Name: a neonatal imaging model of gram-negative bacterial sepsis
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi istituzionali a C.M.R.

Tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali della Virginia Occidentale e condotte in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio da parte del Consiglio Nazionale delleRicerche 18.
1. Preparazione dell'inoculo batterico
<ol><li>Striare una piastra di agar di soia triptica (TSA) con un anello inoculato per l'isolamento di una singola colonia da uno stock congelat...

<ol>
	<li>Qazi, S. A., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+sepsis:+a+major+global+public+health+challenge.">Neonatal sepsis: a major global public health challenge.</a> Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).</li><li>Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-onset+neonatal+sepsis.">Early-onset neonatal sepsis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).</li><li>Seman, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+onset+neonatal+sepsis:+the+burden+of+group+B+Streptococcal+and+E.+coli+disease+continues.">Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues.</a> Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).</li><li>Weston, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+invasive+early-onset+neonatal+sepsis+in+the+United+States,+2005-2008.">The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008.</a> Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).</li><li>Hornik, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+and+late+onset+sepsis+in+very-low-birth-weight+infants+from+a+large+group+of+neonatal+intensive+care+units.">Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units.</a> Early Human Development. , 69 (2012).</li><li>Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+sepsis:+an+international+perspective.">Neonatal sepsis: an international perspective.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).</li><li>Kraft, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+macrophages+express+elevated+levels+of+interleukin-27+that+oppose+immune+responses.">Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses.</a> Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).</li><li>Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+in+neonates.">Immune responses in neonates.</a> Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).</li><li>Gleave Parson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+myeloid-derived+suppressor+cells+are+a+source+of+elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+and+compromise+control+of+bacterial+infection.">Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection.</a> Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).</li><li>Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+adaptive+immunity+comes+of+age.">Neonatal adaptive immunity comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).</li><li>Kim, S. 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I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+of+Tumor+Cell+Motility+in+the+Tumor+Microenvironment+Context.">Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context.</a> Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).</li><li>Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+new+insights+into+metastasis+of+tumors.">Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors.</a> Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).</li><li>Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Imaging+Reveals+Novel+Patterns+of+Colonization+and+Invasion+in+Systemic+Escherichia+coli+K1+Experimental+Infection+in+the+Neonatal+Rat.">Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat.</a> Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-alpha+inhibitor+protein+administration+improves+survival+from+neonatal+sepsis+in+mice.">Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice.</a> Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).</li><li>Pluschke, G., Pelkonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+factors+in+the+resistance+of+newborn+mice+to+K1+Escherichia+coli+infection.">Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection.</a> Microb. Patho. , 93-102 (1988).</li><li>Mancuso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interleukin+12+in+experimental+neonatal+sepsis+caused+by+group+B+streptococci.">Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci.</a> Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).</li><li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus.">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li><li>Andrade, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR2-induced+IL-10+production+impairs+neutrophil+recruitment+to+infected+tissues+during+neonatal+bacterial+sepsis.">TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis.</a> Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).</li></ol>

Il nostro modello di infezione subscapulare per indurre sepsi batterica nei topi neonatale è un nuovo metodo per studiare la diffusione longitudinale degli agenti patogeni batterici in tempo reale. L'imaging intravitale offre l'opportunità di esplorare la diffusione batterica in tempo reale nei neonati. Questo è fondamentale per comprendere la cinetica della diffusione batterica e per studiare ulteriormente la risposta e il danno dell'ospite nella fase appropriata della malattia. Ai cuccioli di topo viene somministrat...

