mM). Justera pH till 7,4 med 10 M NaOH. OBS: Valfritt: tillsätt droppar fenol röd för att indikera pH.</li>
	<li>Bered följande odlingsmedia för embryonala vävnader och organoider: Danilchik's for Amy (DFA)21 kompletterad med färsk 1% antibiotika och antimykotisk lösning. Förbered DFA med NaCl (53 mM), Na2CO3 (5 mM), kaliumglukonat (4,5 mM), natriumglukonat (32 mM), CaCl2 (1 mM) och MgSO4 (1 mM). Justera pH till 8,3 med granulärt Bicine. Filter DFA (0,2 μm flask-top filter), alikvot och förvara den vid -20 °C.</li>
	<li>Förbered kalcium- och magnesiumfri DFA för att separera djupa celler från ektoderm genom att använda receptet ovan och utelämna CaCl2 och MgSO4. Aliquot och förvara vid-20 °C.</li>
	<li>Förbered icke-självhäftande PCR-rör för embryonal cellaggregering.<ol>
<li>För att inducera spontan aggregering av de isolerade embryonala cellerna, preparera icke-självhäftande PCR-rör genom beläggning av rundbottnad PCR-rör med 200 μL på 1% BSA (1 g BSA i 100 mL destillerat vatten) över natten vid 4 °C eller under 2 h vid rumstemperatur. Varje rör kommer att användas för att montera en organoid.</li>
		<li>Skölj BSA-belagd PCR-rör med DFA tre gånger för att avlägsna eventuella kvarvarande BSA.</li>
		<li>Fyll PCR-rör med 200 μL DFA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Isolering av djupa ektodermceller
<ol><li>Välj och samla embryon när de når tidigt stadium 10 med hjälp av hårverktyg under ett stereoscope.</li>
	<li>Med hjälp av en engångsöverföringspilett överför du de valda embryona till en DFA-fylld petriskål.</li>
	<li>Avlägsna embryonas vitellinemembran med hjälp av vassa trikrå från den vegetala sidan utan att störa embryots djursida. OBS: Var försiktig så att du undviker att utsätta embryon för luften. Att införa luftbubblor i lösningen eller föra embryon till ytan kommer att orsaka embryot att brista.</li>
	<li>För att isolera djurlocket, placera upp embryots djursida.</li>
	<li>Visuellt uppskatta omfattningen av det djurtak som ska strukits och göra det första snittet längs kanten av djurlocket med en hårkniv. Dra hårkniven utåt för att göra ett snitt.</li>
	<li>Upprepa steg 3.5 för att skapa en kedja av små nedskärningar till punktskattenivån djurtaket.</li>
	<li>Trimma den tjocka kanten av djurlocket med hjälp av en hårkniv för att förhindra införandet av mesoderm prekursorer. OBS: För att förhindra läkning och aggregering av isolerade djurkapsyler, fortsätt till nästa steg inom 10 min. Typiskt, vi isolera 5–10 djur mössor i taget för att montera flera organoider.</li>
	<li>För att separera djupa ektodermceller från djurlocket, överför de strukna djurkapsylarna till en Petriskål fylld med kalcium- och magnesiumfri DFA med en engångsöverföringspipett. Var försiktig så att du inte inför några luftbubblor under överföringen.</li>
	<li>För att hålla tillräckligt med utrymme för nästa steg, med hjälp av hårverktyg, placera djur mössor att möta djursidan upp och upprätthålla ett generöst avstånd från andra explants.</li>
	<li>Vänta i 5–10 min och övervaka sedan explanterna under ett stereoscope. När lossade djupa celler har hittats från kanten av den mörk-pigmenterade ytliga lagret, börja lyfta det ytliga lagret bort från de ljusa djupa ektoderm celler med hjälp av en hårkniv under stereoscope.</li>
	<li>Försiktigt lossa (peel-off) det ytliga lagret med en hårkniv, med början vid kanten.</li>
	<li>Samla de djupa ektodermcellerna med minsta aspiration (10\u201215 μL) för att begränsa mängden kalcium- och magnesiumfri DFA som överförs till aggregeringsmediet i nästa steg. OBS: Fristående ytliga celler kan avlägsnas från mediet för att förhindra att de återstående djupa ektodermcellerna förorenas.</li>
</ol>4. Generering av mucociliary epitelial organoider
<ol><li>Överför insamlade djup ektodermceller till ett icke-klister PCR-rör som innehåller 200 μL DFA. Försiktigt pipettera mediet (2\u20123 gånger) för att skingra överförda celler i PCR-röret. OBS: Den tidtagning som betecknas som timmar efter aggregering (hpa) startar vid detta steg. Storleken på de resulterande organoiderna styrs av antalet djupa ektodermceller som tillsätts till ett PCR-rör. Djupa ektodermceller från en eller flera djurkapslar kan användas, beroende på den önskade storleken på organoiden.</li>
	<li>Stäng PCR-röret. Håll PCR-rören upprätt för att framkalla spontan aggregering i botten.</li>
	<li>Övervaka aggregeringsprocessen under ett stereoscope. Celler samlas vanligtvis längst ned på PCR-röret inom en timme och samlas till sfäriska aggregat inom 2–3 h, beroende på storleken.</li>
