Name: real-time monitoring of aurora kinase a activation using conformational fret biosensors in live cells
Uploaded: 2020-07-30T15:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells at JoVE.com

We danken de ingenieurs van het Microscopy-Rennes Imaging Center (MRic, BIOSIT, Rennes, Frankrijk) voor advies en hulp, en in het bijzonder X. Pinson voor het kritisch lezen van het manuscript. MRic is lid van de nationale infrastructuur France-BioImaging ondersteund door het Franse Nationale Onderzoeksbureau (ANR-10-INBS-04). Dit werk werd ondersteund door het Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), de Ligue Contre le Cancer Comités d'Ille et Vilaine, des Côtes d'Armor et du Finistère en de Association pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) aan G.B.

OPMERKING: U2OS-cellen die in dit protocol worden gebruikt, zijn gekocht bij American Type Culture Collection (ATCC, HTB-96) en ze zijn getest zonder mycoplasma. Stap 2.1 tot en met 2.7 moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stroomkap om cellen en reagentia steriel te houden.
1. Het FRET-paar van donor/acceptor kiezen
<ol><li>Raadpleeg de literatuur voor de keuze van de meest geschikte donor/acceptor FRET-paren. Nuttige voorbeelden zijn te vinden in 20,21,22,23,24, hoewel de uiteindelijke keuze moet worden gemaakt op basis van de kenmerken van de FRET / FLIM-opstelling (beschikbare laserlijnen, filters, enz.). Hieronder volgen enkele overwegingen bij het selecteren van een donor/acceptorpaar.<ol>
<li>Het kiezen van de donor: raadpleeg FP base (https://www.fpbase.org/) voor een volledige set informatie over de beschikbare fluorescerende eiwitten. Deze database wordt voortdurend bijgewerkt met alle nieuw ontwikkelde fluoroforen.</li>
		<li>Raadpleeg de Fluorescent Biosensor Database (https://biosensordb.ucsd.edu/index.php) voor meer informatie over de biosensoren die al beschikbaar zijn in de literatuur, samen met de respectievelijke fluorescerende eiwitten die worden gebruikt.</li>
		<li>Kies als algemeen uitgangspunt een heldere donorfluoofoor. Goede kandidaten zijn cyaan fluorescerende eiwitten als mTFP1 of ECFP, of GFP-varianten als EGFP of mEGFP.</li>
		<li>Oligomeren kunnen de eiwitlokalisatie en/of -functie beïnvloeden25. Overweeg het gebruik van monomere mutanten van CFP als mTurquoise226 of Aquamarine27,28. Deze varianten hebben ook goede kwantumopbrengst- en extinctiecoëfficiënten, waardoor ze goede kandidaten zijn als FRET-donoren.</li>
		<li>Geef de voorkeur aan fluorescerende eiwitten (zowel als donor als acceptors) die ongevoelig zijn voor omgevingsveranderingen zoals intracellulaire pH23, of aan fotobleaching25, omdat de FRET-efficiëntie sterk kan worden beïnvloed door deze parameters29. Tegenwoordig worden fluoroforen zoals mTurquoise2 of mTFP1 op grote schaal gebruikt als donor, dankzij hun goede fotostabiliteit22,25,26.</li>
	</ol></li>
	<li>Het kiezen van de acceptor: cyaandonoren worden vaak gecombineerd met Yellow Fluorescent Protein (YFP) varianten, zoals mVenus, Citrine en YPet20,21,22,30. Er moet echter worden opgemerkt dat deze eiwitten een veel grotere gevoeligheid voor pH hebben en wereldwijd een slechte fotostabiliteit vertonen.<ol>
<li>Overweeg het gebruik van nieuw ontwikkelde, pH-ongevoelige gele varianten van YFP als pH-Lemon31, groene fluoroforen als mNeonGreen23 of rode fluoroforen als mScarlet-I23,32 als eerder gevalideerde fluorescerende acceptoren voor mTurquoise2.</li>
		<li>Als alternatief kunt u overwegen om niet-fluorescerende / donkere derivaten van YFP te gebruiken als ShadowG33 of ShadowY34, waarvan werd aangetoond dat ze zich gedragen als goede acceptors voor cyaan-fluorescerende donoren in FRET / FLIM-experimenten.</li>
		<li>Als u mEGFP als donor gebruikt, overweeg dan om monomere rode acceptors als mCherry te gebruiken.</li>
	</ol></li>
	<li>Controleer de spectrale eigenschappen van het gekozen donor/acceptorpaar met behulp van de tools die beschikbaar zijn op de FP-basiswebsite. Zie figuur 1 voor een voorbeeld van het paar mEGFP/mCherry.<ol>
<li>Selecteer op de FP-basiswebsite het vervolgkeuzemenu Extra en selecteer Spectra-viewer.</li>
		<li>Voer in de vervolgkeuzemenu's de naam in van het fluorofoorpaar dat u wilt visualiseren (bijvoorbeeld mEGFP en mCherry).</li>
