Name: a neonatal imaging model of gram-negative bacterial sepsis
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis at JoVE.com

Bu çalışma Kurumsal Fonlar tarafından C.M.R.'ye destek ve.M.

Tüm prosedürler West Virginia Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Araştırma Konseyi18tarafından Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun tavsiyeleri doğrultusunda yürütülmüştür.
1. Bakteriyel Inokül Hazırlanması
<ol><li>Streak bir Tryptic soya agar (TSA) e. coli O1:K1:H7-lux bir dondurucu stok tek bir koloni izolasyon için bir aşılama döngü ile plaka bu stiferase i...

<ol>
	<li>Qazi, S. A., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+sepsis:+a+major+global+public+health+challenge.">Neonatal sepsis: a major global public health challenge.</a> Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).</li><li>Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early-onset+neonatal+sepsis.">Early-onset neonatal sepsis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).</li><li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+compromise+protective+immunity+in+a+mouse+model+of+Gram-negative+neonatal+sepsis.">Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis.</a> Infections and Immunity. , (2019).</li><li>Schrag, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Invasive+Early-Onset+Neonatal+Sepsis,+2005+to+2014.">Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014.</a> Pediatrics. 138 (6), 20162013 (2016).</li><li>Stoll, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+onset+neonatal+sepsis:+the+burden+of+group+B+Streptococcal+and+E.+coli+disease+continues.">Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues.</a> Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).</li><li>Weston, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+invasive+early-onset+neonatal+sepsis+in+the+United+States,+2005-2008.">The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008.</a> Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).</li><li>Hornik, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+and+late+onset+sepsis+in+very-low-birth-weight+infants+from+a+large+group+of+neonatal+intensive+care+units.">Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units.</a> Early Human Development. , 69 (2012).</li><li>Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+sepsis:+an+international+perspective.">Neonatal sepsis: an international perspective.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).</li><li>Kraft, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+macrophages+express+elevated+levels+of+interleukin-27+that+oppose+immune+responses.">Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses.</a> Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).</li><li>Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+in+neonates.">Immune responses in neonates.</a> Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).</li><li>Gleave Parson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+myeloid-derived+suppressor+cells+are+a+source+of+elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+and+compromise+control+of+bacterial+infection.">Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection.</a> Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).</li><li>Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+adaptive+immunity+comes+of+age.">Neonatal adaptive immunity comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).</li><li>Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+L-selectin+and+CD11b+on+neutrophils+of+adults+and+neonates+during+the+first+month+of+life.">Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life.</a> Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).</li><li>Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+antigen-presenting+cell+function+in+human+neonates.">Defective antigen-presenting cell function in human neonates.</a> Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).</li><li>Le Garff-Tavernier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+display+major+phenotypic+and+functional+changes+over+the+life+span.">Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span.</a> Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).</li><li>Weinberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+reduced+responsiveness+of+neonatal+neutrophils+to+distinct+chemoattractants.">Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants.</a> Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).</li><li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system.">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Imaging+of+Tumor+Cell+Motility+in+the+Tumor+Microenvironment+Context.">Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context.</a> Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).</li><li>Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+new+insights+into+metastasis+of+tumors.">Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors.</a> Journal of Cell Science. 124, 299-310 (2011).</li><li>Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescent+Imaging+Reveals+Novel+Patterns+of+Colonization+and+Invasion+in+Systemic+Escherichia+coli+K1+Experimental+Infection+in+the+Neonatal+Rat.">Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat.</a> Infection and Immunity. 83 (12), 4528 (2015).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-alpha+inhibitor+protein+administration+improves+survival+from+neonatal+sepsis+in+mice.">Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice.</a> Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).</li><li>Pluschke, G., Pelkonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+factors+in+the+resistance+of+newborn+mice+to+K1+Escherichia+coli+infection.">Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection.</a> Microb. Patho. , 93-102 (1988).</li><li>Mancuso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interleukin+12+in+experimental+neonatal+sepsis+caused+by+group+B+streptococci.">Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci.</a> Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).</li><li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus.">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li><li>Andrade, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR2-induced+IL-10+production+impairs+neutrophil+recruitment+to+infected+tissues+during+neonatal+bacterial+sepsis.">TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis.</a> Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).</li></ol>

Neonatal farelerde bakteriyel sepsisi indükleyen subskapular enfeksiyon modelimiz, bakteriyel patojenlerin uzunlamasına yayılmasını gerçek zamanlı olarak incelemek için yeni bir yöntemdir. İntravital görüntüleme, bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak yenini keşfetme fırsatı sağlar. Bu bakteriyel yayma kinetik anlamak ve daha fazla hastalığın uygun aşamasında konak yanıt ve hasar çalışma için önemlidir. Fare yavrularına bakteriyel inokülin subskapular enjeksiyonu deri altı, subskapu...