La sepsi batterica è una preoccupazione significativa per i neonati che mostrano un profilo immunitario unico nei primi giorni di vita che non fornisce un'adeguata protezione dall'infezione1. La sepsi neonatale continua ad essere un problema sanitario significativo negli Stati Uniti, rappresentando oltre 75.000 casi all'anno solo negli StatiUniti 2. Per studiare queste infezioni in profondità, sono necessari nuovi modelli animali che ricapitolano aspetti della malattia umana. Abbiamo stabilito un modello di infezione neonatale del topo utilizzando Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli è la seconda causa principale di sepsi neonatale negli Stati Uniti, ma responsabile della maggior parte della mortalità associata alla sepsi4,5. Tuttavia, è la causa principale quando i bambini pre-termine e molto bassi di peso alla nascita (VLBW) sono considerati indipendentemente5. Il sierotipo K1 è più frequentemente associato a infezioni invasive del flusso sanguigno e meningite nei neonati6,7. Attualmente, non ci sono altre opzioni di trattamento oltre agli antibiotici e alle cure di supporto. Nel frattempo, i tassi di resistenza agli antibiotici continuano ad aumentare per molti batteri patogeni, con alcuni ceppi di E. coli resistenti a una moltitudine di antibiotici comunemente usati nel trattamento8. Pertanto, è imperativo continuare a generare metodi per studiare i meccanismi della sepsi e la risposta dell'ospite nei neonati. Questi risultati possono aiutare a migliorare i trattamenti attuali e gli esiti delle infezioni.
Lo stato immunitario dei neonati è caratterizzato da differenze fenotipiche e funzionali rispetto agli adulti. Ad esempio, elevati livelli di citochine antinfiammatorie e regolatorie, come l'interleuchina (IL)-10 e l'IL-27, hanno dimostrato di essere prodotti da macrofagi derivati dal sangue del cordone ombelicale e sono presenti a livelli maggiori nel siero dei neonati murini9,10,11. Ciò è coerente con i livelli più bassi di IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 e TNF-α che sono frequentemente segnalati dalle cellule neonatale rispetto alle controparti adulte10. Inoltre, il sistema immunitario neonatale è inclinato verso una risposta cellulare T Th2 e regolatore rispetto agli adulti12. Un numero elevato di neutrofili, cellule T, cellule B, cellule NK e monociti sono presenti anche nei neonati, ma con notevoli compromissioni funzionali. Ciò include difetti nell'espressione dei marcatori di superficie cellulare e presentazione dell'antigene che suggeriscono immaturità13,14,15. Inoltre, i neutrofili neonatale sono significativamente carenti nella loro capacità di migrare a fattori chemiotattici16. Le cellule soppressori derivate da mieloidi (MSC) si trovano anche a livelli elevati nei neonati e recentemente hanno dimostrato di essere una fonte di IL-2711. Gli MSM sono altamente soppressivi nei confronti delle celleT 17. Collettivamente, questi dati dimostrano limitazioni nell'immunità neonatale che conferiscono una maggiore suscettibilità alle infezioni.
Per studiare la progressione del carico batterico e sezionare le risposte immunitarie protettive dell'ospite durante la sepsi neonatale, abbiamo sviluppato un nuovo modello di infezione. Topi neonatale a giorni 3-4 di vita sono difficili da iniettare nello spazio intraperitoneale o nella vena della coda. Nel nostro modello, ai cuccioli del giorno 3 o 4 viene somministrato l'inoculo batterico o pbs per via sottocutanea nella regione scapolare. Un'infezione sistemica si sviluppa e utilizzando luminescente E. coli O1:K1:H7, possiamo immaginare longitudinalmente singoli topi neonatale per seguire il carico batterico diffuso nei tessuti periferici. Questo è il primo modello segnalato ad utilizzare l'imaging intravitale per comprendere la cinetica della diffusione dei batteri durante la sepsi nei neonati murini3.
Qui descriviamo un protocollo per indurre infezioni settiche di E. coli nei topi neonatale3. Descriviamo come preparare l'inoculo batterico per l'iniezione e come raccogliere il tessuto per la valutazione della patologia, la misurazione dei marcatori infiammatori mediante l'analisi dell'espressione genica e l'enumerazione del carico batterico. Inoltre, viene descritto anche l'uso di E. coli luminescente per l'imaging intravitale di neonati infetti e la quantificazione dell'uccisione batterica da parte delle cellule immunitarie neonatale. Questi protocolli possono anche essere adattati per studiare altre importanti infezioni batteriche nei neonati. I dati qui presentati rappresentano un nuovo approccio generale alla comprensione della dinamica dell'infezione in un modello di sepsi neonatale traducibile.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>Inoculum or PBS injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td>Histopathology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LSA1049201</td>
			<td>Bacterial clearance assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Tattoo Ink Paste</td>
			<td>Ketchum</td>
			<td>KI1482039</td>
			<td>Animal identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Tattoo Ink Green Paste</td>
			<td>Ketchum</td>
			<td>KI1471039</td>
			<td>Animal identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly-6B.2 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-781</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>11775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Constructed in-house at WVU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit</td>
			<td>Omega Bio-tek</td>
			<td>R6812</td>
			<td>RNA extration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>236950</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Cytokine expression qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Cytokine expression qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708860</td>
			<td>Real-time quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bacterial clearance assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Intravital imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYstrainer (Nylon Basket)</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542 040</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Pestle Motor</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6HAZ6</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Pellet Pestles</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6HAY5</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Thermal Cycler</td>
			<td>Techne</td>
			<td>3PRIMEBASE/02</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Cytokine expression qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriReagent (GTCP)</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>RNA extration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a neonatal imaging model of gram-negative bacterial sepsis