		<li>Simuleer de eigenschappen van het donor/acceptor-paar met een specifieke lichtbron door een bepaalde laser te selecteren in het vervolgkeuzemenu. U kunt ook een specifieke lasergolflengte invoeren door Laser toevoegen te selecteren. Klik op de optie Emissie normaliseren om de fluorofoorspectra aan te passen aan de gewenste golflengte. Hier ligt de golflengte die wordt gebruikt om GFP te prikkelen op 480 ± 10 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Kloon het geselecteerde donor/acceptorpaar door één fluorofoor toe te voegen aan het N-eindpunt van de volledige lengtesequentie van AURKA en één aan het C-eindpunt. Volg de richtlijnen van de voorkeurs kloonmethode om dit construct in te voegen in een zoogdierexpressievector naar keuze.</li>
</ol>2. Celkweek, transfectie en synchronisatie
<ol><li>DAG 1. Kweekmedium voorbereiden op U2OS-cellen: gebruik Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% Foetaal Runderserum (FBS), 1% Penicilline-Streptomycine en 1% L-Glutamine (vanaf hier Complete groeimedia). Als alternatief kan DMEM met vooraf aangevuld L-Glutamine ook worden gebruikt.</li>
	<li>Als cellen bevroren zijn, ontdooi dan een injectieflacon ten minste 8 dagen voorafgaand aan experimenten (d.w.z. vanaf punt 2.5).</li>
	<li>Kweek cellen in een incubator gewijd aan zoogdiercelculturen bij 37 °C en met 5% CO2. Reinig en steriliseer de incubator regelmatig om besmettingen te voorkomen.</li>
	<li>Wanneer de cellen ~80% samenvloeiing bereiken:<ol>
<li>Was ze kort met steriele 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) zonder Ca2+ en Mg2+.</li>
		<li>Trypsinize cellen met steriele 0,05% Trypsin-EDTA volgens het protocol van de fabrikant en door cellen in de incubator te plaatsen gedurende 1-3 min.</li>
		<li>Inactiveer trypsine door tweemaal het volume van volledige groeimedia toe te voegen; meng goed.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 800 x g gedurende 3-5 minuten.</li>
		<li>Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bereken de juiste verdunning voor hen om de dag erna op ~ 70-80% confluentie in kamerdia's te zijn. Als alternatief kunnen ook vergelijkbare ondersteuningen voor live cell imaging worden gebruikt.</li>
		<li>Pipetteer het overeenkomstige volume cellen in de gekozen live cell imaging-ondersteuning en plaats cellen terug in de incubator tot de dag erna.</li>
	</ol></li>
	<li>DAG 2. Ga verder met transfectie. Volg de richtlijnen van de gewenste transiënte transfectiemethode(s) om een optimale transfectie-efficiëntie te verkrijgen (~50/80%). Er is geen specifieke transfectiemethode vereist. Merk op dat de transfectie-efficiëntie kan variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn. Incubeer gedurende 48 uur. OPMERKING: Produceer stabiele klonen die elk van de drie vectoren bevatten om de noodzaak van voorbijgaande transfecties te omzeilen. In dit stadium moeten twee soorten controles worden gepland. Ten eerste is een "donor-only" controle vereist om te verifiëren dat de aanwezigheid van AURKA over de volledige lengte de levensduur van mTurquoise2 op zich niet verstoort. Ten tweede moet een biosensor met een kinase-dode mutatie worden gebruikt als een negatieve controle waarbij FRET wordt afgeschaft of aanzienlijk wordt verlaagd. Als alternatief voor een kinase-dode mutant kan een chemische remmer van AURKA-activering als de ATP-analoog MLN8237 worden gebruikt als een negatieve controle.<ol>
<li>Plan vooruit drie transfectiecondities, elk in een onafhankelijke put: De vector "donor only" (bijv. AURKA-mTurquoise2) De "biosensor" (bijv. superYFP-AURKA-mTurquoise2) Een kinase-dode/"K162M"-biosensor (bijv. superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2) of als alternatief een remmer van AURKA-activering (bijv. MLN8237)</li>
		<li>Voer drie voorwaarden uit voor elk onafhankelijk donor/acceptor-paar om te vergelijken.</li>
		<li>Overweeg het aantal getransfecteerde putten te verdubbelen als u niet-gesynchroniseerde en G2/M-gesynchroniseerde cellen vergelijkt (zie stap 2.6).</li>
	</ol></li>
	<li>DAG 3. Synchroniseer cellen in G2/M. Voeg 100 ng/ml nocodazol opgelost in DMSO toe aan elke getransfecteerde put om blootstelling aan licht te voorkomen en incubeer gedurende 16 uur (bij voorkeur 's nachts). Als u niet-gesynchroniseerde en G2/M-gesynchroniseerde cellen vergelijkt, behandel dan elke transfectieaandoening met nocodazol of met een gelijk volume DMSO. Voor een betere synchronisatie-efficiëntie bereidt u aliquots van nocodazol voor eenmalig gebruik in DMSO, bewaart u ze bij -20 °C en gooit u ze na gebruik weg. OPMERKING: De efficiëntie van celsynchronisatie kan variëren tussen cellijnen. De optimale concentratie van nocodazol en de incubatietijd ervan moeten experimenteel worden bepaald door flowcytometriebenaderingen voorafgaand aan FRET / FLIM-experimenten. Voor statistisch relevante FRET/FLIM-analyses adviseren wij een synchronisatie-efficiëntie in G2/M van ten minste 50% van de totale celpopulatie.</li>