Bakteriyel sepsisenfeksiyonakarşı yeterli koruma sağlamaz yaşamın ilk günlerinde benzersiz bir bağışıklık profili sergileyen yeniler için önemli bir endişe 1 . Yenidoğan sepsis önemli bir ABD sağlık sorunu sadeceABD'deyılda 75.000 'den fazla vaka için muhasebe olmaya devam ediyor 2 . Bu enfeksiyonları derinlemesine incelemek için, insan hastalığının yönlerini özetleyen yeni hayvan modelleri gereklidir. Biz Escherichia colikullanarak bir neonatal fare enfeksiyonu modeli kurduk , O1:K1:H73. E. coli ABD'de yenidoğan sepsisin ikinci önde gelen nedenidir, ancak sepsis ilişkili mortalite çoğunluğu sorumlu4,5. Ancak, ön dönem ve çok düşük doğum ağırlığı (VLBW) bebekler bağımsızolarak5 olarak kabul edildiğinde önde gelen nedenidir. K1 serotipi en sık invaziv kan dolaşımı enfeksiyonları ve menenjit ile ilişkilidir6,7. Şu anda, antibiyotik ve destekleyici bakım dışında başka bir tedavi seçeneği vardır. Bu arada, antibiyotik direnci oranları birçok patojenik bakteriler için artmaya devam, E. coli bazı suşları ile yaygın tedavide kullanılan antibiyotik çok sayıda dirençli8. Bu nedenle, sepsis ve ev sahibi tepki mekanizmalarını yeniler üzerinde incelemek için yöntemler üretmeye devam etmek zorunludur. Bu sonuçlar mevcut tedaviler ve enfeksiyon sonuçları üzerine geliştirmek için yardımcı olabilir.
Neonatların bağışıklık durumu yetişkinlere göre hem henotibik hem de fonksiyonel farklılıklar ile karakterizedir. Örneğin, interlökin (IL)-10 ve IL-27 gibi anti-inflamatuar ve düzenleyici sitokinlerin yüksek seviyeleri, kordon kanı kaynaklı makrofajlar tarafından üretildiği gösterilmiştir ve9,10,11. Bu, yenidoğan hücrelerinden erişkin retlere göre sıklıkla bildirilen IFN-α, IFN-on, IL-12 ve TNF-α düzeylerinin daha düşük olması ile tutarlıdır10. Ayrıca, neonatal bağışıklık sistemi yetişkinlere göre bir Th2 ve düzenleyici T hücre yanıtı doğru çarpık12. Nötrofil, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve monositlerin yüksek sayıda da neonatlarda mevcuttur, ancak önemli fonksiyonel bozukluklar ile. Bu hücre yüzey belirteçleri ve immaturity13,14,15öneririz antijen sunumu ifade kusurları içerir. Ayrıca, neonatal nötrofiller kemotaktik faktörlere göç etme kabiliyetlerinde önemli ölçüde eksiktir16. Miyeloid türetilmiş baskılayıcı hücreler (MKHK) da neonatlarda yüksek seviyelerde bulunur ve son zamanlarda IL-2711kaynağı olarak gösterilmiştir. MKh'ler T hücrelerine karşı son derece bastırıcıdır17. Bu veriler, yenidoğan bağışıklığında enfeksiyona karşı duyarlılığın artmasına neden olan sınırlamaları toplu olarak göstermektedir.
Neonatal sepsis sırasında bakteriyel yükün ilerlemesini incelemek ve koruyucu konak immün yanıtlarını incelemek için yeni bir enfeksiyon modeli geliştirdik. Yaşamın 3-4 gününde yenidoğan farelerin intraperitoneal uzaya veya kuyruk damarına enjekte etmesi zordur. Bizim modelinde, gün 3 veya 4 yavru skapular bölgeye bakteriyel inoculum veya PBS subkutan olarak uygulanır. Sistemik bir enfeksiyon gelişir ve lüminesanE E. coli O1:K1:H7 kullanarak, periferik dokularda yayılan bakteriyel yükü takip etmek için tek tek yenidoğan farelerini boylamsal olarak görüntüleyebiliriz. Bu, intravital görüntülemeyi kullanarak sepsis sırasında bakterilerin yayılmasının kinetiklerini anlamak için kullanılan ilk rapor edilen modeldir3.
Burada, yenidoğan farelerde septik E. coli enfeksiyonları neden bir protokol tarif3. Bakteriyel inokülün enjeksiyoniçin nasıl hazırlanacağını ve patolojinin değerlendirilmesi için dokunun nasıl hasat edilebildiğini, gen ekspresyonu analizi ile inflamatuar belirteçlerin ölçülmesini ve bakteri yükünün numaralandırmasını anlatıyoruz. Buna ek olarak, enfekte yenidoğan yenidoğanların intravital görüntüleme ve neonatal bağışıklık hücreleri tarafından bakteri öldürme niceliksel için lüminesan E. coli kullanımı da açıklanmıştır. Bu protokoller aynı zamanda yeniniler diğer önemli bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir. Burada sunulan veriler, translatable neonatal sepsis modelinde enfeksiyon dinamiklerini anlamak için genel bir yeni yaklaşımı temsil etmektedir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Insulin Syringe</td>
			<td>Coviden</td>
			<td>1188128012</td>
			<td>Inoculum or PBS injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td>Histopathology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LSA1049201</td>
			<td>Bacterial clearance assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Tattoo Ink Paste</td>
			<td>Ketchum</td>
			<td>KI1482039</td>
			<td>Animal identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Tattoo Ink Green Paste</td>
			<td>Ketchum</td>
			<td>KI1471039</td>
			<td>Animal identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly-6B.2 Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-100-781</td>
			<td>Cell isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>11775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Constructed in-house at WVU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit</td>
			<td>Omega Bio-tek</td>
			<td>R6812</td>
			<td>RNA extration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1X</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Tryptic Soy Agar</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>236950</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Cytokine expression qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Cytokine expression qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708860</td>
			<td>Real-time quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bacterial clearance assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Intravital imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td>Bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASYstrainer (Nylon Basket)</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>542 040</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax iD3</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet Pestle Motor</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6HAZ6</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Pellet Pestles</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>6HAY5</td>
			<td>Tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime Thermal Cycler</td>
			<td>Techne</td>
			<td>3PRIMEBASE/02</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Cytokine expression qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriReagent (GTCP)</td>
			<td>Molecular Research Center</td>
			<td>TR 118</td>
			<td>RNA extration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a neonatal imaging model of gram-negative bacterial sepsis