I neonati sono a maggior rischio di sepsi batterica a causa del profilo immunitario unico che mostrano nei primi mesi di vita. Abbiamo stabilito un protocollo per lo studio della patogenesi di E. coli O1:K1:H7, un sierotipo responsabile degli alti tassi di mortalità nei neonati. Il nostro metodo utilizza l'imaging intravitale dei cuccioli neonatale in diversi punti di tempo durante la progressione dell'infezione. Questa imaging, parallela alla misurazione dei batteri nel sangue, al profilo infiammatorio e all'istopatologia tissutale, significa un approccio rigoroso alla comprensione della dinamica dell'infezione durante la sepsi. Nell'attuale relazione, modelliamo due inoculi infettivi per il confronto dei fardelli batterici e della gravità della malattia. Scopriamo che l'infezione subscapulare porta alla diffusione dell'infezione da 10 h dopo l'infezione. A 24 ore, l'infezione da E. coli luminescente era abbondante nel sangue, nei polmoni e in altri tessuti periferici. L'espressione delle citochine infiammatorie nei polmoni è significativa a 24 ore, e questo è seguito da infiltrazioni cellulari e prove di danni ai tessuti che aumentano con la dose infettiva. L'imaging intravitale ha alcune limitazioni. Ciò include una soglia del segnale luminescente e alcune complicazioni che possono insorgere con i neonati durante l'anestesia. Nonostante alcune limitazioni, scopriamo che il nostro modello di infezione offre una visione per comprendere la dinamica dell'infezione longitudinale durante la sepsi murina neonatale, che non è stata esaminata a fondo fino ad oggi. Ci aspettiamo che questo modello possa anche essere adattato per studiare altre infezioni batteriche critiche durante la prima infanzia.

Questo protocollo ha indotto la sepsi batterica nei topi neonatale e abbiamo usato l'imaging intravitale longitudinale, l'enumerazione dei batteri nel sangue, le valutazioni istologiche della patologia e i profili di espressione della citochina infiammatoria per studiare il decorso della malattia. Segni di morbilità sono stati osservati nei cuccioli neonatale infettati sia da inoculi bassi (~2 x10 6 CFU) che alti (~7 x10 6 CFU) di E.coli nel tempo. I cuccioli che hanno ricevuto il maggiore...