	<li>För att genomföra live avbildning eller drogtester under utvecklingen av de mucociliary epitelial organoids, samla aggregat vid 2 hpa med hjälp av en 200 μL pipett försedd med förstorade tips (skuren med steriliserad sax) för att undvika att orsaka skador på aggregaten under insamling.</li>
	<li>För att låta aggregaten utvecklas till den mucociliary epitelial organoid i kultur, samla sfäriska aggregat från PCR röret på 5 hpa och överföra dem till en DFA-fylld Petriskål.</li>
	<li>Placera aggregaten långt ifrån andra för att hindra dem från att föra samman. Inom 24 h av kultur vid rumstemperatur utan några tillsatta faktorer, kan mogna mucociliary epitelial organoider observeras vara roterande med verkan att slå cilier som täcker ytan av differentierade epitel</li>
</ol>5. (Tillval) Högupplöst livebildande av utvecklande organoider
<ol><li>Förbered mRNA för mikroinjektion.<ol>
<li>För att visualisera epitelialiseringen som sker i det inledande skedet av organoidbildning, förbereda mRNA för epitel-specifika zonula occludens protein-1 (ZO-1) och för att beskriva cellmembranen genom att förstärka pCS2-ZO1-RFP och pCS2-mem-GFP plasmider (en gåva från Lance Davidson).</li>
		<li>Extrahera och linearisera plasmid DNA, och sedan transkribera den utjämnade mRNA med hjälp av en SP6/T7 in vitro transkription kit.</li>
		<li>Alikvotera det transkriberade mRNA och förvara det vid -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microinject mRNA till ett befruktat embryo<ol>
<li>Placera befruktade embryon i 3% Ficoll i 1x MBS.</li>
		<li>Ladda 3–4 μL mRNA med hjälp av en mikrolastarspets i en dragbar glasnål (en lång och fin avsmalnande nålspets med innerdiameter på 10\u201230 μm).</li>
		<li>Fäst nålen på en mikroinjektor och justera tid och tryck för att leverera en konstant volym av mRNA för mikroinjektion.</li>
		<li>Injicera mRNA precis under djurets apikala yta. En distinkt blek-färgad cirkulär patch som orsakas av expansionen av cortex är synlig vid tidpunkten för mikroinjektion.</li>
		<li>Överför de injicerade embryona till 1/3X MBS och odla dem till steg 9,5.</li>
		<li>Samla de fluorescerande märkta embryona under ett fluorescensstereoscope (exciterings-/emissionsinställningar för GFP (488/510) och RFP (532/588)).</li>
		<li>Fortsätt med steg 1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montera och odla organoiden (avsnitt 3 och 4) tills det önskade utvecklingsstadiet.</li>
	<li>Utför live avbildning.<ol>
<li>Förbered en avbildningskammare med glasbotten genom att limma ett täckglas till en specialmalt slipad akrylkammare med hjälp av kiselfett. OBS: Täta tätt kammaren för att förhindra läckage av odlingsmedierna.</li>
		<li>Fyll bildbehandlingskammaren med DFA.</li>
		<li>Välj en sexkantig transmissionelektronmikroskopi (TEM) rutnät (75 mesh) från en behållare med hjälp av tlyn och tillämpa en liten mängd fett till kanten av nätet. OBS: Storleken på nätet bör vara mindre än diametern på aggregatet så att aggregatet sitter på gallret.</li>
		<li>Tryck ned lätt för att säkra TEM-gallret till botten av bildbehandlingskammaren.</li>
		<li>Överför aggregaten till bildbehandlingskammaren och placera dem inom rutnätet. OBS: Undvik att positionera aggregaten bredvid fettet. Under hela experimentet bör aggregaten sitta på TEM-nätet utan att kontakta kammarens botten för att förhindra fysisk kompression.</li>
		<li>Fyll upp bildbehandlingskammaren med DFA och försegla den med ett täckglas och fett. OBS: Kammaren ska vara lufttät utan luftbubblor för att förhindra all turbulens eller rörelse under bildtagning.</li>
		<li>För att följa progressionen av mucociliary epitelial organoid bildning, samla in time-lapse z-stack bilder av aggregat (från 2 hpa) med hjälp av en konfokal mikroskop. OBS: Vi samlar vanligtvis ~ 120 μm-tjock z-stackar var 15 min med hjälp av en 20X målsättning att följa den dynamiska cellen beteenden, men dessa specifikationer bör optimeras för målet med experiment.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. (Valfritt) Bildbehandling utveckla organoider genom fixering och immunfärgning