	<li>DAG 4. Nocodazol washout en FRET/FLIM beeldvorming op mitotische cellen<ol>
<li>Verwijder het kweekmedium met een pipet en vervang het door voorverwarmd, steriel PBS. Vermijd blootstelling aan licht indien mogelijk. Wieg zachtjes de plaat.</li>
		<li>Herhaal de wasprocedure en vermijd altijd blootstelling aan licht.</li>
		<li>Verwijder de tweede PBS-was en vervang deze door voorverwarmd, steriel Leibovitz L-15 medium, aangevuld met 20% Foetaal Runderserum (FBS) en 1% Penicilline-Streptomycine (vanaf hier beeldvormende media). OPMERKING: Beeldvormende media moeten worden gekocht zonder pH-indicatoren (bijv. Fenolrood) en mediumcomponenten als riboflavine. Deze stoffen zijn een bron van autofluorescentie die de levensduurwaarden kan verstoren.</li>
		<li>Ga verder met FRET/FLIM-beeldvorming. Minimaliseer snelle temperatuurveranderingen en ga zo snel mogelijk verder met de beeldvormingsstap (stap 3). Overweeg het monster tegen licht te beschermen terwijl u het naar de microscoopopstelling transporteert (d.w.z. door het in een aluminiumfolie te wikkelen of in een doos te plaatsen).</li>
	</ol></li>
</ol>3. FRET/FLIM acquisities
OPMERKING: FRET/FLIM-acquisities in dit protocol werden uitgevoerd op een op maat gemaakte opstelling, beschreven in35 en uitgerust met een besturingsoplossing zoals in15,17 (figuur 2). De opstelling wordt nu gecommercialiseerd door Inscoper en is gemaakt van een draaiende schijfmicroscoop met een witte laser voor gepulseerde excitatie en een high-rate time-gated intensifier voor de camera. Temporele poorten van 2 ns in een tijdvenster van 10 ns worden achtereenvolgens gebruikt om een stapel van vijf time-gated beelden te verkrijgen. Deze afbeeldingen worden vervolgens gebruikt om de pixel-voor-pixel gemiddelde fluorescentielevensduur te berekenen volgens de volgende vergelijking: τ = ΣΔti • Ιi/ΣΙi, waarbij Δti overeenkomt met de vertragingstijd van de ith-poort terwijl ik het pixel-voor-pixel time-gated intensity-beeld aangeef35,36 . Deze methode zorgt voor snelle FLIM-metingen: er zijn geen montage- of binningstappen vereist en de levensduur kan in een online modus worden berekend, met een minimaal fotonenbudget. Het systeem biedt ook een gebruiksvriendelijke software-interface. Hetzelfde experiment kan echter worden uitgevoerd onder elke andere commerciële microscoopopstelling die is uitgerust voor FLIM-metingen.
<ol><li>Om een optimale afgifte van cellen uit het G2/M-blok in mitose te garanderen, voert u experimenten uit bij 37 °C. Voer indien mogelijk FRET/FLIM-experimenten uit met microscoopopstellingen die zijn uitgerust met een thermostatische kamer.</li>
	<li>Schakel de thermostatische kamer van de microscoop ten minste 30 minuten tot 1 uur voor het experiment in.</li>
	<li>Schakel de laser, de camera, de microscoopopstelling en de beeldbewerkingssoftware in (figuur 2).</li>
	<li>Selecteer de juiste excitatie- en emissiegolflengten voor de donorfluoofoor. Handige golflengteopties zijn: λex 440/10 nm en λem 483/35 nm voor mTurquoise2 (figuur 3A); λex 488/10 nm en λem 525/50 nm voor GFP) (figuur 3B).</li>
	<li>Stel de belichtingstijd in, meestal tussen 30 en 100 ms (figuur 3). Pas op dat overmatig laservermogen kan leiden tot geïnduceerde fototoxische effecten als fotobleaching, wat op zijn beurt de fluorescentielevensduur kan wijzigen37. Valideer in de opstelling de afwezigheid van fotobleachinggebeurtenissen door de fluorescentie-intensiteit van de eerste poort te bewaken tijdens time-lapse-acquisities. Als variaties in de fluorescentie-intensiteit waarneembaar zijn, gooit u de acquisitie weg en past u het laservermogen aan. OPMERKING: Selecteer in de opstelling hier een belichtingstijd die ten minste 3000 grijsniveaus in de eerste poort toestaat; anders berekent de software de levensduur van de donor niet. Deze grijswaarden komen overeen met het minimale fotonenbudget dat nodig is om relevante levensduurwaarden te verkrijgen.</li>