Neonates onlar yaşamın ilk aylarında görüntülemek benzersiz bağışıklık profili nedeniyle bakteriyel sepsis riski altındadır. Yeninelerde yüksek mortalite oranlarından sorumlu bir serotip olan E. coli O1:K1:H7 patogenezinin incelenmesi için bir protokol oluşturduk. Yöntemimizde enfeksiyonun ilerlemesi sırasında farklı zaman noktalarında yenidoğan yavrularının intravital görüntülemesi kullanılmaktadır. Kandaki bakterilerin ölçülmesi, inflamatuar profilleme ve doku histopatolojisi ile paralel lik gösteren bu görüntüleme, sepsis sırasında enfeksiyon dinamiklerini anlamak için titiz bir yaklaşım anlamına gelir. Mevcut raporda, bakteriyel yüklerin karşılaştırılması ve hastalığın şiddetini karşılaştırmak için iki enfeksiyöz inokül modellenmiştir. Subscapular enfeksiyonun enfeksiyon sonrası 10 saat ile yaygın enfeksiyona yol açtığını bulduk. 24 saat, Parlak E. coli enfeksiyonu kan, akciğerler ve diğer periferik dokularda bol oldu. Akciğerlerde inflamatuar sitokinlerin ekspresyonu 24 saat önemlidir, ve bu hücresel infiltrasyon ve enfeksiyöz doz ile artar doku hasarı kanıt takip eder. İntravital görüntülemenin bazı sınırlamaları vardır. Bu bir Parlak sinyal eşiği ve anestezi sırasında neonates ile ortaya çıkabilecek bazı komplikasyonlar içerir. Bazı sınırlamalara rağmen, enfeksiyon modelimizin yenidoğan mürin sepsisi sırasında uzunlamasına enfeksiyon dinamiklerini anlamak için bir fikir verdiğini ve bugüne kadar iyice incelenmediğini görüyoruz. Biz bu model de erken yaşam sırasında diğer kritik bakteriyel enfeksiyonları incelemek için adapte edilebilir bekliyoruz.

Bu protokol neonatal farelerde bakteriyel sepsise neden oldu ve hastalığın seyrini incelemek için uzunlamasına intravital görüntüleme, kandaki bakterilerin numaralandırılması, patolojinin histolojik değerlendirmeleri ve inflamatuar sitokin ekspresyon profilleri kullandık. Zaman içinde hem düşük (~2 x 106 CPU) hem de yüksek (~7 x 106 CPU) inokülleri ile enfekte olan yenidoğan yavrularında morbidite belirtileri gözlendi. Daha fazla inokül alan yavrular, hareket kabiliye...