<ol><li>Fixera organoider i önskat utvecklingsstadium genom att överföra dem till en glasflaska fylld med en fixativ lösning. OBS: Lägg till en volym fixativ lösning som är >20 gånger så stor som av proverna för att säkerställa fullständig fixering. Utför följande processer på en mutterdator om inget annat anges. I allmänhet är organoider fixerade med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Olika fixativ kan dock krävas för att upptäcka specifika proteiner. Till exempel använde vi 4% PFA med 0,25% glutaraldehyd i PBS för att upptäcka F-aktin och acetylerad tubulin. För att detektera intelectin (ITLN) och ZO-1, fixeras organoider med iskall Buckets lösning (4:1 metanol:dimetylsulfoxid) för över natten vid -20 °C. Buckets fasta organoider ska vara serieuttorkade före tvätt (steg 6.3). Varaktighet för antikroppsinkubation och tvättning kan optimeras för specifika behov.</li>
	<li>Fixera organoider i 15 min vid rumstemperatur (RT) eller över natten vid 4 °C.</li>
	<li>Tvätta 3 gånger med PBST (PBS med 0,1% Triton X-100) i 15 min vid RT.</li>
	<li>Block unspecific bindning med 10% get serum i PBST (PBSGT) för 1 h vid RT.</li>
	<li>Inkubera med primär antikropp (1:200) i PBSGT över natten vid 4 °C.</li>
	<li>Tvätta 3 gånger med PBST i 15 min vid RT.</li>
	<li>Inkubera med sekundär antikropp (1:200) i PBSGT över natten vid 4 °C.</li>
	<li>Tvätta 3 gånger med PBST i 15 min vid RT.</li>
	<li>Överför de fasta och immunstained organoiderna till en bildbehandlingskammare och fortsätt med confocal avbildning.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+organoids:+current+uses+and+future+promise.">Lung organoids: current uses and future promise.</a> Development. 144 (6), 986-997 (2017).</li><li>Puchelle, E., Zahm, J. M., Tournier, J. M., Coraux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+Epithelial+Repair,+Regeneration,+and+Remodeling+after+Injury+in+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease.">Airway Epithelial Repair, Regeneration, and Remodeling after Injury in Chronic Obstructive Pulmonary Disease.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 726-733 (2006).</li><li>Tilley, A. E., Walters, M. S., Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia+dysfunction+in+lung+disease.">Cilia dysfunction in lung disease.</a> Annual Review of Physiology. 77, 379-406 (2015).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airway+Epithelium:+Soldier+in+the+Fight+against+Respiratory+Viruses.">The Airway Epithelium: Soldier in the Fight against Respiratory Viruses.</a> Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).</li><li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium.">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li><li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling.">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).</li><li>Dubaissi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secretory+cell+type+develops+alongside+multiciliated+cells,+ionocytes+and+goblet+cells,+and+provides+a+protective,+anti-infective+function+in+the+frog+embryonic+mucociliary+epidermis.">A secretory cell type develops alongside multiciliated cells, ionocytes and goblet cells, and provides a protective, anti-infective function in the frog embryonic mucociliary epidermis.</a> Development. 141 (7), 1514-1525 (2014).</li><li>Hayes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+ciliogenesis+factors+using+a+new+in+vivo+model+for+mucociliary+epithelial+development.">Identification of novel ciliogenesis factors using a new in vivo model for mucociliary epithelial development.</a> Developmental Biology. 312 (1), 115-130 (2007).</li><li>Walentek, P., Quigley, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+can+learn+from+a+tadpole+about+ciliopathies+and+airway+diseases:+Using+systems+biology+in+Xenopus+to+study+cilia+and+mucociliary+epithelia.">What we can learn from a tadpole about ciliopathies and airway diseases: Using systems biology in Xenopus to study cilia and mucociliary epithelia.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Werner, M. E., Mitchell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+ciliated+epithelia:+The+power+of+Xenopus.">Understanding ciliated epithelia: The power of Xenopus.</a> Genesis. 50 (3), 176-185 (2012).</li><li>Dubaissi, E., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+frog+epidermis:+a+model+for+the+study+of+cell-cell+interactions+in+the+development+of+mucociliary+disease.">Embryonic frog epidermis: a model for the study of cell-cell interactions in the development of mucociliary disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 179-192 (2011).