	<li>Voordat u FRET / FLIM-acquisities lanceert, moet u ervoor zorgen dat cellen mitose hebben gekregen door te wachten tot het verschijnen van de bipolaire spil (~ 20/30 min in U2OS-cellen). Aangezien mitotisch AURKA voornamelijk op deze structuur lokaliseert, verifieert u de mitotische progressie door de vorming van de spil in cellen direct onder de microscoop te screenen, met een externe lichtbron (figuur 1). Merk op dat de tijd die nodig is voor mitotische progressie kan variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn.</li>
	<li>Als behandeling met MLN8237 is gepland, plaatst u de cellen onder de microscoop en laat u ze de metafas bereiken (ca. 20 minuten na uitspoeling van nocodazol). Voeg 250 nM MLN8237 opgelost in DMSO toe aan zowel cellen die het donor-only construct tot expressie brengen als aan cellen die de biosensor tot expressie brengen.<ol>
<li>Controleer deze toestand op cellen die zijn getransfecteerd zoals hierboven en incamineer met een gelijk volume DMSO. Voor een betere AURKA-remming bereidt u aliquots voor eenmalig gebruik van MLN8237 in DMSO, bewaart u ze bij -80 °C. Ontdooi ze door de aliquots op ijs te leggen en gooi ze na gebruik weg.</li>
		<li>Incubeer gedurende 10 min. Na deze periode zal de mitotische spil krimpen en blijft er slechts een enkele, intense stip over. Een vergelijkbaar fenotype wordt waargenomen wanneer K162M-mutanten worden gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik voor een betere resolutie van de mitotische spil ten minste een objectief van 63x (figuur 3).</li>
	<li>Zodra een cel in de metafase is gevonden (zie figuur 4 als voorbeeld van een cel in de metafase), past u de xyz-coördinaten aan om deze in het midden van het gezichtsveld te plaatsen.</li>
	<li>Voor snellere afbeeldingen selecteert u één enkel z-vlak . Kies het vlak waar de mitotische spil zichtbaarder of intenser is.</li>
	<li>Start de opname. De acquisitietijd kan variëren afhankelijk van de gebruikte FLIM-opstelling (van enkele seconden tot min). De meerderheid van de commerciële opstellingen die op de markt beschikbaar zijn, zullen zowel de fluorescentiemicrograaf als de pixel-voor-pixel levensduurkaart uitwerken. Sla beide afbeeldingen op.</li>
	<li>Verkrijg ten minste 10 onafhankelijke beelden van elke transfectie en / of behandelingsconditie.</li>
</ol>4. Berekening van de ΔLevenstijd en vergelijking van FLIM-waarden tussen donor/acceptorparen
<ol><li>Extraheer levenslange waarden uit de hele pixel-voor-pixel levensduurkaart (d.w.z. de hele mitotische spil) of selecteer interessegebieden (ROI's) die overeenkomen met specifieke subregio's. OPMERKING: Volgens de gebruikte FRET/FLIM-opstelling kunnen levensduurberekeningen rechtstreeks op de acquisitiesoftware worden uitgevoerd of worden geëxtraheerd met generieke beeldverwerkingsoplossingen (bijv. Fiji/ImageJ: https://fiji.sc/). Software die direct levensduurwaarden berekent (ook bekend als online modus) biedt een gebruiksvriendelijkere oplossing, die geschikt is voor beginners en voor microscopiegebruikers die niet volledig bekend zijn met FRET / FLIM. Integendeel, het extraheren van levensduurwaarden na verwerving vereist vaak een aanpassingsprocedure. Deze optie is minder toegankelijk voor beginners, omdat enige voorkennis over wiskundige modellen van aanpassing noodzakelijk is.</li>
	<li>Eenmaal gevisualiseerd of geëxtraheerd, berekent u de gemiddelde levensduur van de cellen die de "donor-only" vector tot expressie brengen (bijv. AURKA-mTurquoise2), dit betekent de levensduur van de donor.</li>
	<li>Trek elke onafhankelijke levensduurwaarde berekend in stap 4.1 af van de gemiddelde levensduur van de donor. Het herhalen van deze stap voor alle cellen in alle geanalyseerde omstandigheden geeft de ΔLifetime voor elke aandoening.</li>
	<li>Vergelijk ΔLifetime-waarden voor de "donor-only", de "biosensor" en de "K162M", of de DMSO en de MLN8237-voorwaarden. OPMERKING: Voor de toestand "alleen donor" moet ΔLevenstijd resulteren in waarden dicht bij nul en overeenkomend met de experimentele fluctuaties van levensduurwaarden. Voor de toestand "biosensor" moeten ΔLevenstijdwaarden het nettoverschil tussen de twee constructen opleveren (zie figuur 4 voor een geïllustreerd voorbeeld).</li>
	<li>Vergelijk ΔLifetime waarden tussen verschillende donor/acceptor paren.<ol>
<li>Vergelijk de "biosensor" -omstandigheden: vertonen ze vergelijkbare ΔLifetime?</li>
		<li>Vertonen de "K162M" of de MLN8237-omstandigheden vergelijkbare ΔLifetime onder hen? Is hun ΔLifetime vergelijkbaar met de "donor-only" aandoening?</li>
	</ol>
</li>
</ol>