Watch this Scientific Journal Video about A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis at JoVE.com

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonatal farelerin biyolüminesans E. coli O1:K1:H7 ile enfeksiyonu, önemli pulmoner inflamasyon ve akciğer patolojisi ile septik enfeksiyona neden olur. Burada, sistemik bakteriyel yüklerin numaralandırılmasına paralel olarak uzunlamasına intravital görüntüleme, inflamatuar profilleme ve akciğer histopatolojisi ile birlikte neonatal sepsisin modellenmesi ve incelenmesi için yapılan prosedürleri açıklıyoruz.

Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Protokolümüz, deneysel bir neonatal sepsis modelinde bakteriyel yayma ve yük takibine ve hastalığın diğer belirteçlerini patojen yüküyle ilişkilendirebilme ye olanak sağlamaktadır. Bu protokol, bireysel yenidoğan farelerde sepsisi uzunlamasına analiz etmemizi sağlayarak enfeksiyon dinamiklerini ve bakteriyel yayılmayı gerçek zamanlı olarak gözlemleme ve karşılaştırma fırsatı sağlar. Yenidoğan sepsisi için girişimlerin klinik öncesi testleri bu yöntemle yapılabildiği gibi, bakterilerin konak kontrolünün etkilerinin izlenmesine olanak sağlar.Bir biyogüvenlik seviyesi iki kabine içinde ya yüksek veya düşük doz çöp gruplarına yaş eşleşen yavru yerleştirerek başlayın. Doğum sonrası üçüncü veya dördüncü günde, aşılamadan önce tüm yavruların ağırlıklarını kaydedin. Biyogüvenlik kabininde PBS veya yüksek veya düşük doz E.coli lux inoculum ile insülin şırıngaları yükleyin ve yüklü şırıngaları buza yerleştirin.Biyogüvenlik kabine içinde temiz bir yüzeye enjekte edilecek yenidoğan yerleştirin ve yavru scruff gibi boyun ense de deri yükseltmek. İğneyi deri ile kas arasında oluşturulan boşlukta derinin hemen altına yerleştirin. İğne deri altında hissedilebilir, aynı anda geri akışı önlemek için derinin kıstırılmış kısmını serbest ederken inoculant 50 mikrolitre enjekte, sonra yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde iğne çıkarın.Tüm yavrulara aynı şekilde enjekte edildiğinde, yavruları barajlarına geri döndürün. Enjeksiyondan hemen sonra ve bundan sonra uygun deneysel zaman noktalarında, E.coli lux enfekte yenidoğan fareler ve baraj ile kafesi biyogüvenlik seviyesi iki laminar akış başlığına yerleştirin ve yazılımı mikro BT bilgisayarında açın. Sistemi başlatmave sahne sıcaklığının 37 santigrat derecede kilitlenmesi ve CCD sıcaklığının negatif 90 santigrat derecede kilitlenmesi için bekledikten sonra, en fazla dört anestezili yavruyu eğilimli pozisyondaki görüntüleme odasına yerleştirin.Görüntüleme odasının kapağını kapatın ve Lüminesans görüntüleme seçeneğini seçin. Filtreyi aç ve sonrayı seçin ve uyarma filtresini engelleyecek şekilde ayarlayın ve emisyon filtresini de açın. 500, 520, 560, 580, 600 ve 620 nanometre seçin.Daha sonra anestezi iyileşene kadar izleyerek baraj ile kafese dönmeden önce yavruları görüntüleyin. Uygun deneysel uç noktada, bir biyogüvenlik kabinesinde, kontaminasyonu önlemek ve hayvanı sağ tarafına yerleştirmek için ötenazi yenisini %70 etanol ile aşındırın. Karın ve arka sol bacak arasındaki cildi kavramak için forceps kullanın ve bir deri kesi yapmak için ince ucu cerrahi makas kullanın.Daha sonra tüm dalak açığa çıkana kadar hayvanın arkasına doğru kesi devam edin. Dalağını karından çıkarmak ve aşağı doğru uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirmek için forsepsleri ve makasları kullanın. Akciğerleri elde etmek için, göğüs derisi tamamen soyma ve göğüs kafesi bölünmüş kadar yukarı kesilmiş makas ile göğüs tabanına girerek.Tek tek sağ ve sol akciğerleri kavramak ve torasik kavite akciğerleri kaldırmak için forceps kullanın. Kalp makasla akciğer dokusundan çıkar. Daha sonra akciğeri aşağı akım uygulamasına uygun çözeltiye yerleştirin.Bir in vitro bakteriyel öldürme tahlili gerçekleştirmek için, steril bir içinde 40 mikrometre naylon süzgeç içine 40 mikrometre naylon süzgeç içine yerleştirin 10% fetal sığır serum ile desteklenen PBS beş mililitre içeren 60 milimetre Petri çanak ve tek bir hücre süspansiyon içine doku ayrıştırmak için steril üç mililitreşyon şırınga piston kullanın. Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj ile toplayın. Üç ila dört dalak başına kırmızı kan hücresi lisis tampon bir mililitre pelet resuspend.Oda sıcaklığında beş dakika sonra, PBS dalak yıkayın ve pbs 250 mikrolitre sığır serum albumin ve sayma için iki milimolar EDTA ile birlikte pelet resuspend. Daha sonra, üreticiprotokolüne göre uygun immünomanyetik boncuklar ile Ly6 B2 pozitif hücreleri izole ve bir kez zenginleştirilmiş Ly6 B2 pozitif hücreleri tohum bir kez 10 siyah veya beyaz 96-iyi plaka iyi yoğunluk başına tam orta 100 mikrolitre başına beş hücre. Her kuyuda 100 mikrolitrelik son bir hacimde bakteriin inokülü istenilen sayıda hazırlayın ve hücre kültürü kuluçka sında bir saatlik kuluçka için her kuyuya tek başına 100 mikrolitre bakteriyel inokül veya orta ekleyin.Kuluçka sonunda, kalan hücre dışı bakterileri ortadan kaldırmak ve hücreleri iki saat daha hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürmek için mililitre başına 100 mikrogram gentamisin ile takviye edilmiş 200 mikrolitre taze tam ortam ile orta yı değiştirin. Kuluçka sonunda ve bundan sonraki her deneysel zaman noktasında, bir sonraki okuma kadar hücre kültürü kuluçka için plaka dönmeden önce kapaklı kültür plaka her kuyuda parlaklık ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Çoğu hayvan enfeksiyon sonrası 24 saat kanda yüksek düzeyde bakteri sergilerken, bazı yavrularda kanda düşük veya tespit edilemeyen bakteriler vardır, bu da enfeksiyonun bu zaman noktasına kadar temizlenebildiğini düşündürmektedir.Buna ek olarak, ekstrasellüler bakterilerin çıkarılması ndan önce bir saat boyunca biyolüminesans E.coli ile enfekte olan neonatal Ly6 B2 pozitif dalak hücreleri ve müteakip gentamisin tedavisi, üç saat içinde yüksek düzeyde parlaklık ifade etti ve bu da zamanla bakteriyel açıklık göstergesidir. Parlak bakterilerin canlı hayvan görüntülemesi, enfeksiyon sonrası 10 ve 24 saat içinde yenidoğan yavrularında bakteri yayılması ve büyümesindeki artışı daha da doğrular. Mikro BT ile birlikte intravital görüntüleme beyin içinde enfeksiyon foci belirlenmesini kolaylaştırır, akciğerler, ve diğer periferik dokular.Bazı yüksek enfekte farelerin akciğerleri, parlak bakteri sinyallerine eş lokalize inflamatuar konsolidasyon ile uyumlu opak bölgeler gösterir. Enfekte olmayan kontrol akciğerlerinde inflamatuar eksüda olduğu tahmin edilen bu bölgelergözlenmez. Kontrollere göre inflamatuar sitokin ekspresyonunda da belirgin bir artış gözlenir, alveoler duvarın belirgin kalınlaşma ile ilişkili hem düşük hem de yüksek inokül grupları, artmış alveoler kanama, ve bu hayvanlarda inflamatuar infiltrasyon.Unutulmaması gereken en önemli şey enjeksiyonları yaparken uygun tekniği uygulamak ve anestezi yi uygularken neonatlara sıkı dikkat etmektir. Bu tekniği kullanarak, girişimleri incelemek için neonatal sepsisi gerçek zamanlı olarak görselleştirebilir ve immün yanıtı iyileştirmeye yönelik tedavilere ev sahipliği yapabiliriz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Kolon Peritonit Stent Ascendens (CASP) - polimikrobik Abdominal Sepsis için bir Standart Model

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Bakteriyel Prostatit bir fare modelinde Dokunsal allodini Ölçümü

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Çekal ligasyon ve Farelerde Autophagy incelemek için bir model olarak Sepsis Patamaya kaynaklı

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Yenidoğan Polymicrobial Sepsis için kontrollü fare modeli

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...