</li><li>Walentek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serotonin-secreting+cell+type+regulates+ciliary+motility+in+the+mucociliary+epidermis+of+Xenopus+tadpoles.">A novel serotonin-secreting cell type regulates ciliary motility in the mucociliary epidermis of Xenopus tadpoles.</a> Development. 141 (7), 1526-1533 (2014).</li><li>Asashima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organogenesis+from+undifferentiated+cells+in+Xenopus.">In vitro organogenesis from undifferentiated cells in Xenopus.</a> Developmental Dynamics. 238 (6), 1309-1320 (2009).</li><li>Kim, H. Y., Jackson, T. R., Stuckenholz, C., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+drives+regeneration+of+a+mucociliated+epidermis+on+the+surface+of+Xenopus+embryonic+aggregates.">Tissue mechanics drives regeneration of a mucociliated epidermis on the surface of Xenopus embryonic aggregates.</a> Nature Communications. 11 (1), 665 (2020).</li><li>Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeltaN-Tp63+Mediates+Wnt/beta-Catenin-Induced+Inhibition+of+Differentiation+in+Basal+Stem+Cells+of+Mucociliary+Epithelia.">DeltaN-Tp63 Mediates Wnt/beta-Catenin-Induced Inhibition of Differentiation in Basal Stem Cells of Mucociliary Epithelia.</a> Cell Reports. 28 (13), 3338-3352 (2019).</li><li>Green, J., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus and Zebrafish. , 1-13 (1999).</li><li>Stubbs, J. L., Davidson, L., Keller, R., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+intercalation+of+ciliated+cells+during+Xenopus+skin+development.">Radial intercalation of ciliated cells during Xenopus skin development.</a> Development. 133 (13), 2507-2515 (2006).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , (2000).</li><li>Joshi, S. D., Kim, H. Y., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+tools+for+quantifying+developmental+dynamics+in+Xenopus+embryos.">Microscopy tools for quantifying developmental dynamics in Xenopus embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 917, 477-493 (2012).</li><li>Sater, A. K., Steinhardt, R. A., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+neuronal+differentiation+by+planar+signals+in+Xenopus+embryos.">Induction of neuronal differentiation by planar signals in Xenopus embryos.</a> Developmental Dynamics. 197 (4), 268-280 (1993).</li><li>Sedzinski, J., Hannezo, E., Tu, F., Biro, M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+an+Apical+Epithelial+Cell+Surface+In+Vivo.">Emergence of an Apical Epithelial Cell Surface In Vivo.</a> Developmental Cell. 36 (1), 24-35 (2016).</li><li>Rock, J. R., Randell, S. H., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+basal+stem+cells:+a+perspective+on+their+roles+in+epithelial+homeostasis+and+remodeling.">Airway basal stem cells: a perspective on their roles in epithelial homeostasis and remodeling.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (9-10), 545-556 (2010).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Mucociliary epitelial organoider som genereras från djupa ektoderm celler av X. laevis embryo är ett kraftfullt verktyg för att studera epitelialization och differentiering av multipotenta progenitors in vitro. I motsats till den allmänt antagna djurmössanassay 16 används för in vitro organogenes13 och utvecklingen av mucociliary epithelia15,17,22 som utnyttjar intakt ektoderm, den djupa ektoderm-härledda organoider som presenteras i detta protokoll erbjuder en distinkt möjlighet att övervaka vävnadmekanik-driven regenerering faser av ytan epitel14. Vid omkring 2 hpa börjar de nygenererade ZO-1 positiva epitelcellerna (Figur 2) att dyka upp på den apikala ytan av organoider och öka deras befolkning för att täcka hela organoiden då vävnaden stelnar eller minskar efterlevnaden14. Regenereringen av epitelet och efterföljande lingsspecifikationer för slemproducerande biskceller fortsätter spontant i ett kemiskt definierat odlingsmedier inom en dag. Dessa snabbt utveckla mucociliary epitelial organoids ger en plattform för att undersöka dynamiska cell beteenden i realtid, i hög upplösning, under progressiva steg av epitelial regenerering. De möjliggör också utredning av grundläggande frågor som uppstår under mucociliary epitel utveckling, homeostas, och associerade sjukdomar2,9,23. I synnerhet kan den mekaniska känsligheten hos de djupa progenitorcellerna under övergången till epitelcellers prekursorer som identifieras i organoiderna14 tjäna till att länka luftvägssjukdomar som är associerade med onormal basal differentiering där slemsöndrar bingelceller är över- eller underproducerade23.