G.B. voerde de experimenten uit, schreef en beoordeelde het manuscript en verstrekte financiering, M.T. beoordeelde het manuscript en verleende ondersteuning. M.T. is wetenschappelijk adviseur en aandeelhouder van het bedrijf Inscoper (Frankrijk), dat de oplossingen voor snelle FLIM-metingen produceert die in dit manuscript worden getoond. Inscoper ondersteunde gedeeltelijk de Open Access publicatie van het manuscript. Inscoper was niet betrokken bij experimenteel ontwerp, gegevensverwerking, noch bij het schrijven van het manuscript.

Genetisch gecodeerde FRET-biosensoren zijn betrouwbare hulpmiddelen om de activering van afzonderlijke eiwitten of van volledige signaalroutes te meten41. Met name de AURKA FRET biosensor vormt een voorkeursmanier om de activering van het kinase in tijd en ruimte te onderzoeken. Sommige elementen verdienen echter speciale aandacht bij het ontwerpen of optimaliseren van een FRET-biosensor, niet alleen in algemene termen, maar meer specifiek voor AURKA.
Ten eerste kunnen de aard en de relatieve positie van het donor/acceptor FRET-paar worden aangepast voor specifieke functies van dit kinase. AURKA is sterk verrijkt aan de mitotische spil tijdens mitose, maar het is aanwezig gedurende de hele celcyclus en op verschillende subcellulaire locaties (bijv. Centrosomen, de kern en mitochondriën)1,2. Als de biosensor moet worden gebruikt in specifieke compartimenten zoals mitochondriën, die een zure pH kunnen bereiken, moet de keuze worden gemaakt voor een pH-ongevoelig donor-acceptor FRET-paar als mTurquoise2 / shadowG. Bovendien zou het plaatsen van de FRET-donor op de C-terminus een betere visualisatie van de biosensor in dit subcellulaire compartiment mogelijk kunnen maken en mogelijk zelfs de FRET-detectie kunnen optimaliseren, aangezien werd aangetoond dat AURKA N-terminus gedeeltelijk afsplitste bij mitochondriën16,42.
Ten tweede zou een nog onontgonnen manier om de AURKA FRET-biosensor te optimaliseren een zorgvuldiger ontwerp van linkers vereisen tussen AURKA over de volledige lengte en het donor/ acceptor-paar. Niet alleen de afstand tussen het fluorescerende paar, maar ook de eigenschappen van de linker zelf bleken belangrijke factoren te zijn om de FRET-efficiëntie te verbeteren43,44,45,46. In dit licht kan het verhogen van de stijfheid of de flexibiliteit van de linker schadelijk zijn voor de FRET-efficiëntie of deze verder verbeteren.
Ten derde is bekend dat de overexpressie van AURKA mitotische spindelafwijkingen induceert in een aanzienlijk deel van de cellen2. Het zou interessant zijn om ΔLifetime te vergelijken die wordt verkregen door hetzelfde FRET-construct tot expressie te brengen onder een sterke promotor zoals cytomegalovirus (CMV) - een van de meest voorkomende promotors die worden aangetroffen in vectoren van zoogdierexpressie - of onder de AURKA minimal promoter sequence (CTTCCGG)14,47. Eerder werd aangetoond dat deze promotor monopolaire of multipolaire spindels redde die ontstonden na het neerhalen van het kinase, en het gebruik ervan veroorzaakte niet per se verstoringen van de celcyclus14,47. Hoewel FLIM ongevoelig is voor eiwitexpressieniveaus en relatieve concentraties in de cel11, zou het profiteren van een grondige vergelijking van de twee promotors op dezelfde biosensoropstelling het begrip van de pool van geactiveerde AURKA op een bepaalde locatie verbreden. Bovendien zou het nieuwe inzichten bieden over hoe AURKA-activering kan veranderen bij overexpressie, wat relevant is voor epitheliale en hematologische kankerparadigma's.
Ten slotte moet ook rekening worden gehouden met de downstream FRET-toepassing. Een toekomstperspectief op het gebied van AURKA zou zijn om de kinase conformational biosensor te cumuleren met een substraat-gebaseerde biosensor. Het analyseren van het FRET-gedrag van twee biosensoren tegelijkertijd - een proces dat bekend staat als multiplex FRET - vereist een donkere acceptor op de eerste biosensor om spectrale bloeding in het tweede donorkanaal te voorkomen. In de context van AURKA zou dit het opwindende nieuwe perspectief openen van het detecteren van de activering van het kinase met de eerste biosensor en de enzymatische activiteit ervan naar een bepaald substraat met het tweede. Recente ontwikkelingen in multiplexing maken het nu mogelijk om tot drie biosensoren tegelijk te cumuleren48. Het toepassen van een vergelijkbare methode in de context van AURKA zou een veelbelovende strategie kunnen zijn, niet alleen om het activeringsactiviteitsspel van het kinase te testen, maar ook om AURKA-signaleringscascades met een ongekende spatiotemporale resolutie te verkennen.
Kortom, FRET/FLIM is een handige manier om de kennis over eiwitactiviteit te verdiepen. Aan de ene kant maakt het het mogelijk om de lokalisatie van een bepaald eiwit in levende cellen te visualiseren, dankzij ten minste één fluorescerend deel. Aan de andere kant kan het eiwitconformatieveranderingen ontrafelen, wat informatief kan zijn over eiwitactivering en / of -activiteit. Daarom hebben FRET/FLIM en conformationale FRET-biosensoren het potentieel om wijdverspreide methoden te worden om signaalroutes in levende cellen te volgen, en met een voortreffelijke spatiotemporale resolutie.