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A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

L'infezione di topi neonatale con bioluminescente E. coli O1:K1:H7 provoca un'infezione settica con significativa infiammazione polmonare e patologia polmonare. Qui descriviamo le procedure per modellare e studiare ulteriormente la sepsi neonatale utilizzando l'imaging intravitale longitudinale in parallelo con l'enumerazione dei fardelli batterici sistemici, la profilazione infiammatoria e l'istopatologia polmonare.

Un modello di imaging neonatale di sepsi batterica gram-negativa

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Il nostro protocollo consente la diffusione batterica e il monitoraggio degli oneri in un modello sperimentale di sepsi neonatale in tempo reale e la capacità di correlare altri marcatori di malattia con il carico patogeno. Questo protocollo ci consente di analizzare longitudinalmente la sepsi nei singoli topi neonatali, offrendo l'opportunità di osservare e confrontare le dinamiche di infezione e la diffusione batterica in tempo reale. Con questo metodo è possibile eseguire test preclinici di interventi per sepsi neonatale, consentendo il monitoraggio degli effetti del controllo ospite dei batteri.Inizia posizionando cuccioli abbinati all'età in gruppi di cucciolate ad alta o bassa dose all'interno di un armadio di livello due di biosicurezza. Il terzo o quarto giorno postnatale, registrare i pesi di tutti i cuccioli prima dell'inoculazione. Caricare siringhe per insulina con PBS o l'inoculo E.coli lux ad alta o bassa dose nell'armadio della biosicurezza e posizionare le siringhe caricate sul ghiaccio.Posizionare il neonato da iniettare su una superficie pulita all'interno dell'armadio di biosicurezza e sollevare la pelle sulla nuca come per scruffare il cucciolo. Inserire l'ago smussato appena sotto la pelle nello spazio creato tra la pelle e il muscolo. Quando l'ago può essere sentito sotto la pelle, iniettare 50 microlitri dell'inoculante rilasciando contemporaneamente la porzione pizzicata della pelle per prevenire il riflusso, quindi rimuovere l'ago lentamente e con cura.Quando tutti i cuccioli sono stati iniettati nello stesso modo, riportare i cuccioli alle loro dighe. Immediatamente dopo l'iniezione e nei punti di tempo sperimentali appropriati in seguito, posizionare la gabbia con topi neonatali infetti da E.coli lux e diga in una cappa di flusso laminare di livello biosicurezza due e aprire il software nel micro computer CT. Dopo aver inizializzato il sistema e aver atteso che la temperatura dello stadio si blocchi a 37 gradi Celsius e la temperatura ccd si blocchi a -90 gradi Celsius, posizionare fino a quattro cuccioli anestetizzati sulla scatola di imaging nella camera di imaging nella posizione prona.Chiudere la porta della camera di imaging e selezionare l'opzione di imaging a luminescenza. Selezionare il filtro aperto e successivo e impostare il filtro di eccitazione da bloccare e il filtro di emissione da aprire. Selezionare 500, 520, 560, 580, 600 e 620 nanometri.Quindi immagini i cuccioli prima di restituirli alla gabbia con la diga con monitoraggio fino al recupero dell'anestesia. All'endpoint sperimentale appropriato, in un armadio di biosicurezza, utilizzare il neonato eutanasiato con 70%etanolo per prevenire la contaminazione e posizionare l'animale sul lato destro. Utilizzare le forcep per afferrare la pelle tra l'addome e la gamba sinistra posteriore e utilizzare forbici chirurgiche a punta fine per fare un'incisione cutanea.Quindi continuare l'incisione verso la parte posteriore dell'animale fino a quando l'intera milza è esposta. Utilizzare le forcep e le forbici per rimuovere la milza dall'addome e posizionarla nella soluzione appropriata per la sua applicazione a valle. Per ottenere i polmoni, sbucciare completamente la pelle del torace ed entrare alla base dello sterno con le forbici tenute verticalmente, tagliare verso l'alto fino a quando la gabbia toracica non viene divisa.Utilizzare le forcep per afferrare