Medan detta protokoll erbjuder en enkel metod för att generera dessa organoider, Det finns flera kritiska steg för framgång i experiment. För att förhindra kontaminering av ytliga epitelceller under isoleringen av djupa ektodermceller från djurlocket bör man övervaka det djurlock som placerats i kalcium- och magnesiumfritt DFA under ett stereoskop och upptäcka rätt tid för att initiera separationen av det mörkpigmenterade ytliga skiktet av djurlocket. Om vävnaden hålls i kalcium- och magnesiumfri DFA för länge, kommer hela vävnaden att separera och skilja mellan djupa och ytliga celler skulle då vara omöjligt för djupa ektoderm aggregat. För att bekräfta frånvaron av ytliga celler i djupa ektoderm aggregat, rekommenderar vi fluorescerande märkning den apikala ytan av embryot med NHS-rhodamin (steg 1,414) före mikrokirurgi; detta skulle möjliggöra enkel identifiering av ytceller om de finns i de resulterande organoiderna. Eftersom epitelial regenerering regleras avvävnadsmekanik 14, är det viktigt att undvika oavsiktlig kraftgenerering för självorganiserande organoider. I synnerhet föreslår vi att undvika kontakt med glaset botten av bildbehandling kammaren under levande bildbehandling genom att placera aggregat vid kanterna av TEM rutnäten eftersom detta möjliggör fri kontakt med bildframställning fönster live aggregat (steg 5.1.2.). Detta in vitro-odlade, självorganiserade 3D-modell för mucociliary epitel kommer att fungera som ett tractable verktyg för att besvara de grundläggande frågor som uppstår under regenerering av epitel och härstamning specifikationen av bägare celler.

Skada, infektion, och sjukdom av mucociliary epitel är associerade med försämrad produktion och clearance av slem som ofta finns i lungsjukdomar såsom kronisk obstruktiv lungsjukdom, astma, cystisk fibros, bronkiektasier, och primära ciliary dyskinesi1,2,3,4. En nyligen framsteg i organoid teknik, till exempel, den basala cellen härledda lungorganoid kallas tracheosphere som rekapitulerar regenerering av mucociliary epitel uppstå som en lovande modell med terapeutisk potential1,5,6. Dess användning är dock för närvarande begränsad, delvis på grund av brist på de definierade odlingsförhållandena och låg effektivitet i organoidproduktioner. Mucociliary epitel i den mänskliga luftvägarna och groda epidermis är anmärkningsvärt lika i vävnad morfologi, cellulär sammansättning, och dessfunktion 7,8,9,10,11,12. I båda organismerna ger mucociliary epitel första linjens försvar genom att utsöndra slem och antimikrobiella ämnen och rensar skadliga partiklar och patogener genom synkroniserade verkan av cilier.
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att generera mucociliary epitelial organoids med hjälp av de multipotenta progenitors av Xenopus laevis embryon13,14. Tidigare rapporteradevi 14 att i avsaknad av exogena tillväxtfaktorer och den extracellulära matrisen, de microsurgically isolerade djupa celler från den tidiga gastrula skede ectoderm spontant montera i aggregat, regenerera epitel på dess yta och mogna till mucociliary epitel genom att intercalating multiciliated och andra tillbehör celler inom 24 h. Förutom den snabba utvecklingen erbjuder detta protokoll en tydlig möjlighet att direkt få tillgång till övergångar av multipotenta djupa ektodermceller till epitelfadercellsfaderner som rekapitulerar regenereringsstegen i ett stört epitel14 som inte är tillgängliga från intakta embryon och ektoderm (även känt som djurkapslar)15,16,17. Numrera och storleksanpassa av organoidsna som produceras, är scalable med kickeffektivitet, genom att kontrollera startmaterialen från Xenopus embryon. Organoider i flytande kultur kan enkelt sorteras och överföras på önskat stadium för ytterligare analyser, inklusive högupplöst bildbehandling, mekanisk testning, läkemedelsbehandling, och genetisk karakterisering14. Denna spontana, vävnad mekanik-driven regenerering av epitelet på ytan av embryonala cell aggregat resulterar i mucociliary epitelial organoids och ge en ny tredimensionell (3D) modell för att studera biologi mucociliary epitel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-stage Glass Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter microinjector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forcep</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair knife</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cg10-10vl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MBS solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10M Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide reagent grade, 97%, powder-25g</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>655104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dejellying solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide 10M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22mm Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>222321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA in vitro transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6/T7 in vitro transcription kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA microinjection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillary tubes</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC100-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf microloader pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube coating</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>SSI</td>