Aurora kinase A/AURKA is een multifunctioneel serine/threonine kinase, actief gedurende de celcyclus en in verschillende subcellulaire compartimenten1. Het begrijpen van de brede spatiotemporale activering is vooral belangrijk bij kanker, omdat AURKA vaak overexpressie heeft in epitheliale en hematologische maligniteiten, waarbij patiënten een slechte responsiviteit vertonen op de momenteel beschikbare therapieën2.
Structurele studies toonden aan dat AURKA twee stappen ondergaat om van een inactief naar een actief kinase te gaan. Ten eerste verandert de autofosforylering van Thr288 de conformatie van de kinetische pocket van het kinase en activeert deze3,4,5,6. Deze stap verhoogt de katalytische activiteit van AURKA in menselijke cellen en in Xenopus laevis3,6,7, waardoor het kinase wordt geprikkeld voor volledige activiteit. Eenmaal geactiveerd, induceert de interactie van AURKA met het doeleiwit voor Xklp2 (TPX2) een tweede conformationele verandering5. Deze verdere modificatie stelt AURKA in staat om volledige enzymatische activiteit te bereiken naar zijn substraten in de cel5,8,9,10.
Gedurende bijna twee decennia werden inzichten over de activering en activiteit van AURKA voornamelijk verkregen door een combinatie van biochemische benaderingen. Deze omvatten de detectie van gefosforyleerd Thr288 in cellen of in vivo als een kenmerk van AURKA-activering, kristallografische analyses en in vitro of in cellulokinasetests om de activiteit van AURKA1 te onderzoeken. De spatiotemporele oplossing van deze benaderingen is echter slecht of afwezig, en er waren nieuwe oplossingen nodig om de kennis van de dynamiek van deze twee gebeurtenissen te verbreden.
De ontwikkeling van fluorescerende sondes in de afgelopen jaren vergemakkelijkte de monitoring van AURKA in levende cellen, waardoor de activering ervan met een grotere spatiotemporale resolutie mogelijk werd. De meest specifieke sensoren voor AURKA die tot nu toe zijn ontwikkeld, vertrouwen op het FRET-principe (Förster's Resonance Energy Transfer)11 om onderscheid te maken tussen inactieve en actieve AURKA. De eerste sensor die werd ontwikkeld was een substraatgebaseerde biosensor van AURKA-kinaseactiviteit. Substraatgebaseerde biosensoren worden gevormd door een korte aminozuursequentie gericht op een bepaald kinase voor fosforylering en ingebracht in een donor / acceptor FRET-paar en een bindend domein dat het gefosforyleerde residu herkent, wat de vouwing van de biosensor helpt voor een efficiënt FRET-proces12. In het geval van AURKA werd een 14-aminozuurfragment van KIF2C gericht op fosforylering ingebracht tussen een CFP-YFP donor/acceptorpaar13. Deze sensor heeft echter een aantal grote nadelen. Ten eerste kan de KIF2C-sequentie die in deze sonde wordt gebruikt, zowel door AURKA als door het nauw verwante kinase AURKB worden aangevallen, waardoor de specificiteit van deze biosensor wordt verminderd. Ten tweede vertrouwt de sensor op het endogene kinase voor fosforylering. Daarom kan de FRET-efficiëntie niet detecteerbaar of niet significant zijn als de hoeveelheden van het kinase beperkend zijn (bijvoorbeeld in subcellulaire compartimenten of celcyclusfasen). Om deze beperkingen te overwinnen, werd een nieuwe klasse AURKA-sensoren gecreëerd die bekend staat als "conformatiesensoren". In deze sondes werd de volledige lengtesequentie van AURKA ingebracht in een donorfluoofoor aan het N-eindpunt en een acceptorfluoofoor aan het C-eindpunt. Inactief AURKA presenteert een "open" conformatie, die de N- en C-termini van het kinase van elkaar wegbrengt. Met een dergelijke afstand tussen de twee termini (> 10 nm), bevindt het donor/acceptorpaar zich in een niet-permissieve configuratie voor FRET. Integendeel, autofosforyleerd AURKA neemt een "gesloten" conformatie aan, met de twee eiwitatomen termini en de twee fluoroforen in de nabijheid. Hiermee werd aangetoond dat FRET tussen de donor en de acceptor mogelijk is, die kan worden gemeten met behulp van de variaties in de levensduur van de donor14,15. Dergelijke sondes bieden verschillende voordelen. Ten eerste zijn ze genetisch gecodeerd en kunnen ze worden gebruikt om het endogene kinase in de cel te vervangen. Ten tweede redden ze de fenotypen geïnduceerd door de knockdown van AURKA, wat aangeeft dat ze functioneel zijn in de cel. Ten derde maken ze het mogelijk om de activering van het kinase te volgen in verschillende subcellulaire compartimenten en gedurende de hele celcyclus. De sondes detecteerden de activering van AURKA op locaties waar bekend is dat het kinase wordt geactiveerd (d.w.z. centrosomen en de mitotische spindel), en namen ook deel aan het ontdekken van de activering van AURKA bij de mitochondriën16. Ten slotte maakten deze sensoren screenings met een hoog gehalte mogelijk op basis van FRET / FLIM, waarbij de conformatieveranderingen van AURKA werden gebruikt om nieuwe farmacologische remmers te identificeren17.
In dit werk beschrijven we een procedure om AURKA-activering in gekweekte cellen te visualiseren. Eerst zullen we inzicht geven in mogelijke fluorofoorparen voor FRET. De keuze van het meest geschikte donor/acceptorpaar wordt gemaakt op basis van de beschikbare microscoopopstelling, of een bepaalde downstream-toepassing als multiplex FRET18,19. Vervolgens stellen we een pijplijn voor om het gedrag van de biosensoren te onderzoeken die zijn gekozen in een snelle FRET / FLIM-microscoopopstelling. Deze pijplijn zal zich uitstrekken van celkweek- en synchronisatieprocedures tot FLIM-acquisitie en data-analyse. Ten slotte zullen we de potentiële voordelen van dit protocol bespreken, omdat een analoge strategie voor biosensorontwerp kan worden toegepast op andere kinasen, en het kan ook worden gebruikt met andere FRET-gebaseerde beeldvormingssystemen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alisertib (MLN8237)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Use at a 250 nM final dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>41966052</td>
			<td>High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Leibovitz&#39;s L15 medium + L-glutamine, no Phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>2515380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Merck 
			Brand: Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>Use at a 100 ng/mL final dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>25300096</td>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of aurora kinase a activation using conformational fret biosensors in live cells