singolarmente i polmoni destro e sinistro e rimuovere i polmoni dalla cavità toracica. Rimuovere il cuore dal tessuto polmonare con le forbici. Quindi posizionare il polmone nella soluzione appropriata per la sua applicazione a valle.Per eseguire un saggio di uccisione batterica in vitro, posizionare la milza non infetta in un colino di nylon da 40 micrometri all'interno di una piastra di Petri sterile da 60 millimetri contenente cinque millilitri di PBS integrati con siero bovino fetale al 10% e utilizzare uno stantuffo sterile a tre millilitri per disaggregare il tessuto in una singola sospensione cellulare. Trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e raccoglierle per centrifugazione. Rimescolare il pellet in un millilitro di tampone dilisi dei globuli rossi per tre o quattro milza.Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare le milza in PBS e rimescolare il pellet in 250 microlitri di PBS integrati con albumina di siero bovino e due EDTA millimolare per il conteggio. Successivamente, isolare le cellule positive Ly6 B2 con le perline immunomagnetiche appropriate secondo il protocollo del produttore e seminare le cellule positive Ly6 B2 arricchite a una volta 10 alle cinque cellule per 100 microlitri di media completa per densità di pozzo in una piastra nera o bianca da 96 po '. Preparare l'inoculo batterico alla molteplicità desiderata di infezione in un volume finale di 100 microlitri per pozzo e aggiungere 100 microlitri di inoculo batterico o mezzo da solo a ciascun pozzo per un'incubazione di un'ora nell'incubatore di coltura cellulare.Al termine dell'incubazione, sostituire il mezzo con 200 microlitri di mezzo fresco completo integrato con 100 microgrammi per millilitro di gentamicina per rimuovere eventuali batteri extracellulari rimanenti e riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per altre due ore. Alla fine dell'incubazione e in ogni momento sperimentale successivo, utilizzare un lettore di piastre per misurare la luminescenza in ogni pozzo della piastra di coltura lidded prima di restituire la piastra all'incubatore di coltura cellulare fino alla lettura successiva. Mentre la maggior parte degli animali mostra alti livelli di batteri nel sangue a 24 ore dopo l'infezione, alcuni cuccioli hanno batteri bassi o non rilevabili nel sangue, suggerendo la clearance dell'infezione entro questo momento.Inoltre, le cellule spleniche positive Ly6 B2 neonatale infettate da E.coli bioluminescente per un'ora prima della rimozione dei batteri extracellulari e del successivo trattamento con gentamicina hanno espresso un alto livello di luminescenza a tre ore che diminuisce nel tempo indicativo di clearance batterico. L'imaging animale vivo dei batteri luminescenti conferma ulteriormente l'aumento della diffusione e della crescita batterica dei cuccioli neonatale nel tempo a 10 e 24 ore dopo l'infezione. L'imaging intravitale in combinazione con la microTC facilita l'identificazione dei focolai di infezione all'interno del cervello, dei polmoni e di altri tessuti periferici.I polmoni di alcuni topi altamente infetti dimostrano regioni opache coerenti con il consolidamento infiammatorio che co-localizzato a segnali batterici luminescenti. Queste regioni di presunto essudato infiammatorio non sono osservate nei polmoni di controllo non infetti. Un aumento significativo dell'espressione infiammatoria della citochina rispetto ai controlli si osserva anche in gruppi di inoculo bassi e alti, correlando con un notevole ispessimento della parete alveolare, aumento dell'emorragia alveolare e infiltrazione infiammatoria in questi animali.Le cose più importanti da ricordare sono eseguire una tecnica corretta quando si eseguono le iniezioni e prestare una rigorosa attenzione ai neonati quando si somministra l'anestesia. Utilizzando questa tecnica, possiamo visualizzare la sepsi neonatale in tempo reale per studiare interventi e ospitare terapie dirette volte a migliorare la risposta immunitaria.

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