			<td>SSI-3245-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-milled acrylic chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 24mmX50mm</td>
			<td>Duran</td>
			<td>B01_001650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (50mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>275HGN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPI Hexagonal TEM Grids, Gilded Nickel (75mesh)</td>
			<td>SPI</td>
			<td>2775GN-XA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone grease</td>
			<td>Shinetsu</td>
			<td>HIVAC-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20ml screw top-cap vial</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>WH.986580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml screw top-cap vial</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sgima</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 10% EM GRADE</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraforlamdehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>LPS Solution</td>
			<td>CBP007B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody (1:200)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>clone 6-11B-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Itln1</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>11770-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1h5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZO1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>402200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-mem-GFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-ZO1-RFP</td>
			<td></td>
			<td>Gift from Dr. Lance Davidson</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mucociliary epithelial organoids from xenopus embryonic cells: generation, culture and high-resolution live imaging

Mucociliary epitel ger den första försvarslinjen genom att avlägsna främmande partiklar genom verkan av slem produktion och cilier-medierad clearance. Många kliniskt relevanta defekter i mucociliary epitel är härledas som de uppstår djupt inne i kroppen. Här introducerar vi en tractable 3D-modell för mucociliary epitel genereras från multipotenta progenitors som var microsurgically isolerade från Xenopus laevis embryon. Den mucociliary epitelial organoids är täckta med nyligen genererade epitel från djupa ektoderm celler och senare dekorerade med distinkt mönstrade multiciliated celler, sekretoriska celler och slem-producerande bökceller som är omöjlig att skilja från den inhemska epidermis inom 24 h. De fullständiga sekvenserna av dynamiska cellövergångar från mesenkymalt till epitelial som framträder på den apikala ytan av organoider kan spåras av högupplöst live imaging. Dessa in vitro odlade, självorganiserande mucociliary epitelial organoids erbjuder distinkta fördelar i att studera biologi mucociliary epitel med högeffektiv i generation, definierade odlingsförhållanden, kontroll över antal och storlek, och direkt tillgång för levande bildbehandling under regenerering av den differentierade epitel.

Detta standardiserade protokoll genererar en mucociliary epitelial organoid från multipotenta progenitors isolerade från den tidiga gastrula stadium X. laevis embryon inom 24 h av odling14. Samlade djupa ektodermceller självmontera för att bilda ett aggregat i ett icke-adhesivt PCR-rör och genomgår ytepitelisering och bingelcellsdifferentiering. Den nyligen epithelialiserade ytan av aggregat ger ett substrat som liknar det inhemska epitelet som finns in vivo för intercalating inre celler (t.ex., multiciliated och andra tillbehör celler) och utvecklar sig för att bilda mucociliary epitelial organoider (Figur 1A,B). Inom 24 h efter aggregering, självorganiserade mucociliary epitelial organoider regenerera en mogen epidermis som är omöjlig att skilja från epidermis av en grodyngel. De organoider omfattar helt differentierade epitel (keratin), slem-utsöndrar bingelceller (ITLN), multikronerade celler (acetylerad tubulin), och små sekretoriska celler (jordnöts agglutinin, PNA) (Figur 1C).