Epitheliale kankers worden vaak gekenmerkt door de overexpressie van de Ser / Thr kinase Aurora A / AURKA. AURKA is een multifunctioneel eiwit dat wordt geactiveerd bij zijn autofosforylering op Thr288. AURKA-abundantie piekt in mitose, waar het de stabiliteit en de getrouwheid van de mitotische spil en de algehele efficiëntie van mitose regelt. Hoewel goed gekarakteriseerd op structureel niveau, ontbreekt een consistente monitoring van de activering van AURKA gedurende de celcyclus. Een mogelijke oplossing bestaat uit het gebruik van genetisch gecodeerde Förster's Resonance Energy Transfer (FRET) biosensoren om inzicht te krijgen in de autofosforylering van AURKA met voldoende spatiotemporale resolutie. Hier beschrijven we een protocol om FRET-biosensoren te ontwikkelen die Thr288-autofosforylering detecteren en hoe deze wijziging tijdens mitose kan worden gevolgd. Eerst geven we een overzicht van mogelijke donor/acceptor FRET-paren en tonen we mogelijke kloon- en insertiemethoden van AURKA FRET-biosensoren in zoogdiercellen. Vervolgens bieden we een stapsgewijze analyse voor snelle FRET-metingen door fluorescentielevende beeldvormingsmicroscopie (FLIM) op een op maat gemaakte opstelling. Dit protocol is echter ook van toepassing op alternatieve commerciële oplossingen die beschikbaar zijn. We sluiten af met het overwegen van de meest geschikte FRET-controles voor een op AURKA gebaseerde biosensor en door mogelijke toekomstige verbeteringen te benadrukken om de gevoeligheid van deze tool verder te vergroten.