Förutom att bekräfta utvecklingen av olika celltyper med immunfärgning kan dynamiken i organoidutveckling följas av live-avbildning (Figur 2A). För att undersöka epitelialisering som framträder i ett tidigt skede av organoid bildning (Figur 1B), vi märkt embryon genom att uttrycka fluorescently taggade snäva junction proteiner (ZO-1-RFP) och membran lokalisera proteiner (mem-GFP). Med dubbelmärkning kan sekventiella stegen i ZO-1-positiv tät korsningsbildning markeras och analyseras kvantitativt under epitelisering (Bild 2). Till exempel, för celler (Figur 2B, grönfärgad) i olika stadier av epithelialisering (vid 0 min), vissa regioner av cell-cell adhesion har spridda puncta av ZO-1 (Figur 2B, gröna pilar). Däremot har andra områden helt monterade, sammanhängande ZO-1 uttryck (Figur 2B, gula pilar). Med tiden, den puncta smälter samman och ansluta till bilda sammanhängande snäva korsningar (Figur 2B, gröna pilar), och sammanhängande snäva korsningar behålla sin morfologi även under celldelning (Figur 2B, gula pilar). När de trånga korsningarna mognar rör sig cellerna dynamiskt in och ut från ytan längs de apikala planen på organoiderna (Figur 2C,D). Vidare, genom att spåra celler spatiotemporally på ytan av differentiering organoider (Figur 2B, färgkodade celler), multi-skala analys är möjlig, allt från enskilda puncta till sammanhängande snäva korsningar, cell-cell gränser, och underuppsättningar av cellpopulationer inom organoider.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig01.jpg"> Bild 1: Generering av mucociliary epitelial organoider. (A) Ett schematiskt som visar protokollet för att montera djupa ektoderm aggregat från X. laevis embryon. (B) En schematisk för en modell av mucociliary epitelial organoid bildning som härrör från multipotenta djupa ektoderm celler (tvärsnittsvy). Ytpositionerade celler transit till epitelceller och differentiera till bivatceller. Differentiera ciliated celler, sekretoriska celler, och jonocyter radiellt intercalate i ytan och regenerera en mogen epidermis. (C) Maximal z-projektion av mucociliary epitel immunostained for ITLN (slemproducerande bingelceller), acetylerad tubulin (ciliated cells), PNA (små sekretoriska celler), och keratin (epitelceller) i organoider vid 24 hpa (övre panel) och tadpole epidermis (nedre panelen). Skala bar = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig02.jpg"> Figur 2: Liveavbildning av utvecklande organoider. (A) En schematisk avbildningskammaren för levande organoider (inte skala). (B) Time-lapse sekvenser av confocal stacks samlas in från djupa ektoderm cell aggregat uttrycker ZO-1-RFP och mem-GFP från 2,5 hpa. Skalstång = 20 μm. Celler är pseudofärgade för spårning över tid. Grön-färgade cell har olika cell adhesion status, inklusive en successivt utveckla ZO-1 positiv vidhäftning (gröna pilar) och en upprätthålla sammanhängande ZO-1 positiv vidhäftning (gula pilar) över tiden. (C, D) Time-lapse confocal bilder av ZO-1-RFP-uttrycker djupa ektoderm cell aggregat visar radiellt intercalating celler flyttar till ytan (C, gul stjärna) och flytta inuti aggregaten (D, blå stjärna). Skalstång = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig02large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging at JoVE.com

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Vi beskriver ett enkelt protokoll för att utveckla mucociliary epitelial organoids från djupa ectoderm celler isolerade från Xenopus laevis embryon. De multipotenta progenitorerna regenererar epitelcellercellprekursorer och möjliggör livespårning av cellövergångarnas initiering och progression på ytan av organoider.

Mucociliary Epitelial Organoids från Xenopus embryonala celler: Generation, kultur och högupplösta Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Mucociliary epitel linjer inre organ i vår kropp och ger den första försvarslinjen genom att rensa främmande partiklar. Detta protokoll gör det möjligt att generera embryonala cellen härledd mucociliary epitelial organoid i 24 timmar. Den viktigaste fördelen med vår metod är att vi kan övervaka den levande utvecklingen av cellövergångar på ytan av organoider.Detta reproducerbara, skalbara och snabba protokoll för att utveckla organoid gör det möjligt för forskare att ta itu med grundläggande frågor för biologi mucociliary epitel. Till att börja med få X.Laevis embryon genom att manuellt samla ägg från stimulerade kvinnliga grodor och utföra in vitro-befruktning. De-gelé de befruktade embryon med mild agitation i 2%cystein, i en tredjedel X-modifierad Barths saltlösning i cirka fem minuter.Odla embryona i en tredjedel XMBS vid föredragna temperaturen tills de första tecknen på steg 10 upptäcks, såsom utseendet på mörka pigmenterade celler runt blastopore vid den vegetala vyn. Välj och samla embryon när de når tidigt stadium 10 med hjälp av hårverktyg under ett stereoscope. Överför de valda embryona till en DFA-fylld petriskål med en engångsöverföringspipett.Avlägsna sedan embryonas vitellinemembran med hjälp av vassa trikrå från vegetalsidan, utan att störa embryots djursida. För att isolera djurlocket, placera upp embryots djursida. Visuellt uppskatta omfattningen av det djurlock som skall strukits och göra det första snittet längs kanten med en hårkniv, dra kniven utåt för att göra snittet.Upprepa denna