We volgden de hierboven beschreven procedure om de autofosforylering van AURKA op Thr288 te registreren met behulp van twee biosensoren met verschillende spectrale eigenschappen. We vergeleken de initiële GFP-AURKa-mCherry probe14 met twee biosensoren met verschillende spectrale eigenschappen. Deze twee probes vertrouwen op de fluorescerende donor mTurquoise2 en op een niet-fluorescerende acceptor (ShadowG) in het ene geval, of een gele acceptor (superYFP) in een tweede geval. Vervolgens hebben we de volledige lengtesequentie van AURKA ingebracht in elk donor/acceptorpaar. Om een negatieve controle voor AURKA-activering te hebben, kunnen twee strategieën worden gevolgd. Ten eerste verstoort het gebruik van een klein ATP-analoog (MLN8237) de binding van ATP in de kinetische zak van het kinase en voorkomt het de activering ervan38. Ten tweede creëert de mutatie van Lys162 in Met (K162M) een kinase-dode versie van elke biosensor die niet in staat is om14,15,39 te activeren. Deze mutatie induceert de verstoring van een zoutbrug die normaal tussen Leie162 en Glu181 wordt gelegd, wat resulteert in een stabiele opening van de kinetische pocket van het kinase en de algehele inactivatie ervan veroorzaakt40. Als negatieve controle voor FRET gebruikten we een acceptor-devoid construct (GFP-AURKA of AURKA-mTurquoise2).
Na het synchroniseren van cellen in G2/M en het vrijgeven ervan in mitose, maten we de levensduur van alle getransfecteerde constructen aan de mitotische spil (figuur 4). Van belang is dat deze structuur als een geheel werd beschouwd en dat er geen ROI's in de spindel werden geanalyseerd. Vervolgens berekenden we ΔLevenstijd voor alle omstandigheden. Zoals verwacht lag de levensduur van GFP-AURKA of AURKA-mTurquoise2 (de "donor-only" condities) dicht bij 0, wat aangeeft dat de gemeten waarden voor deze constructen schommelden rond de gemiddelde waarde (Figuur 4A,4B). Omgekeerd verschilden de ΔLevenstijdwaarden voor GFP-AURKA-mCherry statistisch van de donor-only conditie, waarbij de ΔLifetime toenam met ~130 ps (figuur 4A). Soortgelijke waarnemingen werden gedaan voor shadowG-AURKA-mTurquoise2 en voor superYFP-AURKA-mTurquoise2, waarbij de Δlifetime toename van respectievelijk ~150 en ~220 ps van de donor-only conditie (figuur 4B,4C). Deze gegevens kunnen eenvoudig worden gevisualiseerd in afzonderlijke cellen met een pseudocolor Lookup Table (LUT). In dit geval zijn de waarden van ΔLevenstijd rond 0 pseudogekleurd geel, terwijl meer significante verschillen pseudogekleurd rood / paars zijn. Inderdaad, de pixel-voor-pixel LUT was dichter bij geel in cellen die de donor-only constructen tot expressie brachten, terwijl het meer in het rood / paarse spectrum was in cellen die beide biosensoren tot expressie brachten (Figuur 4A,4B). Dit werd ook waargenomen toen de GFP-AURKA-mCherry biosensor werd behandeld met de farmacologische remmer MLN8237.
Vervolgens analyseerden we de ΔLifetime van kinase-dode biosensoren. Deze constructen toonden intermediaire ΔLifetime-waarden: ΔLifetime was significant hoger in vergelijking met de donor-only conditie (figuur 4B,4C), maar het was ook significant lager dan hun normale tegenhangers (figuur 4B,4D). De vergelijkingen met cellen die zijn behandeld met MLN8237 of die kinase-dode biosensoren tot expressie brengen, zijn nodig om te schatten of ΔLevenstijdvariaties voor elk donor/acceptorpaar uitsluitend verband houden met de activering van AURKA. In het geval van GFP-AURKA-mCherry worden ΔLevensvariaties afgeschaft wanneer een AURKA-specifieke remmer wordt gebruikt. Omgekeerd zijn ΔLevensvariaties meestal, maar niet uitsluitend gekoppeld aan AURKA-activering in het geval van shadowG-AURKA-mTurquoise2 en van superYFP-AURKA-mTurquoise2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig01.jpg"> Figuur 1: GFP (donor) en mCherry (acceptor) excitatie- en emissiespectra. Spectra werden verkregen en aangepast van de FP-basiswebsite (https://www.fpbase.org/) en aangepast aan een 480 nm-laserexcitatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig02.jpg"> Figuur 2: Afbeelding van de experimentele werkruimte. (1) De besturingsoplossing; (2) witte laserbron; (3) CCD-camera; (4) microscoopstelling; (5) externe lichtbron/lamp voor oculaire screening van het monster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve afbeeldingen van de software voor FLIM-acquisitie. (A, B) 1) excitatie- en emissieparameters voor de donor (GVB in A of GFP in B); (2) blootstellingstijd; (3) selectie van de doelstelling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig04v3.jpg"> Figuur 4: Representatieve beelden van AURKA FRET biosensoren en hun negatieve controles. (A) (Micrographs) Fluorescentie (groen kanaal) en bijbehorende pixel-voor-pixel ΔLifetime (donor only – biosensor) van U2OS-cellen die GFP-AURKA of GFP-AURKA-mCherry tot expressie brengen, gesynchroniseerd bij G2/M, vrijgegeven totdat de bipolaire spindel zichtbaar is en vervolgens behandeld met DMSO of met MLN8237. ΔLifetime wordt geïllustreerd met een pseudocolor schaal ("Fire" lookup table). (Grafiek) Overeenkomstige kwantificering en tweerichtingsanalyse van ANOVA voor de aangegeven omstandigheden. (B) (Micrographs) Fluorescentie (cyaankanaal) en bijbehorende pixel-voor-pixel ΔLifetime (donor only – biosensor) van U2OS-cellen die shadowG-AURKA-mTurquoise2 (bovenste paneel) of superYFP-AURKA-mTurquoise2 (onderste paneel) tot expressie brengen, gesynchroniseerd bij G2/M en vrijgegeven totdat de bipolaire spindel zichtbaar is. ΔLifetime wordt geïllustreerd met een pseudocolor schaal ("Fire" lookup table). (Grafiek) Overeenkomstige kwantificering en eenrichtingsanalyse van de omstandigheden die in de bovenstaande micrografieën worden weergegeven. (C) (Micrographs) Afbeeldingen van AURKA-mTurquoise2 (bovenste paneel), shadowG-AURKA K162M-mTurquoise2 (middenpaneel) en superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2 verworven en weergegeven zoals in de micrografieën. (Grafiek) Tweeweg ANOVA-analyse voor de geïndiceerde transfectiecondities. De balk in boxplots vertegenwoordigt de mediaan; snorharen strekken zich uit van de min tot de max. n = 10 cellen per conditie van één representatief experiment (van drie). Individuele waarden worden weergegeven als punten. Schaalbalk: 10 μm. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 voor elke aangegeven voorwaarde in (A) de voorwaarde "AURKA-mTurquoise2" in (B) en tegen elke aangegeven voorwaarde in (C). NS: niet significant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells at JoVE.com

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

De activering van de multifunctionele Ser/Thr kinase AURKA wordt gekenmerkt door zijn autofosforylering op Thr288. Fluorescerende sondes die op FRET vertrouwen, kunnen onderscheid maken tussen de inactieve en geactiveerde toestanden. Hier illustreren we enkele strategieën voor sonde-engineering, samen met een snel FRET-protocol om de kinase-activering tijdens mitose te volgen.

Real-Time Monitoring van Aurora kinase A Activatie met behulp van Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

De combinatie van QD-FRET en Microfluidics aan DNA Nanocomplex zelf-assemblage Monitor in Real-Time

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Real-time monitoring van ligand-receptor interacties met Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET microscopie voor Real-time monitoring van Signalering Evenementen in levende cellen met behulp Unimoleculaire Biosensoren

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonoom Bioluminescente zoogdiercellen voor continue en real-time monitoring van de cytotoxiciteit

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Detectie van intracellulaire genexpressie in levende cellen van muizen, de mens en Porcine Origin Met behulp van fluorescentie-gelabelde Nanodeeltjes

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G Protein-selectieve GPCR Conformaties gemeten met behulp van FRET sensoren in een Live Cell Suspension Fluorometer Assay

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...