process för att skapa en kedja av små nedskärningar av punktskattenivån djurtaket. Trimma den tjocka kanten av djurlocket med hjälp av en hårkniv för att förhindra införandet av mesoderm prekursorer. För att separera djupa ektodermceller från djurlocket, överför de strukna djurkapsylarna till en petriskål fylld med kalcium och magnesiumfri DFA med en engångsöverföringspipett.Placera djurkapsyler för att möta djursidan upp, upprätthålla ett generöst avstånd från andra explants. Vänta i fem till tio minuter, och övervaka sedan explanterna under ett stereoskop. När de lossade djupa cellerna har släppts från kanten av det mörkpigmenterade ytliga lagret, börja lyfta det ytliga lagret bort från de ljusa djupa ektodermcellerna.Försiktigt lösgöra det ytliga lagret med en hårkniv, med början vid eggen. Samla sedan de djupa ektodermcellerna med så lite kalcium och magnesiumfri DFA som möjligt. Överför insamlade djupa ektodermceller till icke-självhäftande PCR-rör som innehåller 200 mikroliter av DFA och försiktigt pipettera mediet två till tre gånger för att skingra de överförda cellerna.Stäng rören och håll dem upprätt för att framkalla spontan aggregering i botten. Övervaka aggregeringsprocessen under ett stereomikroskop. Celler samlas vanligtvis längst ner på PCR-röret inom en timme och samlas i sfäriska aggregat inom två till tre timmar beroende på storleken.För att genomföra live imaging eller drogtester under utvecklingen av mucociliary epitelial organoider, samla aggregat på två timmar efter aggregering med hjälp av en 200 microliter pipetter utrustad med förstorade tips. För att låta aggregat utvecklas till mucociliary epitelial organoider i kultur, samla dem från PCR röret på fem timmar efter aggregering och överföra dem till en DFA-fylld Petri-skålen. Placera aggregaten långt ifrån varandra för att förhindra sammanfusning.Inom 24 timmar av kultur vid rumstemperatur, utan några tillsatta faktorer, kan mogna mucociliary epitelial organoider observeras roterande på grund av den svävande cilier som täcker ytan av differentierade epitel. Förbered en avbildningskammare med glasbotten genom att limma ett täckglas till en anpassad fräst akrylkammare med kiselfett, tätt försegla kammaren för att förhindra läckage av kulturmedierna och fyll sedan bildkammaren med DFA. Plocka upp en sexkantig transmissionelektronmikroskopi eller TEM-rutnät med hjälp av toftningar och applicera en liten mängd fett på kanten av nätet.Tryck ned lätt för att säkra TEM-gallret till botten av bildbehandlingskammaren. Överför aggregaten till bildbehandlingskammaren och placera dem inom rutnätet. Fyll kammaren med DFA och försegla den med ett täckglas och fett.För att följa progressionen av mucociliary epitelial organoid bildning, samla tidsfördärvade z-stack bilder av aggregat med hjälp av en konfokal mikroskop. Mucociliary epitelial organoids genererades från multipotenta progenitors av tidiga gastrula steg X.Laevis embryon. De organoider har en mogen epidermis som är omöjlig att skilja från den i en grodyngel inklusive en fullt differentierad epitel, slem utsöndrar bingceller, multiciliated celler och små sekretoriska celler.Dynamiken i organoid utveckling följdes av levande bildbehandling. För att undersöka epitelialisering som framträder i ett tidigt skede av organoid bildas, var embryona märkt med fluorescently taggade snäva junction proteiner och membran lokalisera proteiner. Med dubbla märkning de sekventiella stegen i ZO-1 positiva snäva korsningen formation kan markeras och analyseras kvantitativt under epithelialization.Vissa regioner av cell-cell adhesion har spridda puncta av ZO-1 i olika stadier av epithelialization. Däremot har andra områden helt sammansatt sammanhängande ZO-1 uttryck. Med tiden puncta smälter samman och ansluta till angränsande snäva korsningar, som behåller sin morfologi även under celldelning.När de snäva korsningarna mognar rör sig cellerna dynamiskt in och ut ur ytan längs organoids apikala plan. Multi-skala analys är möjligt genom att spåra celler spatio-temporally på ytan av differentiering organoider. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att sätta den mörk-pigmenterad sida av isolera djurlocket vänd uppåt och övervaka den under ett stereoscope.Det är kritiskt att separera det ytliga lagret av djurlocket vid rätt tidpunkt i kalcium / magnesium fria DFA media. Detta enkla protokoll erbjuder praktiska sätt att studera dynamiska cellbeteenden samt de molekylära och fysiska mekanismer som reglerar mucociliary epitel.

Research

JoVE Journal

Biology

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal cellkulturer från Aplysia för högupplöst avbildning av tillväxt Kottar

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Kultur och underhåll av mänskliga embryonala stamcellslinjer

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Live avbildning av Drosophila melanogaster Embryonala Hemocyte Flyttningar

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging och kvantitativ analys av embryonala epitelceller i Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolering och odling av celler från Nefrogen Zonen av embryonala Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolering och odling av vuxna Epithelial stamceller från mänskliga Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...